专利名称：睫状神经营养因子(cntf)突变体及其生产方法和其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种重组睫状神经营养因子(ciliary neurotrophicfactor，CNTF)突变体，制备纯化该突变体的方法，以及该突变体在治疗肥胖症及神经损伤相关疾病中的用途。
背景技术：
睫状神经营养因子(CNTF)是分子量为22-26KD的酸性蛋白质。最初是从鸡的睫状体中提取出来，并可维持鸡副交感神经节的存活而得名。它与NTF(neurotrophicfactor)家族明显不同，没有同源性，是非靶源性的营养因子，与白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素6(IL-6)等具有相似的螺旋框架结构，被认为属于IL-6家族。CNTF具有多种功能，能促使多种神经细胞的存活，是第一个被发现的能维持在体和离体脊髓运动神经元的存活及突起生长的神经营养因子，CNTF还具有肌肉营养作用，在神经系统发育、分化和神经损伤修复中具有非常重要的作用。最近研究表明，睫状神经营养因子与位于丘脑部位的受体结合，能使缺乏leptin的肥胖小鼠(ob/ob mice)脂肪减少，体重降低；对于更能代表人类肥胖症实际情况的食物诱导肥胖小鼠(diet-induced obesity，DIO)模型，CNTF也能使之体重下降。与通过饮食减肥及其他的治疗方法相比，CNTF不会发生停药后过量摄入食物而引起的体重反弹，因此，CNTF有望开发成为一种新型、高效的减肥产品，具有广阔的临床开发前景。
CNTF在体内分布十分局限，在中枢神经系统，CNTF阳性神经元和胶质细胞主要位于大脑皮质、小脑皮质下区和脊索，在体外培养的I型胶质细胞也可见有CNTF表达。胶质细胞CNTF阳性免疫反应定位于胞体，而突起呈阴性反应；在神经元主要位于胞核，而胞浆呈阴性反应。用抗CNTF cDNA探针原位杂交证实，CNTF mRNA具有特定的区域分布，在脊索、脑干和后脑的表达明显高于听觉区，在听觉神经GFAP+胶质细胞亚群也含有CNTF。在周围神经系统、髓鞘和睫状神经节的雪旺氏细胞，CNTF呈高水平表达，主要位于细胞体和突起，而核中无阳性反应。此外，现已发现人、鸡视网膜组织、牛心血管系统，鼠的脑、心脏、肺、肝、肾等器官都有此物质的存在。但含量最多的是鼠的坐骨神经。
在结构功能研究方面，Bazan(Bazan JF.Neuropoietic cytokines in the hematopoicticfold.Neuron，1991，7197-208.)研究认为在这个4个α-螺旋束组成分子的骨架结构中，D-螺旋中部D2区和ABLOOP可能构成受体结合位点，D1区则形成相对保守的构象。通过片段插入和缺失法，改造人CNTF编码基因，在大肠杆菌中表达并纯化了一系列人CNTF的突变体，观察结构改变对人CNTF神经营养活性的影响，结果表明，人CNTF分子中α-螺旋结构的存在对其生物活性十分重要。对N末端的研究发现，如果N-末端缺失14个氨基酸其生物学活性不受影响，但去掉N端23个氨基酸它将会丧失生物活性。对C-末端的研究观察到，C-末端丧失18个氨基酸其生物活性和亲合力不受影响；若要缺失22个氨基酸，生物活性大幅度下降；缺失24个氨基酸残基，CNTF将完全没有生物活性。最近有报道C端缺失28个氨基酸，生物活性比全长高(Negro A，et al.Struction Function studies of human ciliaryneurotrophic factor.Neurochem Res，1994；19223)。
CNTF的诸多生物学功能主要通过受体介导来完成。CNTF受体在神经系统和骨骼肌中广泛存在，在运动神经系统以及与运动系统有关的部位大量表达。CNTF受体由睫状神经营养因子受体α(Ciliary neurotrophic factor receptorα，CNTFRα)、糖蛋白130(Glycoprotein130，gp130)、白血病抑制因子受体β(Leukemia inhibitory factor receptor β，LIFRβ)三种成份构成，其中CNTFRα是CNTF特异性结合部位，决定哪些细胞对CNTF有反应，而gp130、LIFRβ与信号传导有关。起初这三部分在细胞表面互不相关，但共同形成CNTF的应答体系(SAMUEL DAVIS.The Receptor for Ciliary Neurotrophic Factor.SCIENCE Vol.253，July 1991)。CNTFRα由372个氨基酸残基组成，分子量68kD，通过GPI键(糖基化磷酸肌醇)结合到细胞膜上，它不是跨膜蛋白。gp130是一个分子量为130kD的糖蛋白，在IL-6家族中作为信号传递体。LIFRβ分子量为190kD，是LIF的结合蛋白。LIFRβ胞浆部分没有蛋白激酶活性和GTP结合位点。CNTF的信号传导是通过gp130和LIFRβ的异二聚体化实现(AzadBonni.Characterization of a pathway for Ciliary Neurotrophic Factor Signaling to theNucleus.SCIENCE.Vol.262.3.DECEMBER 1993)，CNTF与CNTFRα的结合启动传导，引起gp130和LIFRβ的聚合，激活gp130上Box-1区JAK激酶的活性，然后引起gp130远端Box-3区的磷酸化，Box-3吸引STAT3的SH2区与之结合，最后STAT3被JAK激酶活化，导致STAT二聚体的形成，STAT3转位到细胞核后，通过结合到DNA上的基因反应元件调控转录。
