P75ntr神经营养因子结合蛋白的治疗性用途
【专利摘要】本发明涉及一种用于治疗疼痛和/或疼痛症状的p75NTR神经营养因子结合蛋白p75NTR(NBP)。
【专利说明】P75NTR神经营养因子结合蛋白的治疗性用途
[0001] 发明背景
[0002] 神经营养因子、神经营养生长因子（NGF)、脑衍生神经营养因子（BDNF)、神经营养 因子3(NT-3)和神经营养因子4/5(NT-4/5)通过4种受体：低亲和力p75神经营养受体 (P75NTR)和高亲和力酪氨酸激酶受体TrkA、TrkB和TrkC发挥作用。低亲和力受体p75NTR 结合并且被全部4种神经营养因子激活并且已经报道独立于其他受体发挥作用。但是，更 选择性地激活Trk受体，S卩，NGF是TrkA的选择性配体，BDNF是TrkB的选择性配体，并且 NT-3、4/5是TrkC的选择性配体。此外已经报道，当p75NTR蛋白和Trk蛋白共表达时，它 们形成改变两种受体的信号传导的复合物（Huang和Reichardt，2003)。实际上，已经提出 P75NTR促进每种神经营养因子对其相应Trk受体的选择性。
[0003]p75NTR是肿瘤坏死因子受体超家族（TNFR-SF)的成员并且是这个超家族中充分 表征的第一个成员。这个超家族（在人类中由大约30个基因编码）由配体结合结构域定 义，所述配体结合结构域由首先在P75NTR中鉴定的40氨基酸半胱氨酸丰富结构域（CRD) 的一个或多个（一般4个）重复序列组成（Johnson等人，1986 ;Radeke等人，1987)。与之 相反，全部TNFR-SF家族成员的胞内结构域不共有序列基序。因此，TNFR-SF蛋白的信号传 导机制大幅度变动。
[0004]p75NTR结构的不寻常特征是存在借助跨膜结构域内部的半胱氨酰残基形成的二 硫键连接的P75NTR二聚体。这个二硫键是p75NTR进行有效神经营养因子依赖性信号传导 所需要的并且在胞内和胞外结构域的形成中发挥重要作用（Vilar等人，2009b)。神经营养 因子在生理学上作为非共价缔合的二聚体存（Bothwell和Shooter，1977)，分布半寿期为 大约5分钟（Tria等人，1994)。神经营养因子依赖性p75NTR激活神经营养因子二聚体与 P75NTR二聚体的两个胞外结构域的CRD2-4缔合（He和Garcia，2004)。最近的研究支持 一种模型，其中神经营养因子结合造成P75NTR二聚体的两个胞外结构域移动靠得更近，迫 使胞内结构域以该二硫键为中心的蜗牛钳样运动展开并允许胞内结构域与信号传导衔接 头蛋白NRIF和TRAF6缔合（Vilar等人，2009a，2009b)。先前尚未在其他TNFR-SF家族成 员中或任何其他膜蛋白中描述跨膜结构域内二硫键，如P75NTR中存在的那些。
[0005]P75NTR以类似于缺刻（Notch)和β-淀粉样前体蛋白的切割赖性信号传导途径的 方式依次接受α-分泌酶活性和Υ-分泌酶活性和基质金属蛋白酶（MMP)的蛋白酶剪切， 释放其胞内结构域（ICD)至细胞质中（Jung等人，2003fanning等人，2003)。p75NTRICD 通过这条途径的胞质释放促进相关NRIF的信号传导（Kenchappa等人，2006)。在α-分泌 酶活性和Y-分泌酶活性和MMP的蛋白酶剪切后，P75NTR胞外结构域的作用未充分理解。
[0006] 已经记录，NGF和其他神经营养因子（BDNF、ΝΤ-3和ΝΤ-4/5)在病变例如因骨关 节炎、胰腺炎、类风湿性关节炎、银屑病、搔痒症和多发性硬化所致的疼痛中发挥重要作用 (Watanabe等人，2010;Raychaudhuri等人，2011;Barthel等人，2009;Truzzi等人，2011; McDonald等人，2011 ;Yamaoka等人，2007)。证实针对任何神经营养因子；NGF或BDNF、NT-3 和NT-4/5的选择性抗体显著地减少疼痛。另外，还已经证实针对神经营养因子受体p75NTR TrkA、TrkB或TrkC的抗体在疼痛模型中有效（OritaS等人，2010;SvenssonP等人， 2010;Iwakura等人，2010;Cirilio等人，2010;Pezet等人，2010;Hayashi等人，2011;Chu等人，2011;Ueda等人，2010;Ghilardi等人，2010;Fukui等人，2010)。Fukui等人，（2010) 在一个疼痛模型中（坐骨神经挤压后的机械性异常疼痛）用抗P75NTR抗体治疗后展示疼 痛相关性终点方面的显著功效。从这项研究得出结论，用P75NTR抑制性抗体治疗减少CGRP 和P75NTR表达，导致显著减少疼痛。
[0007] 本发明展示，外源的或从细胞膜切下后内源的P75NTR胞外结构域充当每种神经 营养因子NGF、BDNF、NT-3和NT-4/5的神经营养因子结合蛋白或可溶性受体并且在神经营 养因子的功能、生理学和功能稳态方面发挥显著作用。另外，我们描述了P75NTR胞外结构 域例如在静态异常性疼痛和热性痛觉过敏的模型中用于调节或抵消神经营养因子（包括 NGF、BDNF、NT-3和NT4/5)的病理作用的用途。因此，p75NTR神经营养因子结合蛋白可用 于治疗疼痛和其他神经营养因子相关性疾病，如银屑病、湿疹、类风湿性关节炎、膀胱炎、子 宫内膜异位症和骨关节炎。
[0008] 发明概述
[0009]根据本发明的第一方面，提供P75NTR神经营养因子结合蛋白（NBP)，用于治疗 疼痛或用于预防和/或治疗疼痛和/或疼痛症状或用于缓解、控制、减少疼痛和/或疼痛 症状的发生率或延迟延迟其形成或进展。根据本发明第二方面，提供根据第一方面使用 的P75NTR神经营养因子结合蛋白，其中p75NTR(NBP)包含与一个或多个辅助分子连接的 p75NTR(NBP)。优选地，p75NTR(NBP)通过一个或多个接头与一个或多个辅助分子连接。 根据本发明的第三方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子编码根据第一或第二方面的 p75NTR(NBP)或与p75NTR(NBP)的一个或多个辅助分子连接的p75NTR(NBP)，该核酸分子还 可以包括编码信号序列。还提供该核酸分子用于治疗疼痛的用途。根据本发明的第四方 面，提供一种用于转染细胞的可复制表达载体，所述载体包含第三方面的核酸分子，优选地 该载体是病毒载体。还提供该载体用于治疗疼痛的用途。根据本发明的第五方面，提供一 种携带第三方面或第四方面的核酸分子的宿主细胞。根据本发明的第六方面，提供根据第 一或第二方面或其优选实施方案使用的P75NTR(NBP)，或根据第三方面和第四方面使用的 核酸或载体，其中P75NTR(NBP)或核酸分子或载体在组合下与第二药理活性化合物组合时 分别、依次或同时使用。
[0010] 附图简述
[0011] 图1.P75NTR胞外结构域序列，神经营养因子结合结构域以粗体突出显示。
[0012] 图2.p75NBPP肽标准片段和显示人血浆中p75NTR(NBP) -NGF复合物的 p75NTR(NBP)和NGF免疫共沉淀。
[0013] 图3.串联质谱（MS/MS)测序证实图2中显示的WADAECEEIPGR(SEQIDNO. 7)峰。
[0014] 图4p75NTR(NBP)抑制在表达TrkA的U20S细胞系中和在共表达TrkA和p75NTR 的U20S细胞系中的NGF功能。
[0015] 图5.可溶性p75NTR(NBP)抑制在表达TrkA的U20S细胞系中和在共表达TrkA和 P75NTR的U20S细胞系中的BDNF功能。
[0016] 图6.表明p75NTR(NBP)与BDNF结合以及抗BDNF和p75NTR(NBP)之间竞争的 Biocore数据
[0017] 图7.p75NTR(NBP)抑制PC12细胞中的NGF活性
[0018] 图8.神经营养因子结合蛋白P75NTR(NBP)在神经兴奋性模型中抑制BDNF疼痛效 果
[0019] 图9.神经营养因子结合蛋白P75NTR(NBP)在UVIH模型中抑制痛觉过敏
[0020] 图KXSEQIDNO. 1人p75NTR完整氨基酸序列
[0021] 图11.SEQIDNO. 2包含信号序列的人p75NTR胞外结构域
[0022] 图12.SEQIDNO. 3不含信号序列的人p75NTR胞外结构域
[0023] 图13. SEQIDNO. 4人p75NTR(NBP)神经营养因子结合结构域1
[0024] 图14. SEQIDNO. 5人p75NTR(NBP)神经营养因子结合结构域2
[0025] 图15. SEQIDNO. 6人p75NTR(NBP)神经营养因子结合结构域3
[0026] 图16. SEQIDNO. 7人p75NTR(NBP)神经营养因子结合结构域4
[0027] 图17. SEQIDNO. 8人p75NTR(NBP)神经营养因子结合结构域5
[0028] 图18.SEQIDNO. 9人转铁蛋白
[0029]图 19.SEQIDNO. 10 人白蛋白
[0030] 图 20. SEQIDNO. 11 人FcIgGl
[0031] 图 21. SEQIDNO. 12 人FcIgG2
[0032] 图 22. SEQIDNO. 13 人FeIgG3
[0033] 图 23. SEQIDNO. 14 人FeIgG4
[0034] 图24.SEQIDNO. 15经工程化以延长血清半寿期的人Fe片段
[0035] 图25.SEQIDNO. 16经工程化缺少效应子功能的人Fe片段
[0036] 图 26.SEQIDNO. 17p75NTR(NBP)-Fc接头
[0037] 图 27:SEQIDNo.I8P75NTR(NBP)-Fc接头
[0038] 图 28:SEQIDNO. 19p75NTR(NBP)-Fe接头
[0039] 发明详述
[0040]-根据本发明的第一方面，提供P75NTR神经营养因子结合蛋白（p75NTR(NBP))，用 于治疗疼痛或用于预防和/或治疗疼痛和/或疼痛症状的用途或用于缓解、控制、减少疼痛 和/或疼痛症状的发生率或延迟延迟其形成或进展的用途。优选地，P75NTR神经营养因子 结合蛋白P75NTR(NBP)是聚乙二醇化的，进一步优选地它是糖基化的。
[0041]p75NTR神经营养因子结合蛋白p75NTR(NBP)优选地包含p75NTR(NBP)包含以下一 者或多者：神经营养因子结合结构域1[SEQIDNO. 4]、2[SEQIDNO. 5]、3[SEQIDNO. 6]、 4[SEQIDNO. 7]或5[SEQIDNO. 8]。进一步优选地，p75NTR(NBP)包含（b)以下每一者： 神经营养因子结合结构域1[SEQIDN0.4]、2[SEQIDN0.5]、4[SEQIDN0.7]和5[SEQID NO. 8]或者（c)以下每一者：神经营养因子结合结构域I[SEQIDNO. 4]、3[SEQIDNO. 6]、 4[SEQIDNO. 7]和5[SEQIDNO. 8]。进一步优选地，p75NTR(NBP)包含胞外结构域2[SEQ IDNO. 3]或其包含以上（a)、（b)或（c)的部分。进一步优选地，p75NTR(NBP)包含胞外结 构域1[SEQIDNO. 2]或其包含以上（a)、（b)或（c)的部分。
[0042] 优选地，p75NTR(NBP)与神经营养因子NGF、NT3、BDNF和NT4/5每一者、优选地与 人NGF、NT3、BDNF和NT4/5结合。进一步优选地，p75NTR(NBP)与神经营养因子NGF、NT3、 BDNF和NT4/5每一者、优选地与人NGF、NT3、BDNF和NT4/5结合，优选地以与天然完整序列 p75NTR[SEQIDNO. 1]等同或相同的结合常数结合。可以使用本文所述的测定法确定结合 常数，如通过使用表面等离子体共振在20°C确定，天然蛋白结合常数的测定法是已知并且 包括本领域已知的基于细胞的测定法。优选地，p75NTR(NBP)保护一种或多种前述神经营 养因子免于在体外或体内的血浆或其他体液中降解，和/或与其生物学游离形式相比，维 持一种或多种前述神经营养因子的体内稳态平衡。
