专利名称：：表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体及其用途，属于医学生物
技术领域：
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背景技术：
：胶质源性神经营养因子(Glialcellderivedneurotrophicfactor,GDNF)是一种具有神经营养和神经保护作用的神经营养因子，多种临床动物模型的研究试验中证实GDNF能够促进多巴胺能祌经元、运动神经元的存活及损伤后神经突触的重建。但由于GDNF是一种大分子蛋白质，难以通过血脑屏障到局部病变脑组织，成为阻碍其临床应用的主要原因。神经干细胞具有自我增殖和多向分化为神经元和胶质细胞的能力，为神经退行性疾病的细胞治疗带来了希望。神经干细胞移植实验研究证实，移植入动物模型脑内的神经干细胞能够整合入局部脑组织，在一定范围内迁移并分化成为神经元和胶质细胞。神经干细胞也因此被作为携带GDNF的一种细胞载体。研究证实，将过表达GDNF的神经干细胞移植入灵长类和鼠类的帕金森动物模型的病变部位，明显提高了共同移植的原代多巴胺能神经元的存活效率，说明能够过表达GDNF基因的神经干细胞是一种较好的细胞治疗载体。但神经干细胞分裂增殖相对缓慢，特别是经过长期的传代培养后，处于分裂增殖状态的细胞比例会逐步下降。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种稳定表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体。本发明要解决的另一个技术问题是提供表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体在体外高效转染神经干细胞的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体，其保藏号为CGMCCNo.2086。表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体体外转染神经干细胞及表达的方法，将神经球用胰酶打散成单细胞悬液，以2.5X10Vml的密度接种于用纤粘连蛋白包被的培养皿，培养至少六小时后，向250ul神经干细胞培养基中加入MOPO.5-10(优选1.0)的慢病毒载体CGMCCNo.2086的上清，加入浓度为2ug/ml的polybrene(凝聚胺)，转染20小时。表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体CGMCCNo.2086用于制备治疗神经退行性疾病如帕金森病的用途。本发明涉及的慢病毒载体的宿主菌于2007年6月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏编号为CGMCCNo.2086，参据的微生物株为DUET101-GDNF，建议的分类命名为大肠埃希氏菌。我们在研究中构建了由管家基因启动子EFl-a和PGK驱动的同时表达GDNF和潮霉素抗性基因的多基因表达载体。实验中证实，携带GDNF和GFP(绿色荧光蛋白)基因的慢病毒载体可在体外成功转染神经干细胞，持续高表达GDNF和GFP。转染成功的神经干细胞同时表达潮霉素抗性基因，经过体外加入潮霉素进行筛选，我们可以得到均一表达GDNF和GFP的神经干细胞体系。运用这种纯度更高，性质更为均一的高表达GDNF的神经干细胞进行移植将进一步提高移植治疗的安全性和有效性。与其它类型的载体相比，慢病毒载体对于增殖相对缓慢的神经干细胞有更高的转染效率，并能使外源基因GDNF得到更为持续稳定的表达。我们对转染GDNF的神经干细胞的GDNF分泌水平进行了连续监测，发现GDNF可在体外持续表达分泌，分泌水平没有发生明显的改变。在经潮霉素筛选后的长期培养中，转染后的神经干细胞可以保持原有的生物学特性。本发明的优点是本发明构建的慢病毒载体含有两个启动子结构，可同时表达GDNF基因和潮霉素抗性基因，通过瞬时转染的方法可以包装出的慢病毒载体上清可以高效转染分裂相对缓慢的神经干细胞，使GDNF基因整合入耙细胞基因组中，长期稳定表达；转染后的神经干细胞经潮霉素筛选可以去除未转染成功地神经干细胞，得到均一的过表达GDNF的细胞体系；经过慢病毒载体基因修饰的神经干细胞仍然能够保持其原有的生物学特性。