最近的研究表明，hCNTF可以利用可溶型和膜结合型的IL-6R代替IL-6R的同源受体CNTFRα(Bjorn Schuster.Etal Signaling of Human Ciliary Neurotrophic Factor(CNTF)Revisited.The Journal of BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.278.NO.11.Issue of March 14，pp.9528-9535)，这项研究结果不但拓宽了CNTF作用的研究范围，更为研究CNTF与其受体结合的重要氨基酸及其特性提供新的思路和方法。
肥胖是一种严重危害人体健康的慢性疾病。肥胖与多种疾病有关，如II型糖尿病、高血压(进而可导致心衰和中风)和高胆固醇(进而可导致动脉粥样硬化和冠状动脉疾病)，随着体重指数(BM，一种评价体重的指标)的增加，患糖尿病、恶性脂肪瘤、某些癌症、睡眠窒息症和骨关节炎的机率也显著增加。由于肥胖能引起多种代谢异常，是糖尿病与心血管病发病的主要危险因素之一，并与心血管疾患的发病率与死亡率增高有关。传统上基于饮食和运动对肥胖症的非药物治疗的长期疗效往往十分有限，促使临床医生不得不寻求药物以治疗肥胖症。
CNTF良好的减重作用引起了人们广泛的关注，为了找到更为安全、更为有效的CNTF，人们把目光投向了其突变体的研究。目前，已有美国、意大利等国开展了其突变体研究并将其应用于肥胖的治疗方面，取得了不错的效果(参见CN1240358A和WO2005033137A)。本发明的目的就是应用计算机同源模建的方法，深入分析CNTF/CNTFRα的相互作用，在CNTF结构上寻求突破，合理设计全新的、有更高生物学活性的CNTF突变体，采用基因工程的方法，得到大量的符合要求的CNTF突变体蛋白，并将其应用到减肥或其他方面的治疗研究上，开发出新型、高效的减肥产品。
发明内容
本发明的一个方面提供了一种具有更高生物活性的睫状神经营养因子(CNTF)突变体，所述突变体的第17位半胱氨酸变为丝氨酸，并去掉C端的16个氨基酸。该突变体进一步可包括第53位的丙氨酸变为缬氨酸或第35位的苏氨酸变为蛋氨酸和第178位的苯丙氨酸变为缬氨酸，其中所述的睫状神经营养因子优选为人睫状神经营养因子(hCNTF)，其氨基酸序列如SEQ IDNO2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明的突变体优选是突变体CNTF(A)和CNTF(B)。本发明的突变体蛋白还包括所述突变体的片段、同源物、类似物或衍生物。在一优选的实施方案中，所述的突变体包括SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
本发明的另一个方面提供了编码所述突变体的多核苷酸分子，其可选自(1)SEQ ID NO3或4所示的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO3或4有至少70％同源性的核苷酸序列；(3)与SEQ ID NO3或4所示的核苷酸序列杂交或互补的核苷酸序列；和(4)与SEQ ID NO3或4编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
优选地，本发明的多核苷酸分子包括SEQ ID NO3或4所示的核苷酸序列。
本发明进一步提供含有编码本发明突变体蛋白的多核苷酸分子的重组表达载体、包含被任何所述载体转化的宿主细胞，以及由其衍生的新的株系或细胞系。在一优选实施方案中，本发明提供一种包含编码本发明突变体蛋白的多核苷酸的重组原核表达载体pThioHisA/A或pThioHisA/B，以及遗传工程菌大肠杆菌BL 21。
本发明进一步提供制备本发明所述突变体蛋白的方法，所述的方法包括通过计算机分子模拟系统，采用同源模建对CNTF与CNTFRα结合的关键部位进行分析，同时综合了同源比较及对CNTF蛋白的溶解性、稳定性和免疫原性分析的结果，设计CNTF突变体，对人睫状神经营养因子的基因进行修饰改造，获得改造后突变人睫状神经营养因子基因的cDNA，人工合成该cDNA，构建重组质粒，转化大肠杆菌，进行诱导表达；以凝胶过滤或稀释复性的方法进行复性；以色谱法进行纯化，生产得到高纯度的睫状神经营养因子，所述的以色谱法进行纯化包括将复性后的样品，上Q.Sepharose FF阴离子交换柱进行纯化，收集洗脱峰，然后将收集的样品上Sephadex G-25柱，收集蛋白峰，得目标蛋白。其中，对其编码的一级结构进行改变，优选是选用大肠杆菌偏爱密码子改造修饰，使其获得高表达。