[0043] 本发明的p75NTR(NBP)优选地与NGF、BDNF、NT3或NT4/5的任一者或多者以约 0.1nM至约50nM之间的结合亲和力（Kd)结合。在一些优选的实施方案中，结合亲和力 (Kd)在约 0·InM和约 0· 2ηΜ、0· 5ηΜ、1ηΜ、1· 5ηΜ、2ηΜ、2· 5ηΜ、3ηΜ、3· 5ηΜ、4ηΜ、4· 5nM、5nM、 5. 5ηΜ、6ηΜ、6. 5ηΜ、7ηΜ、7. 5ηΜ、8ηΜ、8. 5ηΜ、9ηΜ、9. 5ηΜ、10ηΜ、15ηΜ、20ηΜ、25ηΜ、30ηΜ、35ηΜ、 40ηΜ、45ηΜ或50ηΜ的任一者之间，如针对NGF、BDNF、ΝΤ3或ΝΤ4/5的体外结合测定法中如 本文所述那样测量，优选地如通过表面等离子体共振在20°C所测量。在一些其他的优选实 施方案中，结合亲和力（Kd)是或小于约 250pM、300pM、350pM、400pM、450pM、500pM、550pM、 600pM、650pM、700pM、750pM、800pM、850pM、950pM或InM的任一者，如采用神经营养因子在 p75NTR(NBP)的体外结合测定法中如本文所述那样测量，优选地如通过表面等离子体共振 在20°C所测量。在又一个更优选的实施方案中，结合亲和力（Kd)是约0· 3nM或约InM，如 采用神经营养因子在P75NTR(NBP)的体外结合测定法中如本文所述那样测量，优选地如通 过表面等离子体共振在20°C所测量。
[0044] 进一步优选地，p75NTR(NBP)实现前述神经营养因子NGF、BDNF、NT3或NT4/5的功 能活性（定义为调节或者上调或下调神经营养因子的功能活性），例如，前述神经营养因子 因其与它们的相应受体相互作用而产生的功能活。
[0045] 优选地，p75NTR(NBP)实现BDNF的功能活性，如通过以下任一者的功能测定法所 评估：神经元和突触的生长和分化、神经元细胞培养中的存活和分化、Trk信号传导、体外 或体内刺激轴突增生。
[0046] 优选地，p75NTR(NBP)实现NGF的功能活性，如通过测量NGF与TrkA结合和TrkA 激活所评估，如经典神经元存活测定法（如在Cowan,W.M.，Hamburger,V.，Levi-Montalcin 1, R. Annu. Rev. Neurosci(神经科学年评）· 2001 ;24:551-600 中提供）中所展示。
[0047] 优选地，p75NTR(NBP)实现NGF的功能活性，如通过测量NT3与内源性Trk受体结 合和内源性Trk受体活性激活所评估，如在Trk受体磷酸化、促分裂原活化蛋白激酶磷酸化 报道分子测定法或细胞存活和神经突延展测定法中所展示。
[0048] 优选地p75NTR(NBP)实现NT4/5的功能活性，如通过测量NT4/5体外或体内磷酸 化和激活测定法所评估，例如，在中的髓鞘质碱性蛋白（MBP)磷酸化测定法或可选地在体 内在血管内皮生长因子（VEGF)/碱性成纤维细胞生长因子诱导血管生成的基质胶血管生 成测定法中所评估。
[0049] 优选地，p75NTR(NBP)与神经营养因子NGF、NT3、BDNF和NT4/5中一者或多者的接 触残基结合，如He和Garcia(2001)Science(科学），301，第870-805页中所显示。
[0050] 优选地，p75NTR(NBP)是可溶性的，优选地可溶于水溶液中，优选地可溶于生物流 体如血清、血浆、血液中。
[0051]-根据本发明第二方面，提供根据第一方面使用的P75NTR(NBP)，其中 P75NTR(NBP)包含与一个或多个辅助分子连接的p75NTR(NBP)，优选地第一方面的 p75NTR(NBP)。优选地，p75NTR(NBP)通过一个或多个接头与一个或多个辅助分子连接。
[0052] 优选地，一个或多个辅助分子选自；(a)转铁蛋白或其部分，转铁蛋白优选地是人 转铁蛋白，优选地是SEQIDNO. 9,（b)白蛋白或其部分，白蛋白优选地是人白蛋白，优选地 是SEQ.SEQIDNO. 10,（c)免疫球蛋白Fc或其部分，免疫球蛋白Fc优选地是人免疫球蛋白 Fe，（d)聚乙烯二醇聚合物链，（e)糖链。
[0053] 如本文所用，术语"免疫球蛋白Fc"或"IgFc"理解为意指免疫球蛋白链恒定区 的羧基端部分，优选地免疫球蛋白重链恒定区的羧基端部分，或其部分。优选地，免疫球蛋 白Fc包含I)CHl域、CH2域和CH3域，任选地连同免疫球蛋白铰链区，2)CHl域和CH2域，任 选地连同免疫球蛋白铰链区，3)CHl域和CH3域，任选地连同免疫球蛋白铰链区，4)CH2域和 CH3域，任选地连同免疫球蛋白铰链区或5)选自CHl、CH2和CH3的两个或更多个结构域的 组合，任选地与免疫球蛋白铰链区组合。优选地，免疫球蛋白Fc至少包含免疫球蛋白铰链 区、CH2域和CH3域，和任选地CHl域。优选地，免疫球蛋白Fc包含具有以下同种型的免疫 球蛋白的Fc或Fc部分或由其组成,所述选自选自IgG、IgM、IgA、IgD、IgE,进一步优选地 选自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、slgA，更优选地选自IgG2或IgG4,最优选地选自 IgG2。任选地，免疫球蛋白Fe还包含了起到使补体固定或抗体依赖性细胞毒性最小化或改 善与Fe受体结合的亲和力的氨基酸突变、缺失、置换或化学修饰。
[0054] 进一步优选地，免疫球蛋白Fe包含以下任一者或由其组成：(a)CH2域或其部分和 CH3域或其部分，（b)CH2域或其部分，或（c)CH3域或其部分，其中免疫球蛋白Fe或其部分 具有选自IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，进一步优选地IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、slgA， 更优选地IgG2或IgG4,最优选地IgG2的同种型。
[0055] 优选地，免疫球蛋白Fe包含免疫球蛋白重链的羧基末端区域或由其组成，并且可 以包含来自IgG、IgA或IgD抗体同种型的CH2域和/或CH3域或其部分，或来自IgM或IgE 的CH2域和/或CH3域和/或CH4域或其部分。优选地，免疫球蛋白Fe包含Fe片段或由其 组成，所述Fe片主要段包含CH3和小部分的CH2,如通过胃蛋白酶消化免疫球蛋白可衍生。 优选地，免疫球蛋白Fe包含完整Fe区或由其组成，所述完整Fe区包含CH2和CH3,额外地 与铰链区连接，所述铰链区是在完整免疫球蛋白中连接CHl区和CH2区的重链短片段，如 可以通过木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白产生。优选地，免疫球蛋白铰链区包含铰链区或铰链 区部分或由其组成，所述铰链区或铰链区部分源自IgG、优选地人IgG，更优选地选自IgGU IgG2、IgG3,或IgG4,最优选地IgGL或可选地是前述铰链区实施方案的物种变体或等位变 体。所述铰链区或免疫球蛋白铰链区的部分可以位于Fe区的C或的N末端处，优选地在N 末端处。
[0056] 根据本发明的一个优选实施方案，免疫球蛋白Fe优选地包含免疫球蛋白的Fe或 Fe部分或由其组成，所述免疫球蛋白在CH2区中包含野生型序列的减少Fe效应子功能的一 个或多个氨基酸突变。优选地，这些突变是A330、P331至S330、S331 (氨基酸编号相对于野 生型IgG2序列，其中CH2区域处于人重链IgG2恒定区中[Eur.J.Immunol(欧洲免疫学杂 志）.（1999)29:2613-2624]。优选地，免疫球蛋白Fe是糖基化并且在生理pH高度带电荷， 因此有助于增溶P75NTR(NBP)。Fe区还允许通过抗FcELISA检测p75NTR(NBP)，例如出于诊 断目的。本发明的p75NTR(NBP)优选地在优选地于正常糖基化位点处使IgFe糖基化的细 胞中合成。
[0057] 优选地，免疫球蛋白Fe包含具有选自以下氨基酸序列的人免疫球蛋白Fe区或由 其组成：SEQIDNo. 11、12、13、14、15或16或其物种变体或等位变体，或源自SEQIDN0.11、 12、13、14、15或16的CH2域和或CH3域或其部分。
[0058] 根据本发明，与一个或多个辅助分子连接的p75NTR(NBP)优选地展示出有利生物 学特性：改善的p75NTR(NBP)溶解度和/或p75NTR(NBP)稳定性和/或改善的p75NTR(NBP) 血清半寿期。改善的溶解度是合乎需要的，旨在p75NTR(NBP)的生物利用率在施用时最大 化并且可以确定并实施p75NTR(NBP)的精确剂量。改善的溶解度有利于克服聚集物问题， 所述聚集物是不想要的，在体内递送时造成疼痛并且导致潜能炎症。改善的血清半寿期具 有以下优点：促进在治疗使用期间为实现递送的P75NTR(NBP)的等同治疗作用或维持治疗 作用所要求的剂量水平减少或给药频率减少。在血液或血清中延长的半寿期和更高的稳定 性具有如下优点：允许较少频率给药和/或较低给药水平的剂量方案，因此减少体内潜在 毒性或副作用。在这种情况下，p75NTR(NBP)在其治疗作用方面更强有力在和/或在循环 中更稳定。所得的较低或较少给药频率在最小化与P75NTR(NBP)施用可能相关的任何潜在 毒性作用或副作用方面是有利的。与一个或多个辅助分子连接的P75NTR(NBP)的分子量还 增加超过单独的P75NTR(NBP)，这具有如下优点：当静脉内施用时，该分子将充分留在血液 循环中，从而降低渗透至非目的部位（例如中枢神经系统）的风险，并且产生适于在靶向的 组织中停留或浓缩的分子。
[0059] 优选地，与没有如此连接的p75NTR(NBP)相比，与一个或多个辅助分子连接的 p75NTR(NBP)展示改善的p75NTR(NBP)溶解度和/或改善的p75NTR(NBP)稳定性和/或改 善的血清半寿期。优选地，改善的溶解度是在水溶液（如水）中的、优选地含有赋形剂如缓 冲剂和/或盐、优选地在生理pH、优选地在pH5至pH8之间、优选地在约pH7时的溶解度， 或是在生物流体如血清或血液中的溶解度。优选地，改善的稳定性是在一段时间范围内、在 一个储存时间期间或在冷冻和融化后P75NTR(NBP)蛋白的活性或结构完整性归咎于变性、 氧化、片段化或聚集效应所致的稳定性。结构稳定性可以由变性、氧化、团集或聚集的标准 计量判定，可以通过本文中公开的结合测定法或功能测定法测量活性的稳定性，测量蛋白 质血清半寿期的方法是已知的。
[0060] 优选地，与一个或多个辅助分子连接的P75NTR(NBP)可以从多种哺乳动物宿主细 胞以高水平表达以提供单一种类并且可以有效地通过亲和层析纯化，例如通过与金黄色葡 萄球菌（Staphylococcusaureus)蛋白A结合来纯化。优选地，与一个或多个辅助分子连 接的P75NTR(NBP)可以二聚化，并且优选地，与没有如此连接的p75NTR(NBP)相比，二聚体 针对神经营养因子NGF、BDNF、NT3或NT4/5具有增加的亲和力。更紧密的结合具有更高效 力和更高治疗功效的优点，如通过P75NTR(NBP)效果所判定，例如，如通过本文中公开的神 经营养因子功能测定法所测定。更高的效力具有如下益处：p75NTR(NBP)可以按较低剂量 使用以实现相同的治疗功效，因此减少体内潜在毒性或副作用。