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，不以任何方式限制本发明，凡依照本发明公开内容所进行的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为含GDNF基因的慢病毒载体构建图；其中图1-A:慢病毒载体DUETIOI酶切后分离出原有片断；图1一B:PCR扩增出含酶切位点的GDNF基因全长；图l一C:连接成功后质粒酶切鉴定。图2为表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体环形结构图和构建后模式图图2-A:环形结构图如图质粒全长11430bp，图中绿色片断为连入的GDNF基因片断，位于酶切位点Xba-I和BsrG1之间；图2-B:结构图如图其中EF1-a和PGK为启动子，分别驱动GDNF基因和潮酶素抗性基因。LTR为慢病毒载体的长末端重复序列。图3为含GFP的慢病毒载体转染神经干细胞10天后光镜和荧光纤维镜下观察结果其中，图3-A:光镜下神经球(400倍)；图3-B:荧光显微镜下观察，神经球GFP阳性；图3-C:神经球打散成单细胞悬液后光镜图；图3-D:荧光显微镜下观察，95^细胞程GFP阳性。图4为转染条件优化实验结果图图4-A:不同生长形式下转染效率比较，显示直接转染神经球转染效率平均为7.08%±0.80%;神经球打散成单细胞悬液后转染，转染效率平均为22.31%±0.28%;ANOVA检验，p〈0.01，n=10组间差异有显著性意义。图4一B:不同贴壁条件下GDNF转染效率测定正常对照组与多聚赖氨酸包被组间转染效率无显著性差异(AN0VA,n=8,p〉0.05);纤粘连蛋白包被组与其它两组转染效率间有显著性差异(p〈0.05)。图4-C:不同转染时间点转染效率测定结果(n=10):相同转染条件下，随转染时间延长，转染效率逐渐提高，20—20小时后到达平台期。图5为不同拷贝数条件下GDNF分泌情况ELISA测定结果图ANOVA分析对照组与转染组间GDNF分泌量均有显著性差异(p〈0.05)，其中，M0I=5组和MOKO组与MOI=0.5,1,2.5，IO组间差异有显著性(p<0.01)。图6为潮霉素筛选后不同时期GDNF分泌量测定结果图转染后GDNF可持续表达，分泌量随时间延长无明显改变；GDNF分泌量与转染拷贝数有关，拷贝数越高，GDNF分泌量越高。具体实施方式实施例1:神经干细胞培养一.方法原代神经干细胞取自人胚胎自然流产胎儿(8—16w)(宣武医院妇产科提供，经伦理委员会批准)。取材后制成单细胞悬液过400目滤网去除组织残渣，台盼蓝计数后以2.5X105/ml的密度接种。培养基为DMEM-F12(美国GIBICO公司)，N2补剂(美国GIBICO公司)，20ng/mlbFGF(美国腿D公司),20ng/mlEGF(美国R&D公司)，青链霉素(美国GIBICO公司)。5%(]02培养箱中培养。3天左右可见小的细胞集落形成，一周可见神经球。每隔三天半换液，待神经球长至50ura左右时，进行剪切传代。待神经球扩增到一定数量后，将神经球用胰酶打散成单细胞悬液后，再以2X107ml的密度接种，此方法可以使神经干细胞在短时间内得到大量扩增。二.结果原代取材的人胚胎皮层神经干细胞培养一周后，可见神经球形成。此时神经球各胞体间结合紧密，性质均一，折光性较强，待神经球长至0.5mm左右时，开始进行剪切传代。经过3—4次剪切传代，神经球扩增至一定数量，我们采用消化振荡法将神经球打散成单细胞悬液，以2乂105密度接种进行传代，此时由单细胞形成神经球的周期明显縮短，传代一周后可以得到2-3倍的细胞。细胞传代IO次以后，体外培养2个月左右，进行了分化增殖能力鉴定，用于下一步实验。实施例2.含GDNF基因的慢病毒载体构建一.材料来源包含人GDNF的质粒PLNCX-2获赠于首都医科大学神经科学研究所，其中GDNF基因序列全长为558bp,为序列表SEQIDNo.3所示序列。慢病毒载体质粒DUET101获赠于美国约翰霍普金斯大学程临钊教授。