本发明进一步提供含有本发明睫状神经营养因子(CNTF)突变体作为活性成分的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体，所述的药学上可接受的载体对患者没有危险，不降解或不使有效成分失活或者不干扰有效成分的作用。优选的载体是生理盐溶液，但也可以施用其它药学上可接受的载体，并且易于由本领域技术人员所确定。
本发明的突变体蛋白可以配制成通过包括静脉内、皮下、肌肉、鞘内、鼻腔粘膜或口腔粘膜等药物传递途径的方式给药。优选本发明药物组合物借助注射肠胃外施用。在优选的实施方案中，肠胃外施用是皮下或肌内施用。其它施用的有效方法是施用静脉内注射剂，缓释肠胃外制剂，吸入雾剂或栓剂。在缓释制剂中，主要溶剂可以是含水或非水类型的。此外，载体可以含有保持或改变制剂的PH值，粘度，澄清度，颜色，无菌性，稳定性，分解速度或气味的其它药理学上可接受的赋形剂。同样，载体也可以含有改变或保持有效成分的稳定性，分解速度，释放或吸收的其它药理学上可接受的赋形剂。这些赋形剂是通常用来配制供肠胃外施用的药剂(单剂形式和多剂形式)的物质。
如上所提及的，优选本发明的肠胃外施用制剂形式为皮下注射剂或肌肉注射剂。最优选为皮下注射剂。为了获得有效成分的所需日剂量，采取单次或重复皮下或肌内注射是可能的。在本发明的一个优选的实施方案中，有效成分的剂量在10和1000μg/kg/天之间。为了治疗肥胖症，周期性地施用有效成分可能是合乎需要的。周期性地施用可以采取每月，每一两周，每周，每日或每小时施用一次的形式。施用所需的频率对基于标准的观测技术治疗患者的医生而言是显而易见的。
考虑按照本发明的药物制剂的口服也是可能的。在这种情况下，所施用的有效成分优选地是胶囊化的。可以胶囊化的有效成分可以用或不用通常用于制备固体药剂的载体配制。优选地，当生物利用度被最大化，同时前一系统降解被最小化时，胶囊以使得制剂的活性部分在胃肠道中释放的方式制备。所说的制剂也可以包含以有利于有效成分的吸收为目的的其它赋形剂，如稀释油，润滑剂，悬浮剂，胶囊分解剂或结合剂等。
特定的剂量按照患者的近似体重计算，而不依赖于施用方法。确定适当的治疗剂量所需的计算的其它工作由本领域普通技术人员按常规进行，他们可以获得这些结果而不需要过度的实验，尤其是在本文所提供的试验的教导下。
按照本发明，对肥胖患者施用治疗有效量的有效成分。如上所提及的，所需的剂量可以由本领域技术人员确定而无须过度的实验。“治疗有效量”可以被定义为足以引起足够的体重减轻并且导致代谢参数(如肥胖患者的血液葡萄糖水平)后续正常化的有效成分的量。
本发明进一步提供本发明的突变体在制备治疗肥胖症或与其相关的疾病的药物中的用途，其中所述的肥胖症包括饮食诱导的肥胖症和糖尿病相关的肥胖症。还包括所述的突变体在制备治疗青光眼或经变性性疾病的药物中的用途，其中所述的神经变性性疾病包括视网膜变性，以及运动神经元疾病、外周神经障碍、阿尔茨海默氏症、帕金森病、亨廷顿病等神经系统疾病和神经损伤。
本文中提到的突变体蛋白的“同源物”是指，多肽本来具有SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的氨基酸序列，但其中一个或多个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基保守地取代，并且所得到的多肽可用于实施本发明。保守氨基酸取代是本领域已知的。造成这样的取代的规则包含由Dayhof，M D.(1978，国家生物医学研究基金，Washington，D.C，第5卷，增刊3)等所述的取代规则。更具体地说，保守氨基酸取代发生在与其酸性、极性或侧链大小相关联的氨基酸家族内。一般可将遗传编码的氨基酸分为四组(1)酸性氨基酸一天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸一赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸一丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电的极性氨基酸-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同分类为芳香氨基酸。任何特定组内的一个或多个取代，例如用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、或用谷氨酸取代天冬氨酸、或用丝氨酸取代苏氨酸，或任何其他氨基酸残基结构上相关的氨基酸残基，例如有相似酸性、极性、侧链大小的，或在其某些组合方面有相似性的氨基酸残基取代，一般对多肽的功能或免疫原性不会有太大影响。
在本发明中，“类似物”被定义为，与SEQ ID NO5或SEQ ID NO6比较，具有一个或几个氨基酸取代，删除，转换或增加的分子。“衍生物”被定义为如下一种分子，它具有SEQID NO5或SEQ ID NO6类似物氨基酸序列，但是另外还具有化学修饰的一个或几个氨基酸侧链基团，α-碳原子，末端氨基或者末端羧酸基。化学修饰包括增加部分化学结构，生成新键或除去部分化学结构。对氨基酸侧链基团的修饰包括赖氨酸ε-氨基的酰基化，精氨酸，组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸的羧酸基的烷基化，以及谷氨酸胺或天冬酰胺的脱酰氨基。末端氨基的修饰包括脱氨基，N-低级烷基修饰，N-二低级烷基修饰和N-酰基修饰。对末端羧基的修饰包括酰胺修饰，低级烷基酰胺修饰，二烷基酰胺修饰和低级烷基酯修饰。低级烷基是C1-C4烷基。并且，还可以用蛋白质化学的普通技术人员熟知的保护基，保护一个或几个侧键基团或末端基团。还可以使氨基酸的α-碳原子单甲基化或二甲基化。