[0061] 优选地，本发明的p75NTR(NBP)具有约或大于以下任一者的体内半寿期：2、4、6、 8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、 60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、 108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、 146、148、150、152、154、156、158、160、62、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208 或 210 小时 +/-1 小时，本发明 的P75NTR(NBP)进一步优选地具有约或大于24小时的体内半寿期。
[0062] 本发明的p75NTR(NBP)进一步优选地具有约或大于以下任一者的体外半寿期：2、 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、 56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、 104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、 142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、62、164、166、168、170、172、174、176、178、 180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208 或210日+/-1日，本 发明的P75NTR(NBP)进一步优选地具有约或大于6日的体外半寿期。优选地在约生理pH、 在缓冲的水溶液，优选地在20°C或37°C测量稳定性。
[0063] 根据前述优选实施方案，体内半寿期优选地是在大鼠中的半寿期或在人类中的半 寿期，更优选地是在人类中的半寿期。优选地，在体内施用例如通过静脉内或皮下注射后从 本发明P75NTR(NBP)的血清测量水平确定半寿期。
[0064]-另外根据本发明的第二方面，接头优选地选自：(a)共价键、(b)非共价键、（C)肽 键、（d)构成肽的一个氨基酸或多个氨基酸。优选地，p75NTR(NBP)与多于一个辅助分子连 接，任选地每个辅助分子是相同或不同的或是相同者和不同者的混合物。进一步优选地，多 于一种辅助分子包含经接头与P75NTR(NBP)连接的辅助分子多聚体或多个辅助分子，并且 其中每个分子可以是相同或不同的或相同者和不同者的混合物。
[0065] 优选地，接头包含一个或多个氨基酸或由其组成或包含具有如下个氨基酸的多肽 序列或由其组成：优选地约1至约25个氨基酸、优选地1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸的 任意个氨基酸、进一步优选地10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基 酸的任意个氨基酸，最优选地13个氨基酸。
[0066] 优选地，接头包含缺少任何稳定二级结构如α螺旋、β链、31(|螺旋和pi螺旋、多 聚脯氨酸螺旋、α折叠的多个氨基酸的多肽序列或由其组成。优选地，接头区域包含限定 柔性或动态或非结构化多肽如柔性环、随机卷曲或柔性转角的多个氨基酸的多肽序列或由 其组成，经常发现这类非结构化多肽存连接大蛋白质分子中的二级结构区域。
[0067] 优选地，接头是如下氨基酸的多肽序列，所述氨基酸构成p75NTR(NBP)中大于或 约50 %的甘氨酸和/或丙氨酸和/或丝氨酸，进一步优选地构成p75NTR(NBP)中大于或 约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的甘氨酸和/或丙氨酸和 /或丝氨酸。接头区域优选地包含如下氨基酸的多肽序列或由其组成，所述氨基酸包含甘 氨酸和丝氨酸二者，优选地甘氨酸比例大于丝氨酸，接头区域优选地包含柔性接头SEQID NO. 17 (GGGGS)n(n= 1 至 4)或螺旋接头SEQIDNO. 18 (EAAAK)η(η= 2 至 5)或优势包含下 述氨基酸残基的多肽接头或者由其组成，其中所述氨基酸残基选自每种氨基酸1至10次重 复及其任意组合的甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。
[0068] 优选地，接头克服或防止来自辅助分子的空间位阻，其中与不与辅助分子连接的 P75NTR(NBP)相比时，所述空间位阻可能干扰p75NTR(NBP)的前述神经营养因子结合能力 或生物活性。因此，接头区域优选地允许P75NTR(NBP)和辅助分子之间的灵活性并且与没 有如此连接的游离或天然P75NTR(NBP)相比，允许保留或改善p75NTR(NBP)的前述生物活 性，如使用如本文所述的结合测定法通过与神经营养因子的结合所测定。
[0069] 进一步优选地，接头是免疫上惰性的，从而它不触发补体介导的溶解，不刺激抗体 依赖的细胞介导细胞毒性（ADCC)，不活化小胶质细胞或T细胞。优选地，接头区域在这些活 性的一种或多种活性方面减弱。
[0070] 进一步优选地，接头包含从结构分析或结构预测中已知或预测为柔性或动态或非 结构化多肽或缺少稳定二级结构的多肽或由其组成。
[0071] 最优选地，接头包含序列SEQIDNO. 19 (GGGGS)的多肽或由其组成。
[0072] 本发明的p75NTR(NBP)还可以包含蛋白酶剪切位点，其任选地间插于 p75NTR(NBP)和辅助分子之间。该蛋白酶剪切位点可以位于接头中或接头与p75NTR(NBP) 或/和辅助分子的交界处。P75NTR(NBP)可以任选地在配制和或为治疗目的施用之前被切 割离开辅助分子。
[0073] 优选地，接头和/或一个或多个辅助分子不损害或不明显损害p75NTR(NBP):
[0074] (a)对神经营养因子NGF、BDNF、NT3或NT4/5的功能活性的影响（定义为调节或 上调或下调神经营养因子的功能活性），
[0075] (b)针对NGF、BDNF、NT3或NT4/5中任一者的结合亲和力，结合亲和力在约0·InM 至约50nM之间，
[0076] (c)与神经营养因子NGF、NT3、BDNF和NT4/5每一者、优选地与人NGF、NT3、BDNF 和NT4/5结合的能力。
[0077] 根据本发明第一和第二方面的一个优选实施方案，提供本发明的P75NTR(NBP)用 于治疗疼痛，其中p75NTR(NBP)由以下组成：(A)具有序列SEQIDNO. 3的p75NTR(NBP)，和 任选地（B)免疫球蛋白Fc，并且进一步任选地由序列SEQIDNO. 11和任选地（C)接头组 成，任选地由SEQIDNO. 19组成。
[0078]-根据本发明的第三方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子编码根据第一或第二 方面的p75NTR(NBP)或与p75NTR(NBP)的一个或多个辅助分子连接的p75NTR(NBP)。优选 地，该核酸分子用于治疗疼痛。
[0079] 根据本发明的一个优选实施方案，该核酸分子还可以包含编码信号序列，优选地 P75NTR信号序列的区域，例如DNA或RNA序列。
[0080]-根据本发明的第四方面，提供一种用于转染细胞的可复制表达载体，所述载体包 含第三方面的核酸分子，优选地该载体是病毒载体。优选地，该载体用于治疗疼痛。
[0081]-进一步根据本发明的第三或第四方面，提供一种表达本发明的核酸分子或载 体以产生或分泌p75NTR(NBP)或与一个或多个辅助分子连接的p75NTR(NBP)的方法。优 选地，该方法包括将核酸分子或载体引入细胞并且在其中表达所述核酸以产生或分泌 P75NTR(NBP)或与一个或多个辅助分子连接的p75NTR(NBP)。优选地，将核酸分子或载体 在体外引入细胞中，可选地在体内引入。优选地，将表达的p75NTR(NBP)或与一个或多个 辅助分子连接的P75NTR(NBP)在体外表达，任选地进一步分离并纯化，可选地，将表达的 p75NTR(NBP)或与一个或多个辅助分子连接的p75NTR(NBP)优选地在体内表达，在体内表 达优选地构成基因治疗。优选地，载体是可复制表达载体，任选地用于转染哺乳动物细胞， 优选地，载体是病毒载体。
[0082]-根据本发明的第五方面提供一种携带第三方面或第四方面的核酸分子或载体的 宿主细胞，优选地，细胞是哺乳动物细胞。
[0083]-根据本发明的第六方面，提供根据第一或第二方面或其优选实施方案使用的 P75NTR(NBP)，或根据第三方面和第四方面使用的核酸或载体，其中疼痛或疼痛症状选自： [0084] (a)急性疼痛和/或自发性疼痛，
[0085] (b)慢性疼痛和或持续性疼痛，
[0086] (C)炎性疼痛，其包括以下任一种：关节炎疼痛、因骨关节炎或类风湿性关节炎产 生的疼痛、因炎性肠病、银屑病和湿疹产生的疼痛，
[0087] (d)伤害性疼痛，
[0088] (e)神经性疼痛，其包括痛性糖尿病神经病变或与疱疹后神经痛相关的疼痛，
[0089] (f)痛觉过敏，
[0090] (g)异常性疼痛，
[0091] (h)中枢性疼痛，中枢性中风后疼痛、因多发性硬化产生的疼痛、因脊髓损伤产生 的疼痛或因帕金森病或癫痫产生的疼痛，
[0092] (i)癌症疼痛，
[0093] (j)术后疼痛，
[0094] (k)内脏疼痛，其包括消化道内脏疼痛和非消化道内脏疼痛，因胃肠道（GI)紊乱 所致的疼痛、因功能性肠病症（FBD)产生的疼痛、因炎性肠病（IBD)产生的疼痛、因痛经、盆 腔疼痛、膀胱炎、间质性膀胱炎或胰腺炎产生的疼痛，
[0095] (1)肌肉-骨骼疼痛，肌痛、纤维肌痛、脊柱炎、血清阴性（非类风湿性）关节病、非 关节风湿病、抗肌萎缩蛋白病、糖原分解、多发性肌炎、化脓性肌炎，
[0096] (m)心脏或血管疼痛，因心绞痛（angina)、心肌梗死、二尖瓣狭窄、心包炎、雷诺氏 现象、硬皮病（scleredoma)、硬皮病或骨豁肌局部缺血所致的疼痛，
[0097] (η)头部疼痛，其包括偏头痛，有先兆偏头痛、无先兆偏头痛、丛集性头痛、紧张型 头痛。
[0098] (〇)口面疼痛，其包括牙疼痛、颞颚肌筋膜疼痛或耳鸣，或
[0099] (P)背痛、滑囊炎（menstrual pain)、月经疼痛、偏头痛、牵涉痛、三叉神经痛、超敏 (hypersensitisation)、因脊柱创伤和/或变性或脑卒中产生的疼痛。
[0100] 根据本发明的第七方面，提供根据第一或第二方面或其优选实施方案使用的 P75NTR (NBP)，或根据第三方面和第四方面使用的核酸分子或载体，其中p75NTR (NBP)或核 酸分子或载体在组合下与第二药理活性化合物组合时分别、依次或同时使用。优选地，组合 的第二药理活性化合物选自：
[0101] ?阿片类镇痛药，例如吗啡（morphine)、海洛因（heroin)、氢吗啡酮 (hydromorphone)、轻吗啡酮（oxymorphone)、左啡诺（Ievorphanol)、左洛啡烧 (Ievallorphan)、美沙酮（methadone)、哌替陡（meperidine)、芬太尼（fentanyl)、可卡 因（cocaine)、可待因（codeine)、双氢可待因（dihydrocodeine)、轻考酮（oxycodone)、 氢可酮（hydrocodone)、右丙氧芬（propoxyphene)、纳美芬（nalmefene)、烯丙吗啡 (nalorphine)、纳洛酮（naloxone)、纳曲酮（naltrexone)、丁丙诺啡（buprenorphine)、布 托啡诺（butorphanol)、纳布啡（nalbuphine)或喷他佐辛（pentazocine);