二.方法1.PCR方法扩增出含相应酶切位点的GDNF基因序列根据慢病毒载体质粒结构，设计了包含XbaI和BsrGI两个酶切位点的扩增GDNF的引物，上游引物5，-TTCTAGACCACCATGAAGTTATGGGATGTCGTG-3'(SEQIDNO.l)，下划线部分为加入的酶切位点Xbal,酶切位点前面加入保护碱基T，其后的ccacc为Kozark序列，再其后是从GDNF始密码ATG开始的一段序列。下游引物5，-CATGTACATCAGATACATCCACACCTTTTAGCG-3，(SEQIDN0.2)，下划线部分为加入的酶切位点BsrGI，前面同样加入保护碱基，其后为GDNF基因序列中包含终止密码的一段序列。通过PCR方法，以质粒PLNCX-2为模板，用高保真的DNA聚合酶扩增出GDNF基因序列全长。PCR反应条件如下。反应体系5XbufferdNTP(10mM)乂引物上下游各lu10.4ul0.2u1反应条件:第一阶段98°Cl个循环6第二阶段「98。C10秒68°C12秒35个循环72。C15秒第三阶段72°C7分l个循环2.慢病毒载体DUETIOI和GDNFPCR产物运用限制性内切酶XbaI和BsrGI双酶切。将所得PCR产物和慢病毒载体的转移质粒DUETIOI用Xbal和BsrGI两个酶(美国NEB公司)进行双酶切，反应体系和条件如下。酶切反应体系共50ul，具体成分如下,载体质粒或GDNFPCR产物5u1/15u110XNEBbuffer5u1^100XBSA0.5u1XbaI/BsrGI1u1、H20补齐至50u1反应条件为，37度水浴孵育2小时。酶切产物回收后备用。将载体DUETIOI酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳，使载体片断和原有绿色荧光蛋白(GFP)基因片段分离片断分离。3.载体片断凝胶回收此过程运用玻璃奶凝胶回收试剂盒(日本Takara公司)进行，具体方法参照产品的说明书，步骤如下(1)紫外灯下切割包含载体片断的凝胶，切割时尽量去除DNA周围的多余凝胶组织，将切割好的凝胶放于预先称重的1.5mlEP管中。(2)用电子天平称重，加入3倍体积凝胶重量的Nal溶液，55度水浴中作用15分钟待凝胶完全融化。(3)加入20ul玻璃奶溶液，充分混匀，室温作用20分钟，作用过程中重复混匀几次。(4)10000rpm离心1分钟，除去上清，先保留于另一1.5mlEP管中，如果回收效率较低，可以重复(3)—次。玻璃奶沉淀保留于管底。(5)用洗涤缓冲液重悬玻璃奶沉淀，10000rpm离心1分钟，弃上清。重复一次。(6)加入与玻璃奶溶液等体积的TE缓冲液，55度作用IO分钟，使DNA充分溶解。lOOOOrpm离心1分钟，吸取上清保存于1.5mlEP管中。取lu1进行1:40稀释用分光光度计测定其浓度。4.连接反应运用T4DNA连接酶(美国NEB公司)将GDNF的PCR酶切回收产物与载体DUET101的凝胶回收片断进行连接反应，将GDNF基因连接入载体DUET101中。(1)将PCR酶切回收产物与载体凝胶回收片断按摩尔比10:l加入反应体系中，同时设立空载体连接对照管看载体是否酶切完全。反应体系Buffer2u1Vectors/inserts1.7u1/10u1_T4腿Ligase1u1反应条件16度孵育过夜。(2)连接产物转化感受态细菌冰上融化感受态细胞Stbl3(美国Invitrogen公司)，取5u1(10pg-100ngDNA)连接产物加入感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌，充分混匀后冰上放置30分钟；将EP管转入42度水浴中热击45秒，立即取出，冰上放置2分钟；加入250u1预热的S0C培养基，盖紧管盖，用封口膜封好，放于37度摇床中，225rpm振荡培养1小时；最后取25—100ul涂布于预热的细菌培养板上，平板倒置放于孵箱中，37度培养过夜。(3)菌液PCR筛选阳性克隆挑取多个单克隆菌落，分别放于盛有3mlLB液体培养基的摇菌管中，230rpm，37度振荡培养8小时。取lul菌液为模板，用GDNF引物进行PCR扩增。2%琼脂糖凝胶电泳选取阳性克隆。