本文所用的术语“多核苷酸分子”是指单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，CDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。
生产和操作本文公开的多核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术(参见Maniatis等，1989，分子克隆，实验室分册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成。
本发明提供了编码所述突变体的多核苷酸分子，在进一步的优选实施方案中，本发明的编码突变体蛋白的多核苷酸分子包含选自下列成员的核苷酸序列(1)SEQ ID NO3或4所示的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO3或4所示的核苷酸序列至少70％相同、优选至少80％相同、更优选至少90％相同、最优选95％相同的核苷酸序列；(3)在中等严谨杂交条件下(即在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中于65℃与结合于滤膜的DNA杂交，并在0.2xSSC/0.1％SDS中于42℃洗涤的条件(参见Allsubel等，1989，分子生物学当前技术，第1卷，Green Publishing Assoclntes，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.，NY，P.2.10.3)；优选高度严谨杂交条件，即在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中于65℃与结合于滤膜的DNA杂交，并在0.1xSSC/0.1％SDS中于68℃洗涤的条件下与具有SEQID NO3或4或其互补序列的多核苷酸分子能杂交的核苷酸序列；或者(4)与SEQ ID NO3或SEQ ID NO4编码相同序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
可用于表达本发明的编码突变体蛋白的序列的各种表达载体是本领域已知的，其中包括含有特定编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA和粘粒DNA表达载体。可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型原核表达载体质粒包括pGEX、pQE、pET、pTrc99a、pBV220、pMAL、pRSET等。
可用于实施本发明的宿主细胞可以是真核或原核细胞。这样的已转化宿主细胞包括但不仅限于微生物，例如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA载体转化的细菌，或者用重组载体转化的酵母，或者是动物细胞，如用重组病毒载体如杆状病毒感染的昆虫细胞，或用重组病毒载体如腺病毒或痘菌病毒感染的哺乳动物细胞等。例如，可使用大肠杆菌菌株，如DH5a菌株。真核宿主细胞包括酵母细胞，但也可有效地利用小鼠、仓鼠、牛、猴或人细胞系等哺乳动物细胞。可用于表达本发明的重组蛋白质的真核宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等。
图1CNTF-CNTFRα复合物结构示意图ACNTFRα分子的骨架结构，BCNTF分子的骨架结构。
层状区域表示β折叠，柱状区域表示α螺旋。
图2纯化过程电泳图泳 道1超滤前；泳道2超滤后；泳道3稀释复性Q柱穿透；泳道4稀释复性Q柱峰；5泳道稀释复性G-25峰；泳道6凝胶过滤复性Q柱峰；泳道7凝胶过滤复性G-25峰。
图3鸡胚背根神经节实验结果1.为阴性对照，2.为阳性对照，3.为蛋白A结果，4.为蛋白B的结果图4给药各组小鼠摄食量变化情况图5给药各组小鼠体重增长率情况图6对照组与各剂量组老鼠形态比较1对照组与500μg/kg/d组比较；2对照组与250μg/kg/d组比较；3对照组与125μg/kg/d组比较；4对照组与62.5μg/kg/d组比较；5对照组与31.25μg/kg/d组比较。
图7给药各组小鼠所取下的两侧睾丸周围脂肪图8A蛋白量效研究中给药各组小鼠摄食量变化情况具体实施方式
到现在为止，已经给出了本发明的一般性描述。借助于下列实施例，参照特定的实施方案，以下给出更详细的说明，目的是为了更好地理解本发明的目的，特征，优点和操作方法。然而，无意于将本发明的范围限定在此范围内。在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1计算机辅助的CNTF突变体设计一、晶体结构及氨基酸序列的数据库检索CNTF的晶体结构、IL-6的晶体结构、IL-6R的晶体结构及IL-6-IL-6R的晶体结构取自结构数据库(STRUCTURE DATE BASE)。hCNTF，hCNTFRα，hIL-6，hIL-6R，鼠CNTF，鸡CNTF，猪CNTF，兔CNTF等的氨基酸序列取自蛋白质序列数据库(PDB)。