[0102] ?非甾体抗炎药（NSAID)，例如阿司匹林、双氯芬酸（diclofenac)、二氟尼柳 (diflusinal)、依托度酸（etodolac)、芬布芬（fenbufen)、非诺洛芬（fenoprofen)、 氟苯柳（flufenisal)、氟比洛芬（flurbiprofen)、布洛芬（ibuprofen)、卩引哚美 辛（indomethacin)、酮基布洛芬（ketoprofen)、酮咯酸（ketorolac)、甲氯芬那 酸（meclofenamicacid)、甲芬那酸（mefenamicacid)、美洛昔康（meloxicam)、蔡 丁美酮（nabumetone)、萘普生（naproxen)、尼美舒利（nimesulide)、硝基氟批洛芬 (nitroflurbiprofen)、奥沙拉秦（olsalazine)、奥沙普秦（oxaprozin)、保泰松、卩比罗昔康 (piroxicam)、柳氮磺卩比陡（sulfasalazine)、舒林酸（sulindac)、托美丁（tolmetin)或佐 美酸（zomepirac)；
[0103]?巴比妥类镇静剂，例如异戊巴比妥（amobarbital)、阿普比妥（aprobarbital)、 仲丁 巴比妥（butabarbital)、布他比妥（butabital)、甲苯比妥（mephobarbital)、美 沙比妥（metharbital)、美索比妥（methohexital)、戊巴比妥（pentobarbital)、苯巴 比妥（phenobartital)、司可巴比妥（secobarbital)、他布比妥（talbutal)、塞米乐 (theamylal)或硫喷妥（thiopental);
[0104]?有镇静作用的苯二氮草（benzodiazepine)，例如氯氮草（chlordiazepoxide)、 氯拉:擧：酸（clorazepate)、地西泮（diazepam)、氟西泮（flurazepam)、劳拉西泮 (Iorazepam)、奥沙西泮（oxazepam)、替马西泮（temazepam)或三唑仑（triazolam);
[0105]?具有镇静剂作用的H1拮抗剂，例如苯海拉明（diphenhydramine)、卩比拉 明（pyrilamine)、异丙嗪（promethazine)、氯苯那敏（chlorpheniramine)或氯环嗪 (chlorcyclizine)；
[0106]?镇静剂，如格鲁米特（glutethimide)、甲丙氨酯（meprobamate)、甲喹酮 (methaqualone)或二氣醒t匕林（dichloralphenazone);
[0107]?骨骼肌松弛药、例如巴氯芬（baclofen)、卡立普多（carisoprodol)、氯唑沙宗 (chlorzoxazone)、环苯扎林（cyclobenzaprine)、美索巴莫（methocarbamol)或邻甲苯海 拉明（orphrenadine)；
[0108] ·NMDA受体拮抗剂，例如右美沙芬（dextromethorphan) ((+) _3_轻-N-甲基吗啡 喃）或其代谢物右啡焼（dextrorphan) ((+)-3-轻-N-甲基吗啡喃）、氯胺酮（ketamine)、 美金刚（memantine)、卩比咯并喹啉奎宁（pyrroloquinolinequinine)、顺-4-(膦酰 甲基）-2-哌啶羧酸、布地品（budipine)、EN-3231 (M〇rpMDeX_，吗啡和右美沙芬 (dextromethorphan)的组合制剂）、托卩比酯（topiramate)、奈拉美生（neramexane)或 培净福太（perzinfotel)，包括NR2B拮抗剂，例如艾芬地尔（ifenprodil)、曲索罗地 (traxoprodil)或（-)-(R)-6-{2-[4_(3-氟苯基）-4_ 轻-1-哌陡基]-1-轻乙基-3, 4-二 氢-2 (IH)-喹啉酮；
[0109] ·α-肾上腺素能药，例如多沙唑嗪（doxazosin)、坦索罗辛（tamsulosin)、可 乐定（clonidine)、胍法辛（guanfacine)、碟美塔托米定（dexmetatomidine)、莫达非 尼（modafinil)、或4-氨基-6, 7-二甲氧基-2-(5-甲烷-磺酰氨基-1，2, 3, 4-四氢异喹 啉-2-基）-5- (2-吡啶基）喹唑啉；
[0110] ?三环抗忧郁药，例如地昔帕明（desipramine)、丙咪嗪（imipramine)、阿米替林 (amitriptyline)或去甲替林（nortriptyline);
[0111] ?抗惊厥药，例如卡马西平、拉莫三嗪（Iamotrigine)、托卩比酯（topiratmate)或丙 戊酸盐（valproate);
[0112] ?速激肽（NK)拮抗齐[J，特别地是NK-3、NK-2或NK-I拮抗齐[J，例如 (aR，9R)-7-[3,5-双（三氟甲基）苄基]_8,9, 10, 11-四氢-9-甲基-5-(4-甲 基苯基）-7Η-[1，4]二氮杂环辛并[2,Ι-g][1，7]_ 萘啶-6-13-二酮（TAK-637)、 5-[[(2R，3S)-2-[(lR)-l-[3,5-双（三氟甲基）苯基]乙氧基-3-(4-氟苯基）-4-吗啉 基]-甲基]-1，2-二氢-3H-1，2, 4-三唑-3-酮（MK-869)、阿瑞吡坦（api*印itant)、拉奈 匹坦（Ianepitant)、达匹坦（dapitant)或3_[[2_甲氧基-5-(三氟甲氧基）苯基]-甲氨 基]-2-苯基哌啶（2S，3S);
[0113] ?毒蕈碱拮抗剂，例如奥昔布宁（oxybutynin)、托特罗定（tolterodine)、丙哌维 林（propiverine)、曲司氯铵（tropsiumchloride)、达非那新（darifenacin)、索利那辛 (solifenacin)、替米维林（temiverine)和异丙托铵（ipratropium);
[0114] ·C0X-2选择性抑制齐[J，例如塞来考昔（celecoxib)、罗非考昔（rofecoxib)、 帕瑞考昔（parecoxib)、伐地考昔（valdecoxib)、地拉考昔（deracoxib)、依托考昔 (etoricoxib)或鲁米考昔（Iumiracoxib)；
[0115] ?煤焦油镇痛药，尤其对乙酰氨基酚（paracetamol);
[0116] ?神经安定药，如氟哌利多（droperidol)、氯丙嗪（chlorpromazine)、氟哌 P定醇（haloperidol)、奋乃静（perphenazine)、硫利达嗪（thioridazine)、美索达嗪 (mesoridazine)、三氟拉嗪（trifluoperazine)、氟奋乃静（fluphenazine)、氯氮平 (clozapine)、奥氮平（olanzapine)、利培酮（risperidone)、齐拉西酮（ziprasidone)、 喹硫平（quetiapine)、舍卩引哚（sertindole)、阿立哌唑（aripiprazole)、索奈哌 唑（sonepiprazole)、布南色林（blonanserin)、伊潘立酮（iloperidone)、哌罗匹隆 (perospirone)、雷氯必利（raclopride)、佐替平（zotepine)、联苯芦诺（bifeprunox)、 阿塞那平（asenapine)、鲁拉西酮（Iurasidone)、氨横必利（amisulpride)、巴拉皮 利酮（balaperidone)、帕林朵（palindore)、依利色林（eplivanserin)、奥沙奈坦 (osanetant)、利莫纳班（rimonabant)、美兰纳坦（meclinertant)、Miraxion?或沙立佐 坦（sarizotan)；
[0117] ?香草素受体（vanilloidreceptor)激动剂（例如树胶脂毒素（resinferatoxin) 或拮抗剂（例如辣椒平（capsazepine));
[0118] ·β-肾上腺素能药如普萘洛尔（propranolol);
[0119] ?局部麻醉药如美西律（mexiletine);
[0120] ?皮质类固醇如地塞米松（dexamethasone);
[0121] · 5-HT受体激动剂或拮抗剂，特别地5-HTIB/ID激动剂如依立曲坦（eletriptan)、 舒马曲坦（sumatriptan)、那拉曲坦（naratriptan)、佐米曲坦（zolmitriptan)或利扎曲坦 (rizatriptan)；
[0122] · 5_HT2A受体拮抗剂如R(+) -α- (2, 3_二甲氧基-苯基）-1- [2_ (4_氟苯乙 基）]-4_ 哌啶甲醇（MDL-100907);
[0123] ?胆碱能（烟碱）镇痛药，如异丙克兰（ispronicline) (TC-1734)、（E)-N-甲 基-4-(3-吡啶基）-3- 丁烯-1-胺（RJR-2403)、（R)-5-(2-吖丁啶基甲氧基）-2-氯吡啶 (ABT-594)或尼古丁；
[0124] ?曲马多（Tramack) IK:):
[0125] ·I3DEV抑制剂（第5型磷酸二酯酶抑制剂），如5-[2-乙氧基-5-(4-甲基-1-哌 嗪基-磺酰基）苯基]-1-甲基-3-正丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4, 3-d]嘧啶-7-酮 (西地那非（sildenafil))、（6R, 12aR)-2, 3, 6, 7, 12, 12a-六氢-2-甲基-6-(3, 4-亚甲二 氧苯基）-吡嗪并[2'，Γ:6, 1]-吡啶并[3,4-b]吲哚-1，4-二酮（IC-351或他达拉非 (tadalafil))、2-[2-乙氧基-5-(4-乙基-哌嗪-1-基-1-磺酰基）-苯基]-5-甲基-7-丙 基-3H-咪唑并[5,Ι-f] [1，2,4]三嗪-4-酮（伐地那非（vardenafil))、5-(5-乙酰基-2-丁 氧基-3-吡啶基）-3-乙基-2-(1-乙基-3-吖丁啶基）-2,6-二氢-7H-吡唑并[4, 3-d] 嘧啶-7-酮、5-(5-乙酰基-2-丙氧基-3-吡啶基）-3-乙基-2-(1-异丙基-3-吖丁啶 基）-2, 6-二氢-7H-吡唑并[4, 3-d]嘧啶-7-酮、5- [2-乙氧基-5- (4-乙基哌嗪-1-基磺酰 基）吡啶-3-基]-3-乙基-2-[2-甲氧乙基]-2,6-二氢-7H-吡唑并[4, 3-d]嘧啶-7-酮、 4_[(3-氯-4-甲氧苄基）氨基]-2-[(2S)-2-(羟甲基）吡咯烷-1-基]-N-(嘧啶-2-基 甲基）嘧啶-5-甲酰胺、3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6, 7-二氢-IH-吡唑并[4, 3-d]嘧 啶-5-基）-N-[2-(1-甲基吡咯烷-2-基）乙基]-4-丙氧基苯磺酰胺；
[0126] ?大麻素（cannabinoid);
[0127] ?促代谢型谷氨酸盐亚型1受体（mGluRl)拮抗剂；
[0128]?血清素再吸收抑制剂，如舍曲林（sertraline)、舍曲林代谢物-去甲基舍曲 林、氟西汀（fluoxetine)、诺氟西汀（norfluoxetine)(氟西汀去甲基代谢物）、氟伏 沙明（fluvoxamine)、帕罗西汀（paroxetine)、西酞普兰（citalopram)、西酞普兰代谢 物-去甲基西酞普兰（desmethylcitalopram)、艾司西酞普兰（escitalopram)、d，l_芬 氟拉明（d,Ι-fenfluramine)、非莫西汀（femoxetine)、伊福西汀（ifoxetine)、氰基度 硫平（。5^110(1〇1：11丨6口；[11)、利托西汀（1；[1：(?61：；[116)、达泊西汀（(13口(《601：；[116)、萘法唑酮 (nefazodone)、西文氯胺（cericlamine)和曲唑酮（trazodone);