保存菌种。(4)对菌液PCR阳性克隆进行质粒小提，用XbaI和BsrGI双酶切进一步鉴定连接结果。阳性克隆质粒进行测序鉴定。(5)测序正确的质粒DUET101-GDNF，保存菌液于-8(TC冰箱中，并用转染级质粒提取试剂盒提取保藏备用。三.结果以包含GDNF基因序列的质粒PLNCX2为模板，经PCR扩增后，2%琼脂糖凝胶电游显示与目的片断大小相符的条带，如图1一B。慢病毒载体经xbal/BsrGI双酶切后，1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示载体中位于两酶切位点间的原有片断被分离，载体被切割成线性，如图l-A。PCR产物和经凝胶回收的载体片断T4DNA连接酶连接后转化感受态细菌后挑选阳性克隆，扩增后提取质粒酶切鉴定可见与GDNF片断大小相符的片断被分离，如图1一C。经测序插入片断与Genebank(该段序列编号AY052832,序列列于文件序列表)中长度为558bp的序列相符。说明GDNF基因已经被成功克隆入慢病毒载体。本发明的载体结构如图2所示。质粒DUET101-GDNF于2007年6月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏编号为CGMCCNo.2086，参据的微生物株为DUET101-GDNF，建议的分类命名为大肠埃希氏菌。实施例3.转染神经干细胞的条件及优化一.方法1.转染慢病毒颗粒的包装采用脂质体介导的瞬时转染方法进行，转染前一天将293T细胞(获赠于北京大学生命科学学院，见文献许信刚，胡建和，张彦明，邓宏魁；逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因的表达及动物免疫试验；《中国病毒学》；200419(6):563-567。)传代于100mm培养皿中，培养板在接种前用100ug/ml的多聚赖氨酸包被l小时，使用前用DPBS洗两次。接种细胞总数为5X106，5y。C02培养箱中培养24h，待细胞70X—80y。汇片后进行转染。分别将构建好的编码GDNF和GFP的转移质粒DUETIOI，编码慢病毒载体gag，pol结构的质粒CMVA8.91(获赠于美国约翰霍普金斯大学，见文献ZhouBY,YeZ,ChenG,GaoZP,ZhangYA,ChengL.Inducibleandreversibletransgeneexpressioninhumanstemcellsafterefficientandstablegenetransfer.StemCells.2007Mar;25(3):779-89.)，以及编码VSV-G结构的质粒PMD.G(获赠于美国约翰霍普金斯大学，见文献ZhouBY,YeZ,ChenG,GaoZP,ZhangYA，ChengL.Inducibleandreversibletransgeneexpressioninhumanstemcellsafterefficientandstablegenetransfer.StemCells.2007)，按3:4:l的比例进行转染，总量16ug,放入含800ulOPTI-MEM(美国GIBICO公司)的聚苯乙烯管中，另外DNA:Lipofectamine(美国Invitrogen公司)=1:2.5的脂质体溶于等体积的OPTI-MEM中，室温放置五分钟后将DNA和脂质体混合，轻柔混匀后室温静置20分钟。弃去原有的293T细胞培养基，加入8ml0PTI-MEM培养基，加入DNA和脂质体混合液，培养8—12h后弃去转染液，换收集培养基ITS(DMEM+Insulin+transferin)。分别于24h和48h后收集上清，0.45um滤器过滤去除细胞碎片，Centriconplus-20离心机浓縮后转染293T细胞进行滴度鉴定，一80度保存。2.条件优化为提高转染效率，寻找最适合神经干细胞转染的条件，我们分别采用多聚赖氨酸，纤粘连蛋白包被培养皿，使神经干细胞暂时贴壁生长的方法。转染前一天，将神经球用胰酶打散成单细胞悬液，以2.5Xl()5/ml的密度分别接种于用多聚赖氨酸或纤粘连蛋白(Fibronectin美国SIGMA公司)包被的24孔板中，未包被组为对照组。