二、三维结构的模建1、hCNTFRα空间结构的模建经过数据库搜索和序列比较，发现PDB数据库中与CNTFRα序列同源性最高的是IL-6R，它们的序列同源性是30％，完全可以以IL-6R的晶体结构为模板来模建CNTFRα的三维结构。模建采用的程序是MODELER。
所有计算工作均使用了BIOSYM/MSI分子模拟系统，采用的是InsightII软件包(version2000)，序列搜索程序是FASTA3.0。所用的计算机是SGI Origin 300图形工作站。
2、CNTF突变体的分子设计2.1 CNTF-CNTFRα复合物结构模型的初步建立在以IL-6R的结构为模板，模建了CNTFRα的结构之后。利用这个模建的CNTFRα结构，以及数据库中存放的已经测定的CNTF的结构，可以建立CNTF-CNTFRα复合物的模型。以数据库中搜索到的IL-6-IL-6R的复合物结构为参考模型，搭建初始的CNTF-CNTFRα复合物的模型。
CNTF-CNTFRα复合物的模型采用了结构叠合的方法。首先以IL-6-IL-6R复合物结构为模型，分别用CNTF的结构向复合物中的IL-6分子，CNTFRα向复合物中的IL-6R分子做结构叠合，叠合时以分子的主链结构作为结构比较对象。
通过分子的结构叠合，得到了原始的CNTF-CNTFRα复合物的模型(见图1)，这个模型尚有一定的错误和误差，需要对错误做尽可能的优化。模型的优化在Discover模块下进行，力场选用CVFF。优化采用分子力学的方法，先用最陡下降法，后用共轭梯度法。将优化后的模型作为建立的CNTF-CNTFRα复合物结构的初步模型。
2.2 CNTF与受体结合的部位的确定及CNTF的分子设计利用建立的初步的CNTF-CNTFRα复合物结构模型，可以分析CNTF-CNTFRα的作用情况，因为建立的是初步的复合物模型，所以能够大致了解CNTF分子中负责与受体结合的区域。
首先计算了CNTF-CNTFRα复合物结构模型中CNTF与CNTFRα残基的距离，根据残基的距离判定残基是否参与了分子间作用情况。经过考察残基之间的空间距离后，可以大致确定，CNTF与受体结合的区域主要在螺旋D(152-181)、ABloop(44-64)和螺旋A(13-41)。根据上述对CNTFRα及CNTF-CNTFRα的分子模拟，并参照兔、鸡、猪的CNTF序列，基本确定了CNTF分子中与受体结合的重要氨基酸区域。同时结合CNTF自身序列的特点，考虑到表达蛋白的稳定性、溶解性及免疫原性，设计两个突变体如下CNTF蛋白突变体A17位的Cys突变为Ser、53位的Ala突变为Val、C末端去掉16个氨基酸CNTF蛋白突变体B17位的Cys突变为Ser、35位的Thr突变为Met、178位的Phe突变为Val、C末端去掉16个氨基酸将CNTF氨基酸序列中17位的半胱氨酸突变为丝氨酸是为了避免出现二聚体，为将来纯化带来不便。同时该位点的突变也增加了蛋白在缓冲液中的稳定性；采用C末端截断的形式，不影响其活性，但是有效地减少了其分子量，降低了免疫原性。
实施例2CNTF突变体的构建和表达1、用PCR的方法获得CNTF突变体A和B的DNA1.1PCR引物的设计与合成采用重叠延伸PCR的方法，针对突变体A和B的突变位点分别设计引物。引物两端分别设计了Nde I和Sal I的酶切位点。
1.2 CNTF突变体A和B的PCR扩增结果以CNTF DNA(其核苷酸序列如SEQID NO1所示)为模板进行PCR反应，扩增反应分几步进行，采用pyrobest DNA聚合酶。经琼脂糖凝胶电泳鉴定在600bp处可见一明显的扩增带，与目的片段大小一致。
2、pMD-18T/A及pMD-18T/B克隆质粒的构建2.1 CNTF突变体A及B的PCR产物的回收采用Promega公司的WizardRSV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒，操作按其说明书进行。回收的片段大小约为600bp。
2.2 CNTF突变体A及B的PCR产物与pMD-18T载体质粒的连接反应将回收的PCR产物与载体质粒pMD-18T(购自大连宝生物公司)连接，反应体系如下pMD-18T质粒1μl，A(B)回收产物2μl，Solution I 5μl，补ddH2O至10μl，混匀后，16℃水浴反应1小时。
2.3 大肠杆菌DH5α感受态的制备及转化取100μl制备好的大肠杆菌DH5α感受态细菌加入10μl连接产物，轻轻旋动，并于冰上放置10min，然后于42℃水浴热击90sec，再次冰浴3min，，加入0.8mlLB培养基，37℃200转/分培养1h，用玻璃棒将转化的细菌涂布于含有Amp抗性的LB平板上，37℃培养12-16h。
2.4 pMD-18T/A及pMD-18T/B克隆质粒的双酶切鉴定(Nde I和Sal I)挑取Amp抗性的LB平板上的阳性克隆，接种于5ml含Amp抗性的LB液体培养基，37℃200转/分过夜培养。用质粒小量提取试剂盒(购自天为时代公司)(碱裂解法)进行DNA的小量制备，用Nde I和Sal I双酶切质粒，产物进行琼脂糖电泳鉴定。酶切结果显示目的片段A及B已克隆进pMD-18T载体。