[0129] ?去甲肾上腺素（noradrenaline)(去甲肾上腺素（norepinephrine)) 再吸收抑制剂，如马普替林（maprotiline)、洛非帕明（lofepramine)、米氮 平（mirtazepine)、轻丙替林（oxaprotiline)、非唑拉明（fezolamine)、托莫西 汀（tomoxetine)、米安色林（mianserin)、安非他酮（buproprion)、安非他酮代 谢物-轻安非他酮（hydroxybuproprion)、诺米芬辛（nomifensine)和维洛沙秦 (viloxazine) (Vivalan? )、特别地是选择性去甲肾上腺素再吸收抑制剂如瑞波西汀 (reboxetine)、尤其（S，S)_ 瑞波西汀；
[0130]?血清素-去甲肾上腺素再吸收双重抑制剂，如文拉法辛（venlafaxine)、文拉法 辛代谢物〇_去甲基文拉法辛（〇_desmethylvenlafaxine)、氯米帕明（clomipramine)、氯米 帕明代谢物-去甲基氯米帕明（desmethylclomipramine)、度洛西汀（duloxetine)、米那普 仑（miInacipran)和丙咪嗪（imipramine);
[0131] ?诱导型一氧化氮合酶（iNOS)抑制剂，如S-[2_[(l-亚氨乙基）氨基]乙 基]-L-同型半胱氨酸、S-[2-[(l-亚氨乙基）氨基]乙基]-4, 4-二氧代-L-半胱氨 酸、S-[2_[(l-亚氨乙基）氨基]乙基]-2-甲基-L-半胱氨酸、（2S, 5Z)-2_氨基-2-甲 基-7-[(1-亚氨乙基）氨基]-5-庚烯酸、2-[[(IR, 3S)-3-氨基-4-羟-1-(5-噻唑基）丁 基]硫代]-5-氯-3-吡啶甲腈；2-[[ (IR, 3S)-3-氨基-4-羟-I-(5-噻唑基）-丁基]硫 代]-4-氯苯腈、（2S，4R) -2-氨基-4- [ [2-氯-5-(三氟甲基）苯基]硫代]-5-噻唑丁醇、 2_ [[ (IR, 3S) -3-氨基-4-羟-1- (5-噻唑基）丁基]硫代]-6-(三氟甲基）-3-吡啶甲腈、 2_ [[ (IR, 3S) -3-氨基-4-羟-1- (5-噻唑基）丁基]硫代]-5-氯苯腈、N- [4- [2- (3-氯苄 氨基）乙基]苯基]噻吩-2-甲脒或胍基乙基二硫醚；
[0132] ?乙酰胆碱酯酶抑制剂，如多奈哌齐（donepezil);
[0133] ?前列腺素E2亚型4(EP4)拮抗剂，如N-[({2-[4_(2-乙基-4, 6-二甲 基-IH-咪唑并[4, 5-c]吡啶-1-基）苯基]乙基}氨基）-羰基]-4-甲基苯磺酰胺或 4-[(IS) _1_( {[5-氯-2-(3-氟苯氧基）批陡-3-基]羰基}氨基）乙基]苯甲酸；
[0134] ?白三烯M拮抗剂；如1-(3-联苯基-4-基甲基-4-羟-苯并二氢吡喃-7-基）_环 戊烧竣酸（CP-105696)、5_ [2_ (2_竣乙基）_3_ [6_ (4_甲氧苯基）-5E-己稀基]氧苯氧 基]-戊酸（0N0-4057)或DPC-11870，
[0135] · 5-脂加氧酶抑制剂，如齐留通（zileuton)、6_[ (3-氟-5-[4_甲氧 基-3, 4, 5, 6-四氢-2H-吡喃-4-基])苯氧甲基]-1-甲基-2-喹诺酮（ZD-2138)或 2,3,5-三甲基-6-(3-吡啶基甲基）、1，4-苯醌（(^-6504) ;
[0136] ?钠通道阻滞剂，如利多卡因（Iidocaine);或
[0137] · 5-HT3 拮抗剂，如昂丹司琼（ondansetron);
[0138] 以及它们的药学上可接受的盐和溶剂化物。
[0139]-根据本发明的第八方面，提供一种在个体中治疗、预防、缓解、控制、减少疼痛形 成或进展或任何前述疼痛和/或疼痛症状的发生率或延迟疼痛形成或进展或任何前述疼 痛和/或疼痛症状的方法，所述方法包括向个体施用有效量的根据第一方面、第二方面或 第七方面或其优选实施方案的P75NTR(NBP)或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载 体。
[0140] 优选地，个体是哺乳动物，例如伴侣动物如马、猫或犬或家畜如羊、牛或猪。最优选 地，哺乳动物是人。
[0141]-根据本发明的第九方面，提供一种用于治疗、预防、缓解、控制、减少疼痛形成或 进展或任何前述疼痛和/或疼痛症状的发生率或延迟疼痛形成或进展或任何前述疼痛和/ 或疼痛症状的组合物，所述组合物包含根据第一方面、第二方面或第七方面或其优选实施 方案的P75NTR(NBP)，或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体和药学上可接受的载 体和/或赋形剂。
[0142] 优选地，制备根据第一方面、第二方面或第七方面或其优选实施方案的 P75NTR(NBP)或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第九方面的药物组合物用于 或适于口服、舌下、颊部、局部、直肠、吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内、肌内、心内、骨内、皮 内、腹膜内、经粘膜、阴道、玻璃体内、关节内、关节周、局部或皮内施用。
[0143] 优选地，制备根据第一方面、第二方面或第七方面或其优选实施方案的 p75NTR(NBP)或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第九方面的药物组合物用于 或适于疼痛发作之前和/或期间和/或之后施用或用于或适于这类用途。
[0144] 优选地，制备根据第一方面、第二方面或第七方面或其优选实施方案的 p75NTR(NBP)或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第九方面的药物组合物用于 或适于每周1次至7次之间施用，进一步优选地每月1次至4次之间施用、进一步优选地每 6个月时间1次至6次之间施用，进一步优选地每年1次至12次施用。优选地，将药物意 在或制备意在以选自以下的时间外周施用：每日1次、每2、3、4、5或6日1次、每周1次、每 2周1次、每3周1次、每月1次、每2个月1次、每3个月1次、每4个月1次、每5个月1 次、每6个月1次、每7个月1次、每8个月1次、每9个月1次、每10个月1次、每11个月 1次或每年1次。
[0145] 进一步优选地，将根据第一方面、第二方面或第七方面或其优选实施方案的 p75NTR(NBP)或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第九方面的药物组合物意在 或制备意在通过选自以下的一个或多个途径外周施用：口服、舌下、经颊地、局部、直肠、通 过吸入、经皮、皮下、静脉内、动脉内或肌内、通过心内施用、骨内、皮内、腹膜内、经粘膜、阴 道、玻璃体内、表皮、关节内、关节周或局部途径。
[0146] 优选地，制备根据第一方面、第二方面或第七方面或其优选实施方案的 p75NTR(NBP)或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第九方面的药物组合物用于 或适于以约0. 1至约200mg/ml之间的浓度；优选地在以如下任一个浓度：约0. 5、1、5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、 160、170、180、190或 20011^/1111+/-约10%误差，最优选地以约5011^/1111施用。
[0147] 优选地，制备根据第一方面、第二方面或第七方面或其优选实施方案的 p75NTR(NBP)或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第九方面的药物组合物用于 或适于以约0. 1至约200mg/kg体重之间的浓度；优选地在以如下任一个浓度：约0. 5、1、5、 10、1520、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、 160、170、180、190或约20011^/1^体重+/-约10%误差，最优选地以约1011^/1^施用。
[0148]-根据本发明的第十方面，提供一种试剂盒，其包含：
[0149] (a)根据第一方面、第二方面或第七方面或其优选实施方案的p75NTR(NBP)或根 据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第九方面的药物组合物；和
[0150] (b)针对以下任一种或多种情况向个体施用有效量的所述p75NTR(NBP)、核酸分 子、载体或药物组合物的说明书：预防或治疗疼痛和/或疼痛症状或用于缓解、控制、减少 疼痛和/或疼痛症状的发生率，或延迟其形成或进展。
[0151] 该试剂盒可以包含一个或多个容器，所述容器含有本文所述的p75NTR(NBP)、核 酸、载体或药物组合物，和根据本发明任何方法和用途的使用说明书。试剂盒还可以包含选 择适于治疗的个体的描述，所述选择基于鉴定该个体是否具有疼痛或疼痛症状或面临具有 这种疼痛或疼痛症状的风险。用于施用药物组合物的说明书可以包含信息，如关于预期治 疗的剂量、给药方案和施用途径。
[0152] 根据本发明的第十一方面，提供根据第一方面、第二方面或第七方面或其优选实 施方案的P75NTR(NBP)或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第九方面的药物 组合物用于以下任一种或多种情况：预防或治疗病状或病状的症状或缓解、控制、减少该 病状或该病状的症状发生率，或延迟其形成或进展，所述病状与神经营养因子NGF、BDNF、 NT-3、NT-4/5的任一种或多种相关。
[0153]-NGF(神经生长因子）与至少两类受体p75NTR和TrkA(-种参与轴突生长、支化 和伸长的跨膜酪氨酸激酶）结合。与NGF相关的病状和症状是已知的。NGF在炎性病症和 疼痛中表达并与之相关[蛋白质序列NP002497. 2,NP_038637]。另外，已经显示NGF在许 多心血管疾病如冠状动脉粥样硬化、肥胖症、2型糖尿病和代谢综合征中以及在多发性硬化 中发挥作用。降低的NGF血浆水平（以及另外降低的BDNF血浆水平）已经与急性冠状动 脉综合征和代谢综合征相关。NGF还与各种精神病症相关，如痴呆、抑郁、精神分裂症、孤独 症、Rett综合征、神经性厌食和神经性贪食，并且还已经涉及阿尔茨海默病和神经变性病的 形成。还已经显示NGF加速伤口愈合，并且存在它可以用于治疗皮肤溃疡和角膜溃疡的证 据，已经显示它减少神经变性并在大鼠中促进外周神经再生。
[0154]BDNF(脑衍生神经营养因子）是在神经系统发育期间支持神经元存活和生长的神 经营养因子[蛋白质序列NP_001137277. 1，NP_001041604]。BDNF结合细胞表面受体TrkB 和P75NTR并且还调节α-7烟酸受体的活性。与BDNF相关的病状和症状是已知的。已经 显示BDNF在生理疼痛和病理疼痛传递方面、特别在其中发现BDNF合成大大增加的急性疼 痛、炎性疼痛和神经性疼痛的模型中发挥重要作用；还已经显示BDNF在慢性疼痛病状以及 其他病状如湿疹和银屑病中上调。在抑郁、精神分裂症、强迫性障碍、阿尔茨海默病、亨廷顿 病病、Rett综合征和痴呆以及神经性厌食和神经性贪食中观察到BDNF的下调。
[0155]-神经营养因子-4 (ΝΤ-4)，也称作神经营养因子-5 (ΝΤ-5)，是优势地经p75NTR受 体和TrkB受体传导信号并促进外周感觉交感神经神经元存活的神经营养因子。这种蛋白 质的成熟肽在检查过的全部哺乳动物（包含人、猪、大鼠和小鼠）中是相同的[蛋白质序列 ΝΡ006170，ΝΡ_937833]。ΝΤ-4大多由背根神经节（DRG)的神经元和椎旁和椎前交感神经节、 脊髓背角和腹角中的那些神经元合成，并且发现在许多组织（包括前列腺、胸腺、胎盘和骨 骼肌）中表达。与ΝΤ-4/5相关的病状和症状是已知的。ΝΤ4/5中的缺陷与原发性开角型青 光眼的易患性相关。还已经显示神经营养因子4有助于乳腺癌细胞存活并且是抑制肿瘤生 长的靶。ΝΤ-4/5已知参与疼痛-信号传导系统，如伤害性疼痛，还在皮肤慢性炎性病症中观 察到ΝΤ-4/5的上调，如皮炎、湿疹、异位性皮炎的痒疹病灶。在阿尔茨海默病、亨廷顿病病 中观察到ΝΤ-4/5的下调。