至少培养六小时后，分别以MOI为O.5，1，2.5,5，IO加入GDNF和GFP的慢病毒载体上清于250ul神经干细胞培养基中，分别以2ug/ml，6ug/ml，8ug/ml浓度加入凝聚胺(Polybrene,美国SIGMA公司)，培养20小时，换新鲜培养基并将细胞用蓝枪头轻轻吹起，使其恢复悬浮生长状态。转染后一周，将神经球打散成单细胞悬液，荧光显微镜下观察计数GFP阳性细胞百分比，进一步用流式细胞仪的方法测定GFP阳性神经干细胞的百分比，分析转染效率。同时对不同凝聚胺浓度组进行台盼蓝计数细胞存活率。对M0K,凝聚胺浓度为2ug/ffll组进行了不同转染时间点转染效率测定。对于只含有GDNF不表达荧光标记的上清，我们采用转化后第五天加入100ug/ml的潮霉素(hygromycin)进行筛选，筛选后72小时，未能成功转化神经干细胞会死亡。以转染GFP的神经干细胞作为对照，分析筛选效率，转化成功的神经干细胞扩增后用于下一步实验。二.结果1.慢病毒载体系统的三个质粒DUET101、CMV8.9KPMD.G共转染293T细胞，收集转染后24小时，48小时的上清浓縮后，转染293T细胞，计数GFP阳性细胞百分比，进行滴度鉴定，T=5.2X106TU/ral。转染GDNF的293T细胞GDNF抗体染色计数阳性细胞比例，滴度为4.6X106TU/ml。2.神经球打散成单细胞悬液后，LV-GDNF和LV-GFP的浓縮上清分别以不同的MOI值进行转化，实验结果表明，慢病毒载体可以成功转染神经干细胞，使其表达绿色荧光蛋白和GDNF，如图3所示。转染GFP的神经干细胞打散成单细胞悬液FACS测定转化效率为40%左右。100ug/ml潮霉素筛选3天后，流式细胞仪测定GFP阳性细胞比例均在90%以上，说明经过抗生素筛选，可以得到纯度较高的表达GFP和GDNF的神经干细胞。实验结果表明相同条件下将神经球打散成单细胞进行转染，可以显著提高转染效率，如图4-A所示。另外纤粘连蛋白包被组与对照组和PDL包被组相比，转染效率有显著性差异，说明用纤粘连蛋白包被可以提高转染效率，如图4-B所示。同时随转染时间的延长，转染效率逐步提高，20小时时到达平台期，如图4-C所示。但随着转染时间的延长，凝聚胺对细胞的毒性作用也相应增强，浓度越大，细胞死亡率越高。为了取得最佳的转染效率和最低的细胞死亡率，我们选择了用纤粘连蛋白包被培养皿，神经球打散成单细胞悬液，2ug/ml的凝聚胺，转染20小时。实施例4.GDNF表达分泌测定一.方法将转染完成后不同MOI值的皮层神经干细胞用潮酶素筛选后进行扩增，神经球打散成单细胞悬液，以2X10Vml的密度接种于六孔板中，加入2ml培养液，培养3天使其处于增殖状态，加入新鲜培养基后分别取24小时，48小时后上清lml冻存于一80度中准备测定GDNF浓度。每种拷贝数接种3L，同样分别测定了接种3天，7天，第10天，21天，40天时每1X1()S个细胞的GDNF分泌量，GDNF测定采用ELISA测定方法，具体参照Promega公司提供的GDNF酶联免疫吸附检测试剂盒提供的实验步骤进行。同时应用细胞免疫化学和RT-PCR的方法进行了鉴定。二.结果转染GDNF的皮层神经干细胞经100ug/ml的潮霉素筛选三天后，各组不同时期每105个细胞每小时GDNF的分泌量分别为对照组，MOI=0，339.92±231.262;MOI=0.5，GDNF=1556.79±450.087pg/m;M0I=1,GDNF=1879.62±342.651，MOI=2.5，1927.45±251.600pg/ml;M0I=5，4680.78士1041.574pg/ml;MOI=10，4452.74±628.975pg/ml.ANOVA分析，各组与对照组间p<0.05,对照组与转染组之间均有显著性差异。各转染组之间，MOI=0.5，1，2.5与M0^5，10组间分析P〈0.05,差异有显著性。如图5所示。另外随时间的延长，GDNF可以持续表达1月以上，GDNF分泌量没有明显改变。如图6所示。