2.5 pMD-18T/A及pMD-18T/B克隆质粒的序列测定DNA的测序结果证实了扩增的目的片段的正确性。
3、pThioHisA/A及pThioHisA/B表达质粒的构建3.1 pMD-18T/A及pMD-18T/B和pThioHisA的双酶切酶切反应体系如下pMD-18T/A及pMD-18T/B(pThioHisA(宿主菌为大肠杆菌DH5α株和BL21株))20μl，10×H buffer 6μl，Nde 1μl，Sal 1μl，补ddH2O至60μl，混匀后，37℃水浴反应4小时。取2μl用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
3.2 回收酶切片段酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自QIAGEN公司)进行回收。pThioHisA质粒回收约4.5Kb的片段，pMD-18T/A及pMD-18T/B则回收大约600bp的片段3.3 连接反应反应体系如下pThioHisA质粒片段2μl，切下的A及B片段4μl，10×buffer 1μl，T4DNALigase 1μl，补ddH20至10μl，混匀后，16℃水浴过夜反应。
3.4 感受态细菌的制备及转化感受态细菌的制备及转化同上。
3.5 pThioHisA/A及pThioHisA/B表达质粒的双酶切鉴定(Nde I和Sal I)方法同上。酶切图谱证实目的片段已经成功克隆进表达载体4、pThioHisA/A及pThioHisA/B在大肠杆菌BL21中的表达4.1 将鉴定正确的pThioHisA/A及pThioHisA/B转化大肠杆菌BL21大肠杆菌BL21感受态的制备方法及转化方法同前所述。
4.2 pThioHisA/A及pThioHisA/B在宿主菌BL21中的表达分别从两转化平板中挑取单克隆的菌落接种3ml含氨苄青霉素的液体培养基中，37℃过夜活化。次日按1％的比例转接于3ml新鲜的含氨苄青霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600达0.5-0.8时，加入IPTG，使其终浓度达到1mmol/L，诱导表达4-6小时后离心收集菌体，进行15％的SDS-PAGE电泳分析。
经凝胶黑度扫描分析，目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的30％以上。分子量为21KD左右，与理论分子量一致。说明构建是成功的，目的蛋白得到了表达。
实施例3重组蛋白复性及纯化工艺的建立A和B两种蛋白的复性纯化方法路线相同，以下仅以A蛋白为例进行介绍。
1.pThioHisA/A及pThioHisA/B工程菌的发酵培养的摸索为了探索更好的发酵条件，在实验中分别采用三种不同的条件进行发酵。以期找到合适的方法，为今后的产业化工艺摸索打基础。
A.发酵培养基为LB培养基，低密度表达工艺。
B.发酵培养基为M9-4培养基，高密度表达工艺。
C.发酵培养基为M9-4培养基，低密度表达工艺。
发酵流程活化种子→一级种子液(LB)→二级种子液(LB)→上罐(发酵培养基)→诱导→收获1.1 活化种子将保存的甘油菌株划含Amp的平板，37℃培养约16个小时，挑单克隆接种于含3ml(Amp)LB液体培养基的中试管中。在37℃，200rpm的条件下培养10-12个小时，以1％的比例转种一次，在相同的条件下培养4个小时。
1.2 发酵培养发酵罐20L的发酵罐(BioFloIV)中采用的工作体积为12L上罐前调试校正pH电极和溶氧电极，设定参数溶氧大于50％。
转速250-600rpm连动起始pH6.8-7.2温度37℃接种由摇瓶培养获得的种子液，接种量为发酵罐工作体积的2.5％，加入MgSO4及微量元素。
发酵过程PH值自动流加4M的氨水，使pH保持在7.0左右。
补料以甘油作为碳源，分别在刚入罐时和诱导后两次流加。数据由电脑自动收集记录。
诱导低密度诱导时，在OD600达到3时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导表达；高密度诱导时，在OD600达到10时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导表达。
收获诱导3小时后，，终止发酵。发酵液在4℃、10000rpm的条件下，以连续流的方式进行离心，收集沉淀的菌体。
在进行发酵工艺时，比较了不同的培养基以及不同的诱导条件对目的蛋白表达的影响，结果见表1表1 发酵条件的摸索
从表1结果来看，采用LB培养基时，不论是表达水平，还是包涵体重量，都要明显优于M9-4培养基，而且诱导时的OD值低，整个发酵工艺时间短。而采用M9-4培养基时，诱导时的OD对最终的表达水平、包涵体重量，以及湿菌体重量影响较大，高密度发酵结果要优于低密度发酵，但最终的包涵体得率很低，因此选择LB培养基作为中试发酵的培养基。
2.包涵体的获取按照菌体的重量，量取20倍量的20mMTris-HCL(8.0)+1mMEDTA重悬后，利用高压均质机压榨，50-55Mpa，循环3-4次，镜检，破菌率达95％以上即可。