[0156]-神经营养因子-3 (ΝΤ-3)，是结构上与β-NGF、BDNF和ΝΤ-4相关并控制哺乳动物 神经元存活和分化及成体神经系统维持的神经营养因子，并且在人胎盘中表达时可以影响 胚胎中神经元的发育。与NT3相关的病状和症状是已知的。通过基因打靶产生的NTF3-缺 陷小鼠显示严重的肢体运动缺陷。NT-3通过Trk受体进行信号传导并促进神经和神经胶 质细胞的生长和存活[蛋白质序列NP_001096124. 1和NP_032768]。人、小鼠和大鼠NT-3 的氨基酸序列相同。已知NT3及其同族受体，酪氨酸激酶C(TrkC)，调节神经性疼痛和伤害 性疼痛和伤害感受及本体感受机制，例如NT3表达在神经病理动物的小DRG细胞中增加。 NT3表达还与神经病如糖尿病性多发性神经病和HIV相关性神经病、大纤维神经病（包括 萎缩）相关，它还参与痛觉过敏（通常有害的刺激的阈值下降）、异常性疼痛（无害刺激变 得有害）和自发性疼痛（明显缺乏刺激的情况下疼痛）的形成并且是肌肉疼痛的已知调节 物。
[0157] 现在将参以下实施例描述本发明，其中提供所述实施例以说明而非限制本发明。
[0158] 提供以下实施例以说明而非限制本发明。 实施例
[0159] 实施例1.对人血浆检测到内源性p75NTR(NBP)-神经营养因子复合物
[0160] 使用以下测定法来提供人血浆中存在P75NTR/NGF复合物的直接证据，所述测定 法利用基于磁珠的NGF(密理博公司（MilliporeCorp) ;MA)和使用生物素化山羊多克隆抗 人NGF抗体（神经生物公司（NovusBiologicals) ;C0)的免疫沉淀，随后使用稳定同位素 标准和用抗肽抗体提取（SISCAPA)(Siscapahttp://siscapa.com/home.html),随后在液 相色谱-串联质谱联用（LC-MS/MS)(LLOQ7pg/mL)中测定。多克隆抗NGF抗体用来对人血 清/血浆中的游离NGF定量。
[0161] 在P75NTR的嵌合体消化后，通过LC-MS/MS选择p75NTR的胞外结构域的肽序列 (CAYGYYQDETTGR(SEQIDNO. 4),VCEAGSGLVFSCQDK(SEQIDNO. 6),WADAECEEIPGR(SEQID NO. 7))(如图2中所显示）作为p75NTR标准物。免疫共沉淀在（如上文所述的）总NGF测 定法中检测到的P75NTR能够展示p75NTR对照肽的存在，从而提供人血清中可溶性p75-NGF 复合物的证据。采用相应BDNF、NT-3和NT4/5抗体，还使用免疫共沉淀法确定p75NTR(NBP) 与BDNF、NT-3和NT4/5的相似相互作用。这些研究展示人血浆中存在与NGF、BDNF、NT-3和 NT4/5任一结合的可溶性p75神经营养因子结合蛋白。
[0162] 图2中展示的数据显示了可溶性p75NTR(NBP)肽标准片段和显示人血浆中 p75NTR(NBP)-NGF复合物的p75NTR(NBP)和NGF免疫共沉淀。从人血浆中p75NTR(NBP)-NGF 免疫共沉淀研究的结果显而易见，神经营养因子-P75NTR(NBP)复合物参与结合的关键肽 是：WADAECEEIPGR(SEQIDN0.7)、CAYGYYQDETTGR(SEQIDN0.4)、VCEAGSGLVFSCQDK(SEQID NO. 6)，另外，我们已经确定序列LDSVTSDVVSATEPCKP(SEQIDNO. 8)也是在结合中重要的。
[0163] 用BDNF和NT-3重复该实验，显示p75NTR(NBP)的相同关键结合区的重要性 并展示P75NTR(NBP)与BDNF和NT-3免疫共沉淀，所述免疫共沉淀显示人血浆中的 p75NTR(NBP)-BDNF和p75NTR(NBP) -NT-3 复合物。
[0164] 实施例2.可溶性p75NTR(NBP)抑制在表达TrkA的U20S细胞系中和共表达TrkA 和P75NTR的U20S细胞系中的神经生长因子（NGF)功能。
[0165] 在表达TrkA的U20S细胞以及共表达TrkA和p75NTR的U20S细胞（Discoverx CorpCA)中探索p75NTR(NBP)对NGF功能的影响。该测定法根据PathHunter方法学进行 (DiscoverxCorpCA),简而言之，表达TrkA和TrkA+p75NTR的U20S细胞从DiscoveRx公 司（DiscoveRxCorporation)购买。将表达TrkA的U20S细胞和共表达TrkA+p75NTR的 细胞以40, 000个细胞/孔的密度接种在极限基本培养基（MEM;西格玛奥德里奇（Sigma AldrichD+O.S%马血清（西格玛奥德里奇（SigmaAldrich))平板中并在37°C温育过夜。 将平板在使用之前30分钟从培养箱取出并在室温贮存。
[0166]将NGFa(西格玛奥德里奇（SigmaAldrich))和p75NTR(NBP)-Fc(使用接头SEQ IDNO. 17 与IgG-FcSEQIDNO. 12 偶联的p75NTR(NBP)SEQIDNO. 2)或者p75NTR(NBP) (p75NTR(NBP)SEQIDNO. 2)、或与白蛋白SEQIDNO. 10 偶联的p75NTR(NBP)、或与转铁蛋 白SEQIDNO. 9 偶联的p75NTR(NBP) (p75NTR(NBP)SEQIDNO. 2)，稀释于外加 0. 25 %牛血 清蛋白（BSA)的汉克平衡盐溶液缓冲液（HanksBalancedSaltSolution，HBSS西格玛奥 德里奇（SigmaAldrich))中。连续稀释神经生长因子（NGF)以产生从OnM至200nM的浓 度。与FeIgG、白蛋白或转铁蛋白的任一偶联的P75NTR(NBP)稀释于汉克平衡盐溶液缓冲 液（HBSS)中以产生100ng/mL的p75NTR浓度。
[0167] 将5μ1每种NGF浓度（0-200nM)和5μIp75NTR(NBP)+/-载体添加至每个孔。 在试图理解对预温育的影响时，允许P75NTR(NBP) +/-载体和NGF在室温温育20分钟，之 后将10μ1这种混合物添加到每个孔。在添加NGF和p75NTR(NBP)+/-载体后立即添加 12μ1检测溶液（DiscoverxCorpCA)至每个孔，并且允许平板在室温温育60分钟，之后 在ParkardVictor2平板读数仪上读数。观察到剂量反应曲线和曲线响应于p75NTR(NBP) 添加的平移。无论所用的载体是什么，均观察到无载体的p75NTR(NBP)、p75NTR(NBP)-Fc、 P75NTR(NBP)-白蛋白或p75NTR(NBP)-转铁蛋白阻抑作用和NGF剂量反应曲线平移（见图 4) 。
[0168] 实施例3.p75NTR(NBP)抑制在表达TrkB的U20S细胞系中和共表达TrkB和p75NTR 的U20S细胞系中的脑源性神经营养因子（BDNF)功能。
[0169] 在表达TrkB的U20S细胞以及共表达TrkB和p75NTR的U20S细胞（Discoverx CorpCA)中探索p75NTR(NBP)对BDNF功能的影响。该测定法根据PathHunter方法学进 行（DiscoverxCorpCA)，简而言之，表达TrkB和TrkB+p75NTR的U20S细胞从DiscoveRx 公司（DiscoveRxCorporation)购买。将表达TrkB的U20S细胞和共表达TrkB+p75NTR 的细胞以40, 000个细胞/孔的密度接种在极限基本培养基（MEM;西格玛奥德里奇（Sigma AldrichD+O.S%马血清（西格玛奥德里奇（SigmaAldrich))平板中并在37°C温育过夜。 将平板在使用之前30分钟从培养箱取出并在室温贮存。
[0170]将BDNFa(西格玛奥德里奇（SigmaAldrich))和p75NTR(NBP)-Fc(使用接头SEQ IDNO. 17 与IgG-FcSEQIDNO. 12 偶联的p75NTR(NBP)SEQIDNO. 2)或者p75NTR(NBP) (p75NTR(NBP)SEQIDNO. 2)、或与白蛋白SEQIDNO. 10 偶联的p75NTR(NBP)、或与转铁蛋 白SEQIDNO. 9 偶联的p75NTR(NBP) (p75NTR(NBP)SEQIDNO. 2)，稀释于外加 0. 25 %牛血 清蛋白（BSA)的汉克平衡盐溶液缓冲液（HBSS西格玛奥德里奇（SigmaAldrich))中。连 续稀释脑源性神经营养因子（BDNF)以产生从OnM至200nM的浓度。与Fc-IgG、白蛋白或转 铁蛋白的任一偶联的P75NTR(NBP)稀释于汉克平衡盐溶液缓冲液（HBSS)中以产生IOOng/ mL的p75NTR(NBP)浓度。
[0171] 将5μ1每种BDNF浓度（0-200nM)和5μIp75NTR(NBP) +/-载体添加至每个孔。 在试图理解对预温育的影响时，允许P75NTR(NBP) +/-载体和BDNF在室温温育20分钟，之 后将10μ1这种混合物添加到每个孔。在添加BDNF和p75NTR(NBP)+/-载体后立即添加 12μ1检测溶液（DiscoverxCorpCA)至每个孔，并且允许平板在室温温育60分钟，之后 在ParkardVictor2平板读数仪上读数。观察到剂量反应曲线和曲线响应于p75NTR(NBP) 添加的平移。无论所用的载体是什么，均观察到无载体的p75NTR(NBP)、p75NTR(NBP)-Fc、 P75NTR(NBP)-白蛋白或p75NTR(NBP)-转铁蛋白阻抑作用和BDNF剂量反应曲线平移（见图 5) 。
[0172] 实施例4.表明p75NTR(NBP)与BDNF结合以及抗BDNF和p75NTR(NBP)之间 竞争的Biocore数据。将P75-Fc(p75NTR(NBP)-Fc) (500μg/ml)在IOmM乙酸盐pH 5.0中稀释至251^/1111的浓度并利用运行缓冲液耶5-?(0.005%?20)+11^/1111牛血清 蛋白（BSA)固定在Biocore芯片上。制备BDNF(来自R&D系统（RandDsystems)) 在HBS-P(0· 005 %P20) +lmg/ml牛血清蛋白（BSA)缓冲液中的2μM母液。用p75并 且在以下浓度的MAB248(BDNF抗体R&D系统）存在或不存在时进行BDNF竞争实验： i)单独的MAB248(500nM)，ii)BDNF(20nM)+MAB248(500nM)iii)单独的BDNF(20nM) 和iv)BDNF(20nM) +MAB248 (IOOnM)。全部样品均从母液制备并且稀释于运行缓冲液 HBS-P(0. 005%P20)+lmg/ml牛血清蛋白（BSA)中。在上样前，全部样品置于室温30分钟。 以流速50μ1/分钟跨biocore芯片启动手动传感图。将每份样品在一个独立传感图循环 按上文所列顺序上样30秒。在必要的情况下用5mMNaOH持续12秒（10μ1)循环实施再 生。如图6中所示，p75NTR(NBP)结合BDNF。
[0173] 实施例5.p75NTR(NBP)抑制PC12细胞中的NGF活性
[0174] 显示p75NTR(NBP)在表达TrkA和/或TrkA外加p75的PC-12细胞和N20S细胞 中显著抑制细胞表面上NGF的活性，图7。