序列表〈110〉首都医科大学宣武医院〈120>表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体及其用途〈130〉〈160〉3〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉33<212〉DNA〈213〉人工合成〈400>1ttctagaccaccatgaagttatgggatgtcgtg33〈210〉2<211>33〈212>DNA〈213〉人工合成〈400〉2catgtacatcagatacatccacaccttttagcg33〈210〉3〈211〉558〈212〉DNA〈213〉人GDNF基因序列〈400>3atgaagttatgggatgtcgtggctgtctgcctggtgctgctccacaccgcgtccgccttc60ccgctgcccgccgcaaatatgccagaggattatcctgatcagttcgatgatgtcatggat120tttattcaagccaccattaaaagactgaaaaggtcaccagataaacaaatggcagtgctt180cctagaagagagcggaatcggcaggctgcagctgccaacccagag犯ttccagaggaaaa240ggtcggagaggccagaggggc犯a犯ccggggttgtgtcttaactgcaatacattt犯at300gtcactgacttgggtctgggctatga犯cc肪gg解g朋ctgatttttaggtsctgcagc360ggctcttgcgatgcagctgagacaacgtacgacaaaatELttgaa犯acttatccagaaat420agaaggctggtgagtgacaaagt已gggcaggcatgttgcsgacccatcgcctttgatgat480gacctgtcgtttttagatgstaacctggtttaccatattctaBgaaagcattccgctaaa540aggtgtggatgtatctga558权利要求1.表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体，其保藏号为CGMCCNo.2086。2.表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体CGMCCNo.2086体外转染神经干细胞及表达的方法，其特征在于将神经球用胰酶打散成单细胞悬液，以2.5X107ml的密度接种于用纤粘连蛋白包被的培养皿，培养至少六小时后，向250ul神经干细胞培养基中加入MOI=0.5-10的慢病毒载体CGMCCNo.2086的上清，加入浓度为2ug/ml的polybrene(凝聚胺)，转染20小时。3.根据权利要求2所述的表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体CGMCCNo.2086体外转染神经干细胞及表达的方法，其特征在于所述MOK.O。4.表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体CGMCCNo.2086用于制备治疗神经退行性疾病的用途。5.根据权利要求4所述的表达胶质源性祌经营养因子的慢病毒载体CGMCCNo.2086用于制备治疗神经退行性疾病的用途，其特征在于所述神经退行性疾病为帕金森病。全文摘要本发明公开了一种表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体及其用途，属于医学生物
技术领域：
。表达胶质源性神经营养因子的慢病毒载体，其保藏号为CGMCCNo.2086。本发明的优点是本发明构建的慢病毒载体含有两个启动子结构，可同时表达GDNF基因和潮霉素抗性基因，通过瞬时转染的方法可以包装出的慢病毒载体上清可以高效转染分裂相对缓慢的神经干细胞，使GDNF基因整合入靶细胞基因组中，长期稳定表达；转染后的神经干细胞经潮霉素筛选可以去除未转染成功地神经干细胞，得到均一的过表达GDNF的细胞体系；经过慢病毒载体基因修饰的神经干细胞仍然能够保持其原有的生物学特性。文档编号A61P25/16GK101397573SQ20071012239公开日2009年4月1日申请日期2007年9月25日优先权日2007年9月25日发明者萍任,关云谦,愚张,徐艳玲,朱宛宛,旸王,王淑艳申请人:首都医科大学宣武医院