3.包涵体的洗涤，溶解超声破碎得到的包涵体用含2M尿素，1％Triton 100，5mM EDTA，20mMTris-HCl，pH8.0的液体进行2次洗涤，以去除杂蛋白，洗涤后离心得包涵体。洗涤后的包涵体，分别采用两种溶解条件进行溶解。一是用8M的尿素溶解，另一是用7M的盐酸胍。考察哪种方法对包涵体的溶解更好，更完全。结果7M盐酸胍溶解的速度快，完全，而尿素溶解速度慢，不完全。所以，采用7M的盐酸胍作为最终的包涵体溶解液。
4.包涵体的复性研究4.1 凝胶过滤复性包涵体溶解液过0.45um的滤膜后直接上Sephacryl-S200柱(26mm×100cm)进行复性，流速为2.5ml/min。上样体积为柱床体积的2％。复性液含250mM NaCl，5mM EDTA，0.1％Tween-80，50mM Tris-HCl(pH8.0)。收集CNTF蛋白峰。将得到的样品以50mMTris-HCL(8.0)为流动相过Sephadex G-25(5.0cm×50cm)，收集蛋白峰。结果表明，S-200在柱上复性的同时起到了去除杂质的作用，在后面的峰中得到了纯度和浓度相对较好的复性后蛋白。
4.2 稀释复性包涵体溶解液用50mM Tris-HCl(pH8.0)+0.1％Tween-80+1mMEDTA加入，10倍稀释后，离心收上清(12000rpm，20min，4℃)，上清按上一步骤再做一次10倍稀释，离心收上清。得到的复性液用超滤膜包超滤，收集浓缩回流液。稀释过程中的离心上清和沉淀及超滤前后的溶液分别留样，进行SDS-PAGE分析。电泳结果表明，稀释复性沉淀的大部分为杂蛋白，离心后的上清能回收绝大部分的目标蛋白。所以，稀释复性在复性的同时去除了杂蛋白，为下面的纯化减轻了压力。是一种方便，简单，易行的适合于放大生产的好方法。
稀释复性的方法较之凝胶过滤复性的方法大大增加了样品处理量，因此更省时，更利于放大且回收率高，适合进行产业化研究的需要。
表2 稀释复性各步纯化得率
5.CNTF蛋白的纯化5.1Q.Sepharose FF层析复性后的样品，上Q.Sepharose FF阴离子交换柱(26mm×5cm)进行纯化。由AKTA explore蛋白纯化系统控制流速为7.5ml/min；以流动相A(50mMTris-HCl，pH8.0)；流动相B(50mMTris-HCl，1MNaCl，pH8.0)进行15个柱床体积的线性梯度洗脱。收集洗脱峰，取样行非还原SDS-PAGE。
5.2 Sephadex G-25层析Q柱收集峰上Sephadex G-25(2.6cm×30cm)，流动相为20mMPB(7.4)，收集蛋白峰。得目标蛋白。
电泳结果(见图2)表明，经过凝胶过滤和稀释复性两种方法的处理后，蛋白在复性的同时都得到了一定程度的纯化。再经过离子交换层析和脱盐后得到的原液的电泳纯度均大于95％。
6.质粒稳定性实验将保存的甘油菌株划含Amp的平板，37℃培养约16个小时，挑单克隆接种于含3ml(Amp)LB液体培养基的中试管中。在37℃，200rpm的条件下培养待OD600达0.6时，稀释菌液106倍，然后取200μl涂布普通LB平板。37℃过夜培养。之后，随机挑取100个单克隆依次分别接入普通LB平板和含有氨苄抗性的LB平板，37℃过夜培养。观察两种平板中菌落的生长情况，记录个平板生长的菌落数[36]。在普通LB平板上，随机挑取57个菌落进行全菌PCR。每一个PCR的反应体系为20μl。反应完毕时，将其产物进行1％的琼脂糖电泳，观察各个菌体中表达质粒的稳定性。
携带表达质粒的宿主菌在Amp-及Amp+的固体培养基均为100％生长。全菌PCR反应完毕后，将其产物进行1％的琼脂糖电泳，结果表明，携带有表达质粒的宿主菌是稳定的，所挑取的57个单菌落中，只有一个发生了表达质粒的丢失，丢失率为1.75％。
实施例4CNTF突变体蛋白的理化性质及生物学活性检测1、CNTF突变体蛋白的理化性质检测(见表3)1.1 CNTF突变体蛋白氨基酸序列的测定采用Edman降解法对纯化后的蛋白进行N末端的15个氨基酸的序列测定。结果为AFTEHSPLTPHRRDL。这个结果与理论完全一致。
1.2 CNTF突变体蛋白免疫印记检测表达的CNTF(A)及CNTF(B)分别进行免疫印记检测，结果显示抗CNTF的单克隆抗体能与CNTF(A)及CNTF(B)蛋白特异性结合，说明构建、表达和纯化是成功的。
1.3 CNTF突变体蛋白分子量的测定1.3.1SDS-PAGE法按2000年版《中国生物制品规程》附录方法进行。
CNTF(A)电泳的表观分子量为22.722kd，理论分子量为21.08kd；CNTF(B)电泳的表观分子量为21.439kd，理论分子量为21.16kd，以上两蛋白的分子量检测均符合要求。
1.3.2 质谱法
以CNTF(A)为例，质谱法测得的分子量为21078.57±1.57。与理论分子量的差异小于万分之一，符合要求。
1.4 CNTF突变体蛋白的纯度测定1.4.1 SDS-PAGE法SDS-PAGE法按照2000年版《中国生物制品规程》附录方法进行。经凝胶扫描分析，两种蛋白的纯度均在95％以上。