[0175] 将低代次PC12细胞（代次20-24)直接在补充有5%胎牛血清和10%热灭活 马血清以及青霉素-链霉素（l〇U/ml-〇. lmg/ml)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基 (Dulbecco' s modified Eagle's medium，DMEM)中的96孔板上培育，并在含有5% CO2的增 湿气氛下37°C温育。添加NGF(50ng/mL)至生长培养基以分化PC12细胞。将200、100、50、 25、12· 5、6. 25、3. 1、L 5、0· 78、0· 39、0· 2、0· Ing/mL剂量浓度的P75NTR(NBP)添加至整块平 板的每个孔。将平板在37°C温育24小时，此后，通过细胞计数器确定细胞数目。如图8中 所示，添加P75NTR(NBP)至培养基明显地阻断PC-12细胞向其轴突表型分化。在NGF存在 的情况下，PC-12细胞分化并形成神经元样表型。响应于p75NTR(NBP)，以剂量依赖性方式 抑制这种情况。从这些研究中得出结论，P75NTR(NBP)阻断NGF的作用。
[0176] 实施例6.在神经兴奋性模型中，神经营养因子结合蛋白p75NTR(NBP)抑制BDNF 在机械性痛觉过敏中的作用。
[0177] 雄性SpragueDawley大鼠用异氟烧麻醉（氧中5%用于诱导麻醉，氧中1. 5-2. 0% 用于维持麻醉）。通过暴露脊髓L4-L6区的腰椎椎板切除术暴露脊髓，并且将钨微电极插入 背角以从分离的神经元记录宽动态范围。如此分离各个宽动态范围（WideDynamicRange， WDR)神经元，从而所记录单元的尖峰幅值至少3倍于基线噪声水平。使用神经学AC耦合 放大器放大响应并使用CEDspike2软件记录。在药物施加之前，获得针对一系列天然刺激 (轻触、触觉测量套件（VonFrey)、夹痛和热）的3个稳定基线响应（变异〈10% )。通过 用细棉簇抚弄外周感受野中心施加轻触刺激。将触觉测量套件（VonFrey)纤丝和热（使 用设定在43度的恒定水射流）应用10秒时间。将夹痛应用5秒时间。一旦获得稳定的 基线响应，则使用胰岛素注射器，将单独的BDNF(0. 1%牛血清蛋白（BSA)中的500ng)或 BDNF(500ng)+p75NTR(NBP) (500ng，注射之前预温育40分钟）以25μ1体积施加至感受野 的中心。追踪药物效果150分钟并且以10分钟间隔实施测试。在实验终止时，通过颈椎脱 臼法宰杀大鼠。
[0178] 如图8中展示，BDNF造成神经元兴奋性显著增加并且这种作用在刺激后放大。添 加p75NTR(NBP)显著降低响应于全部刺激（即盐水、BDNF、轻触和夹痛）的神经元兴奋性。 显然P75NTR(NBP)减少神经元兴奋性并随后减少疼痛。
[0179] 实施例7-神经营养因子结合蛋白P75NTR(NBP)在UVIH模型中抑制痛觉过敏
[0180]动物暴露于UV
[0181] 2%异氟烧O2混合物麻醉查尔斯河（Charles River)雄性Sprague Dawley大鼠 (175_200g)。通过鼻维维持麻醉，同时用300mJ/cm2UV(Saalmann CupCube系统，Saalmann GmbH，德国；λ = 280-400nm)照射右后爪跖面。通过使用与UV源）（辉瑞设施管理与工 程团队（Pfizer Facilities Management and Engineering Team))连接的成型输送圈 (8x12mm)，辐照源匹配于大鼠后爪的跖面。使用带SEL005/WBS320/TD滤光片的ABLE1400A 福射计（ABLE Instruments and Controls Ltd),校准UV源的强度。使用的UV暴露在初始 大鼠中造成皮肤红斑并且不造成其他不良事件（无体重下降、无应激和明显不适的体征）。
[0182] 热件痛觉讨敏的评估
[0183]遵循改良的Hargreaves等人（1988)方法，使用大鼠妬试验评估热性痛觉过敏 (Ugo Basile,意大利）。在测试之前，使大鼠习惯于该装置（15-30分钟）。妬试验由一张 升高的玻璃桌上三个独立的有机玻璃盒体组成。每个盒子中圈养两只大鼠，从而可以同时 测试6只大鼠/装置。
[0184]在大鼠后爪跖面下方直接应用移动式红外热源。缩爪反应潜伏期（PWL)定义为大 鼠从热源移走其后爪所花费的时间（秒）。将热源校准以在未处理的动物上产生8-12秒反 应（105-120mW/cm2)。设定20秒自动截止点以防止组织损伤。
[0185] 在基线测量期间从每只大鼠后爪（UV暴露之前的初始大鼠，第0日）取得5次记 录并证实痛觉过敏发作（第1日）。在第0日和第1日每日进行2个阶段。
[0186]对基线和在评价药物功效期间第2、3和4日（UV暴露后分别48小时、72小时和 96小时）的每个检测点，采集三个记录/爪。总是首先评估未受伤的爪。
[0187]将热性痛觉过敏定义为显示小于5秒平均PWL的动物，选择这些动物用于研究。
[0188] 静杰异常件疼痛的评估
[0189]在评估异常性疼痛之前，使动物习惯于测试笼的金属丝底。在进行完整上下（up down)测量之前，通过在习惯化第1日应用15g、8g+4g纤丝、在第2日应用4g纤丝，使动物 熟悉弗莱毛（von Frey Hair)。通过将弗莱毛（Stoelting，Wood Dale,伊利诺伊州、美国） 以递减力（0.6、1、1.4、2、4、6、8、10、15和26克）顺序施加至后爪跖面，评价静态异常性疼 痛。将每根弗莱毛施加至爪最多6秒或直至出现缩爪反应。一旦建立针对弗莱毛的缩爪反 应，则再测试该爪，以比产生缩爪的纤丝更短的纤丝开始并且随后用剩余纤丝以递减力顺 序进行直至不出现缩爪。26g最大力使爪抬起以及激发反应，因此代表截止点。以这种方式 测试每只动物的两只后爪。将激发应答所要求的最小量的力记录为缩爪阈值（PWT)，单位是 克。将静态异常性疼痛定义为动物响应于正常大鼠中无害的4g或更小刺激时存在缩爪。
[0190]在测试之前对动物记录基线，并且基于PWL，将展示满足纳入标准的异常性疼痛的 那些动物随机分组并给药。给予测试化合物并且给药后在预定的时间（取决于测试化合物 的药物代谢动力学特性），在选择的给药后时间进行测量，并且收集全部数据用于分析。如 图9中所展示，与对照100mg/kg口服布洛芬和10mg/kg皮下抗NGF抗体相比显示10mg/kg 皮下P75NTR(NBP)(代表NBPP-Fc)的PWL数据，在每种情况下评价热性痛觉过敏的数据显 示相等量值。
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【权利要求】
1. 一种P75NTR神经营养因子结合蛋白P75NTR (NBP)，用于治疗疼痛和/或疼痛症状的 用途。·
2. 根据权利要求1所述的p75NTR(NBP)的用途，其中所述p75NTR(NBP)包含与一个或 多个（b)辅助分子连接的（a)p75NTR(NBP)。
3. 根据权利要求2所述的p75NTR(NBP)的用途，其中所述p75NTR(NBP)通过一个或多 个接头与一个或多个辅助分子连接。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的p75NTR(NBP)的用途，其中所述p75NTR(NBP) 是人 p75NTR(NBP)。
5. 根据任何一项前述权利要求所述的p75NTR(NBP)的用途，其中所述p75NTR(NBP)包 含以下一者或多者：神经营养因子结合结构域1[SEQID NO. 4]、2[SEQ ID NO. 5]、3[SEQ ID N0.6]、4[SEQ ID N0.7]或 5[SEQ ID N0.8]。
6. 根据任何一项前述权利要求所述的p75NTR(NBP)的用途，其中所述p75NTR(NBP)包 含 (a) SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 或 SEQ ID NO. 8 的一者或 多者， (b) SEQ ID NO. 3或其包含（a)的部分，或者 (c) SEQ ID NO. 2或其包含（a)的部分。
7. 根据任何一项前述权利要求所述的p75NTR(NBP)的用途，其中所述p75NTR(NBP)以 如通过表面等离子体共振在20°C所测量的约0. InM至约50nM之间的结合亲和力（Kd)与 NGF、BDNF、NT3 或 NT4/5 的任一者结合。
8. 根据权利要求3所述的p75NTR(NBP)的用途或根据从属于权利要求3时的权利要求 4至7中任一项所述的p75NTR(NBP)的用途，其中所述接头选自： (a) 共价键， (b) 非共价键， (c) 肽键， (d) 构成肽的一个氨基酸或多个氨基酸。
9. 根据权利要求2至8中任一项所述的p75NTR(NBP)的用途，其中所述p75NTR(NBP) 与多于一个辅助分子连接，任选地每个辅助分子是相同或不同的或者是相同者和不同者的 混合物。
10. 根据权利要求9所述的p75NTR(NBP)的用途，其中所述多于一个辅助分子包含经接 头与p75NTR(NBP)连接的辅助分子的多聚体，并且其中每个分子可以是相同或不同的或者 是相同者和不同者的混合物。
11. 根据权利要求2至10中任一项所述的p75NTR(NBP)的用途，其中所述一个或多个 辅助分子选自： (a) 转铁蛋白或其部分， (b) 白蛋白或其部分， (c) 免疫球蛋白Fc或其部分， (d) 聚乙烯二醇聚合物链。
12. -种核酸分子，所述核酸分子编码根据权利要求1至11中任一项所述的 p75NTR(NBP)或与p75NTR(NBP)的一个或多个辅助分子连接的p75NTR(NBP)，任选地还包括 编码号序列。
13. -种可复制表达的载体，所述载体用于转染细胞、任选地用于转染哺乳动物细胞， 所述载体包含根据权利要求12所述的核酸分子。
14. 根据权利要求13所述的可复制表达的载体，其中所述载体是病毒载体。
15. -种宿主细胞，携带根据权利要求12所述的核酸分子。
16. 根据权利要求12所述的核酸分子或根据权利要求13或14中任一项所述的载体， 用于治疗疼痛或疼痛症状的用途。
17. 根据权利要求1至11中任一项所述的p75NTR(NBP)的用途，其中所述p75NTR(NBP) 由以下组成： (a) 序列 SEQ ID No. 3 的 p75NTR(NBP)，和任选地 (b) 免疫球蛋白Fc，任选地其中免疫球蛋白Fc选自SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 15和 SEQ ID No. 16,并且还任选地 (c) 接头，任选地其中接头选自SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 18和SEQ ID No. 19。
18. 根据权利要求1至11或根据权利要求17中任一项所述的p75NTR(NBP)的用途，或 根据权利要求16所述的核酸分子或载体的用途，其中所述疼痛或疼痛症状选自： (a) 急性疼痛和/或自发性疼痛， (b) 慢性疼痛和或持续性疼痛， (c) 炎性疼痛，其包括以下任一种：关节炎疼痛、因骨关节炎或类风湿性关节炎产生的 疼痛、因炎性肠病产生的疼痛， (d) 伤害性疼痛， (e) 神经性疼痛，其包括痛性糖尿病神经病变或与疱疹后神经痛相关的疼痛， (f) 痛觉过敏， (g) 异常性疼痛， (h) 中枢性疼痛，中枢性中风后疼痛、因多发性硬化产生的疼痛、因脊髓损伤产生的疼 痛或因帕金森病或癫痫产生的疼痛， (i) 癌症疼痛， (j) 术后疼痛， (k) 内脏疼痛，其包括消化道内脏疼痛和非消化道内脏疼痛，因胃肠道（GI)紊乱所致 的疼痛、因功能性肠病症（FBD)产生的疼痛、因炎性肠病（IBD)产生的疼痛、因痛经产生的 疼痛、因盆腔疼痛产生的疼痛、因膀胱炎产生的疼痛、因间质性膀胱炎产生的疼痛或因胰腺 炎产生的疼痛， (l) 肌肉-骨骼疼痛，肌痛、纤维肌痛、脊柱炎、血清阴性（非类风湿性）关节病、非关节 风湿病、抗肌萎缩蛋白病、糖原分解、多发性肌炎、化脓性肌炎， (m) 心脏或血管疼痛，因心绞痛、心肌梗死、二尖瓣狭窄、心包炎、雷诺氏现象、硬皮病、 硬皮病或骨骼肌局部缺血所致的疼痛， (η)头部疼痛，其包括偏头痛，有先兆偏头痛、无先兆偏头痛、丛集性头痛、紧张型头痛， (〇) 口面疼痛，其包括牙疼痛、颞颚肌筋膜疼痛或耳鸣，或者 (Ρ)背痛、滑囊炎、月经疼痛、偏头痛、牵涉痛、三叉神经痛、超敏、因脊柱创伤和/或脊 柱变性或者脑卒中产生的疼痛。
19. 根据权利要求1至11或根据权利要求17中任一项所述的p75NTR(NBP)的用途，或 根据权利要求16所述的核酸或载体的用途，其中所述p75NTR(NBP)或核酸分子或载体在组 合中与第二药理活性化合物组合时分别、依次或同时使用。
20. 根据权利要求19所述的p75NTR(NBP)的用途，其中组合的第二药理活性化合物选 自； ?阿片类镇痛药，例如吗啡、海洛因、氢吗啡酮、羟吗啡酮、左啡诺、左洛啡烷、美沙酮、哌 替啶、芬太尼、可卡因、可待因、双氢可待因、羟考酮、氢可酮、右丙氧芬、纳美芬、烯丙吗啡、 纳洛酮、纳曲酮、丁丙诺啡、布托啡诺、纳布啡或喷他佐辛； ?非留体抗炎药（NSAID)，例如阿司匹林、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、芬布芬、非诺 洛芬、氟苯柳、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔 康、萘丁美酮、萘普生、尼美舒利、硝基氟吡洛芬、奥沙拉秦、奥沙普秦、保泰松、吡罗昔康、柳 氮磺吡啶、舒林酸、托美丁或佐美酸； ?巴比妥类镇静剂，例如异戊巴比妥、阿普比妥、仲丁巴比妥、布他比妥、甲苯比妥、美沙 比妥、美索比妥、戊巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥、他布比妥、塞米乐（theamylal)或硫喷 妥（thiopental)； ?有镇静作用的苯二氮例如氯氮氯拉|酸、地西泮、氟西泮、劳拉西泮、奥沙 西泮、替马西泮或三唑仑； ?具有镇静剂作用的氏拮抗剂，例如苯海拉明、吡拉明、异丙嗪、氯苯那敏或氯环嗪； ?镇静剂，如格鲁米特、甲丙氨酯、甲喹酮或二氯醛比林； ?骨骼肌松弛药、例如巴氯芬、卡立普多、氯唑沙宗、环苯扎林、美索巴莫或邻甲苯海拉 明； ? NMDA受体拮抗剂，例如右美沙芬（(+)-3-羟-N-甲基吗啡喃）或其代谢物右啡烷 ((+)-3-羟-N-甲基吗啡喃）、氯胺酮、美金刚、吡咯并喹啉奎宁、顺-4-(膦酰甲基）-2-哌 啶羧酸、布地品、EN-3231 (iVIorphiDexg，吗啡和右美沙芬的组合制剂）、托吡酯、奈拉美 生或培净福太，包括NR2B拮抗剂，例如艾芬地尔、曲索罗地或（-)-(R)-6-{2-[4-(3-氟苯 基）-4-羟-1-哌啶基]-1-羟乙基-3, 4-二氢-2 (1H)-喹啉酮； ? α-肾上腺素能药，例如多沙唑嗪、坦索罗辛、可乐定、胍法辛、碟美塔托米定、 莫达非尼、或4-氨基-6, 7-二甲氧基-2-(5-甲烷-磺酰氨基-1，2, 3,4_四氢异喹 啉-2-基）-5- (2-吡啶基）喹唑啉； ?三环抗忧郁药，例如地昔帕明、丙咪嗪、阿米替林或去甲替林； ?抗惊厥药，例如卡马西平、拉莫三嗪、托吡酯或丙戊酸盐； ?速激肽（NK)拮抗剂，特别地是NK-3、NK-2或NK-1拮抗剂，例如（a R，9R) -7-[3, 5-双 (三氟甲基）苄基]_8,9, 10, 11-四氢-9-甲基-5-(4-甲基苯基）-7Η-[1，4]二氮杂环辛并 [2，1巧][1，7]-萘啶-6-13-二酮〇^1(-637)、5-[[(21?，35)-2-[(11〇-1-[3,5-双（三氟甲 基）苯基]乙氧基-3-(4-氟苯基）-4-吗啉基]-甲基]-1，2-二氢-3Η-1，2, 4-三唑-3-酮 (ΜΚ-869)、阿瑞吡坦、拉奈匹坦、达匹坦或3-[[2_甲氧基-5-(三氟甲氧基）苯基]-甲氨 基]-2-苯基哌啶（2S，3S); ?毒蕈碱拮抗剂，例如奥昔布宁、托特罗定、丙哌维林、曲司氯铵、达非那新、索利那辛、 替米维林和异丙托铵； ? C0X-2选择性抑制剂，例如塞来考昔、罗非考昔、帕瑞考昔、伐地考昔、地拉考昔、依托 考昔或鲁米考昔； ?煤焦油镇痛药，尤其对乙酰氨基酚； ?神经安定药，如氟哌利多、氯丙嗪、氟哌啶醇、奋乃静、硫利达嗪、美索达嗪、三氟拉嗪、 氟奋乃静、氯氮平、奥氮平、利培酮、齐拉西酮、喹硫平、舍吲哚、阿立哌唑、索奈哌唑、布南色 林、伊潘立酮、哌罗匹隆、雷氯必利、佐替平、联苯芦诺、阿塞那平、鲁拉西酮、氨磺必利、巴拉 皮利酮、帕林朵、依利色林、奥沙奈坦、利莫纳班、美兰纳坦、Minaxion?或沙立佐坦； ?香草素受体激动剂（例如树胶脂毒素）或拮抗剂（例如辣椒平）； ? β-肾上腺素能药如普萘洛尔； ?局部麻醉药如美西律； ?皮质类固醇如地塞米松； ?5-ΗΤ受体激动剂或拮抗剂，特别地5-HTIB/ID激动剂如依立曲坦、舒马曲坦、那拉曲坦、 佐米曲坦或利扎曲坦； ?5-HT2A受体拮抗剂如R⑴-α - (2, 3-二甲氧基-苯基）-1- [2- (4-氟苯乙基）]-4-哌 啶甲醇（MDL-100907); ?胆碱能（烟碱）镇痛药，如异丙克兰（TC-1734)、（Ε)-Ν-甲基-4-(3-吡啶基）-3- 丁 烯-1-胺（RJR-2403)、（R)-5-(2-吖丁啶基甲氧基）-2-氯吡啶（ΑΒΤ-594)或尼古丁； ?曲马多； ?第5型磷酸二酯酶抑制剂，如5-[2_乙氧基-5-(4-甲基-1-哌嗪基-磺酰 基）苯基]-1-甲基-3-正丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4, 3-d]嘧啶-7-酮（西地 那非）、（6R，12aR) -2, 3, 6, 7, 12, 12a-六氢-2-甲基-6- (3, 4-亚甲二氧苯基）-吡嗪 并[2'，1'：6，1]_吡啶并[3,4-b]吲哚-1，4-二酮（IC-351或他达拉非）、2-[2_乙氧 基-5-(4-乙基-哌嗪-1-基-1-磺酰基）-苯基]-5-甲基-7-丙基-3H-咪唑并[5, 1-f] [1，2, 4]三嗪-4-酮（伐地那非）、5_ (5-乙酰基-2- 丁氧基-3-吡啶基）-3-乙基-2- (1-乙 基-3-吖丁啶基）-2,6-二氢-7H-吡唑并[4, 3-d]嘧啶-7-酮、5-(5-乙酰基-2-丙氧 基-3-吡啶基）-3-乙基-2-(1-异丙基-3-吖丁啶基）-2, 6-二氢-7H-吡唑并[4, 3-d]嘧 啶-7-酮、5-[2-乙氧基-5-(4-乙基哌嗪-1-基磺酰基）吡啶-3-基]-3-乙基-2-[2-甲 氧乙基]-2, 6-二氢-7H-吡唑并[4, 3-d]嘧啶-7-酮、4-[ (3-氯-4-甲氧苄基）氨 基]-2- [ (2S) -2-(羟甲基）批咯烷-1-基]-N-(嘧啶-2-基甲基）嘧啶-5-甲酰胺、3- (1-甲 基-7-氧代-3-丙基-6,7-二氢-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基）-N-[2-(l-甲基吡咯 烷-2-基）乙基]-4-丙氧基苯磺酰胺； ?大麻素； ?促代谢型谷氨酸盐亚型1受体（mGluRl)拮抗剂； ?血清素再吸收抑制剂，如舍曲林、舍曲林代谢物-去甲基舍曲林、氟西汀、诺氟西汀 (氟西汀去甲基代谢物）、氟伏沙明、帕罗西汀、西酞普兰、西酞普兰代谢物-去甲基西酞普 兰、艾司西酞普兰、d，1-芬氟拉明、非莫西汀、伊福西汀、氰基度硫平、利托西汀、达泊西汀、 萘法唑酮、西文氯胺和曲唑酮； ?去甲肾上腺素（去甲肾上腺素（nor印inephrine))再吸收抑制剂，如马普替林、洛非 帕明、米氮平、羟丙替林、非唑拉明、托莫西汀、米安色林、安非他酮、安非他酮代谢物-羟安 非他酮、诺米芬辛和维洛沙秦（Vi valan_? )、特别地是选择性去甲肾上腺素再吸收抑制剂 如瑞波西汀、尤其（s，S)-瑞波西汀； ?血清素-去甲肾上腺素再吸收双重抑制剂，如文拉法辛、文拉法辛代谢物〇-去甲基文 拉法辛、氯米帕明、氯米帕明代谢物-去甲基氯米帕明、度洛西汀、米那普仑和丙咪嗪； ?诱导型一氧化氮合酶（iNOS)抑制剂，如S-[2-[(l-亚氨乙基）氨基]乙基]-L-同型 半胱氨酸、s-[2-[(1-亚氨乙基）氨基]乙基]-4, 4-二氧代-L-半胱氨酸、s-[2-[(1-亚氨 乙基）氨基]乙基]_2_甲基-L-半胱氨酸、（2S, 5Z) -2-氨基-2-甲基_7_[ (1-亚氨乙基） 氨基]-5-庚烯酸、2- [[ (1R，3S) -3-氨基-4-羟-1- (5-噻唑基）丁基]硫代]-5-氯-3-吡 啶甲腈；2_[[(1R，3S)-3-氨基-4-羟-1-(5-噻唑基）丁基]硫代]-4-氯苯腈、 (2S, 4R)_2_氨基-4-[[2_氯_5_(二氟甲基）苯基]硫代]-5-噻唑丁醇、2_[[(1R, 3S)_3_氨 基-4-羟-1- (5-噻唑基）丁基]硫代]-6-(三氟甲基）-3-吡啶甲腈、2- [[ (1R, 3S) -3-氨 基-4-羟-1-(5-噻唑基）丁基]硫代]-5-氯苯腈、N-[4-[2-(3-氯苄氨基）乙基]苯基] 噻吩-2-甲脒或胍基乙基二硫醚； ?乙酰胆碱酯酶抑制剂，如多奈哌齐； ?前列腺素E2亚型4 (EP4)拮抗剂，如N- [ ({2- [4- (2-乙基-4, 6-二甲基-1H-咪 唑并[4, 5-c]吡啶-1-基）苯基]乙基}氨基）-羰基]-4-甲基苯磺酰胺或 4-[(1S) _1_( {[5-氯-2-(3-氟苯氧基）批陡-3-基]羰基}氨基）乙基]苯甲酸； ?白三烯Μ拮抗剂；如1- (3-联苯基-4-基甲基-4-羟-苯并二氢吡喃-7-基）-环戊 烧竣酸（CP-105696)、5_[2_ (2_竣乙基）_3-[6_ (4_甲氧苯基）-5Ε-己稀基]氧苯氧基]-戊 酸（0Ν0-4057)或DPC-11870， ?5-脂加氧酶抑制剂，如齐留通、6-[(3-氟-5-[4-甲氧基-3,4,5,6-四氢-2!1-吡 喃-4-基])苯氧甲基]-1-甲基-2-喹诺酮（ZD-2138)或2, 3, 5-三甲基-6-(3-吡啶基甲 基）、1，4_ 苯醌（CV-6504); ?钠通道阻滞剂，如利多卡因；或 ? 5-HT3拮抗剂，如昂丹司琼； 以及它们的药学上可接受的盐和溶剂化物。
21. -种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至11或权利要求17中任一 项所述的p75NTR(NBP)或根据权利要求12至14所述的核酸分子或载体，以及药学上可接 受的载体和/或赋形剂，用于以下任一种或多种情况的用途：预防疼痛和/或疼痛症状、缓 解疼痛和/或疼痛症状、控制疼痛和/或疼痛症状、减少疼痛和/或疼痛症状的发生率或延 迟疼痛和/或疼痛症状的形成或进展。
22. -种试剂盒，所述试剂盒包含： (a) 根据权利要求1至11或权利要求17中任一项所述的p75NTR(NBP)或根据权利要 求12至14所述的核酸分子或载体，或根据权利要求21所述的药物组合物；和 (b) 针对以下任一种或多种情况向个体给药有效量的所述p75NTR(NBP)、核酸分子、载 体或药物组合物的说明书：预防或治疗疼痛和/或疼痛症状或者用于缓解疼痛和/或疼痛 症状、控制疼痛和/或疼痛症状、减少疼痛和/或疼痛症状的发生率，或延迟疼痛和/或疼 痛症状的形成或进展。
23. -种治疗和或预防个体中疼痛和或疼痛症状的方法，所述方法包括向所述个体给 药治疗有效量的根据权利要求1至11或权利要求17中任一项所述的p75NTR(NBP)或根据 权利要求12至14所述的核酸分子或载体，任选地进一步包括药学上可接受的载体。
【文档编号】A61K38/10GK104302326SQ201380014475
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年3月14日 优先权日:2012年3月14日
【发明者】S·韦斯特布鲁克 申请人:利维塞普特有限公司