1.4.2 RP-HPLC法采用Waters2695-2487系统，色谱柱为S/N E 960206-7-1PROTEIN C4。进样为1mg/ml的蛋白，100μl。A液为0.1％的TFA水，B液为0.1％TFA+80％的乙睛。经反向高效液相色谱分析表明，纯化得到的CNTF(A)的纯度大于95％，完全符合要求。
1.5 CNTF突变体蛋白的等电点测定等电聚焦电泳法和毛细管电泳法测定等电点均按照2000年版《中国生物制品规程》附录方法进行。结果显示A和B蛋白的理论等电点在5.85-6.55之间，与理论一致。
1.6 紫外光谱扫描用分光光度计对CNTF突变体蛋白进行紫外全波长扫描。两种蛋白的紫外全波长扫描的结果均呈现单一峰型，且最大吸收的位置分别在279和274nm，表明我们得到的纯化后样品的主要成分是蛋白，符合要求。
1.7 CNTF突变体蛋白的二级结构分析用圆二色谱仪分析CNTF突变体蛋白的二级结构。结果显示蛋白为100％的α螺旋结构。结果与理论完全一致。
1.8 蛋白含量检测按试剂盒说明书进行。测得的蛋白含量为1.15mg/ml。
1.9 细菌内毒素检查采用凝胶法检查细菌内毒素。方法按照2000年版《中国生物制品规程》中生物制品细菌内毒素试验规程进行。1mgCNTF蛋白细菌内毒素含量＜10EU。
1.10 肽图分析采用Waters2695-2487系统，Symmetry300TMC18(3.9×150mm)柱，参照2000年版《中国生物制品规程》附录方法进行。用得到的A蛋白的两批原液20050601和20050602在胰酶切割后进行肽图分析，结果表明，两批原液酶切后的肽图谱在峰形、数目及保留时间上均呈现良好的同一性，符合要求。
表3 CNTF突变体的理化性质检测汇总
2、生物学活性检测2.1 鸡胚背根神经节法用鸡胚背根神经节无血清培养法测定表达蛋白的生物学活性。解剖镜下取八日龄鸡胚背根节接种于涂有鼠尾胶原的培养瓶中，每瓶种3-5个神经节，37℃保温2小时，将CNTF表达蛋白用无血清DMEM培养液作倍比稀释，稀释至出现阴性结果，并用NGF标准品作阳性对照，同时以无血清DMEM培养液为阴性对照，置37℃，5％CO2孵箱培养24小时，倒置显微镜下观察结果。根据神经节突起生长的不同程度作分级记录。
结果如图3所示，由图可见，阴性对照中鸡胚背根神经节边缘无突起生长，而阳性对照和我们所表达并纯化的CNTF蛋白A和B都能促进鸡胚背根神经节的生长，与阳性对照NGF标准品相比，大概是CNTF蛋白A和B1μg相当与标准品的1AU，说明其具有生物学活性，复性纯化是成功的。
2.2 以正常小鼠的减重法检测CNTF突变体蛋白的活性2.2.1 昆明种小鼠对不同突变蛋白的反应各组结果首先进行方差齐性检验，方差齐者用F检验比较组间异同；方差不齐者，用近似F检验。如组间差异显著，用q检验进行样本均数的两两比较。本实验中采用SPSS 11.0 forwindows统计软件进行处理。
2.2.1.1 分组及给药昆明种小鼠(健康，雄性，平均体重为19-21克)第一组9只，NS，ip 0.1ml/10g
第二组8只，CNTF(A)，ip 1000μg/kg/d，0.1ml/10g第三组8只，CNTF(B)，ip 1000μg/kg/d，0.1ml/10g2.2.1.2 检测指标2.2.1.2.1 体重，摄食量给药0-10d每天定时记录小鼠体重及24h摄食量。CNTF(A)和CNTF(B)给药0天和10天小鼠体重情况如表4所示。
体重减少率＝(对照组10天体重-受试组10天体重)/对照组10天体重表4 CNTF(A)和CNTF(B)给药0天和10天小鼠体重情况
备注*表示P＜0.01表4表明给药10天后，对照组与CNTF(A)给药组和CNTF(B)给药组在体重上有极显著的差异。说明A、B两种蛋白对小鼠都有明显的体重减轻作用。但从体重减少率上来看，A蛋白的减重作用要优于B蛋白。
给药各组小鼠摄食量变化如图4所示，由图可知，A蛋白和B蛋白与空白对照组相比，都可使小鼠的摄食量明显降低。但A蛋白的降低作用更为明显。
2.2.1.2.2 脂肪指数测定小鼠处死后取两侧睾丸周围脂肪，称湿重，并计算脂肪指数。结果见表5。
脂肪指数(mg/10g)＝脂肪重量(mg)/体重(g)×10表6 给药10天后各组脂肪指数情况
以上结果表明，两种蛋白均有显著地使小鼠脂肪指数降低的作用，p＜0.05。但CNTF(A)给药组的脂肪指数要明显低于CNTF(B)给药组的脂肪指数，说明CNTF(A)蛋白的作用要优于CNTF(B)蛋白。
2.2.1.2.3 动物行为及脏器观察实验期间随时观察小鼠每天的饮食情况，精神活动及粪便干稀程度。实验结束时处死小鼠，检查各脏器，包括其肝、肾、脾、心脏等。结果表明，实验期间，动物各项行为，包括饮水，精神活动正常，粪便无异常。实验结束时处死动物，检查各脏器，动物的肝、肾、脾、心脏等均正常，肝脏色泽鲜红、光滑。
2.2.2 CNTF(A)的量效关系研究2.2.2.1 分组及给药昆明种小鼠(健康，雄性，平均体重为19-21克)第一组正常对照组，10只(NS，ip 0.1ml/10g)第二组CNTF(A)，8只(500μg/kg/d ip 0.1ml/10g)第三组CNTF(A)，8只(250μg/kg/d ip 0.1ml/10g)第四组CNTF(A)，8只(125μg/kg/d ip 0.1ml/10g)第五组CNTF(A)，8只(62.5μg/kg/d ip 0.1ml/10g)第六组CNTF(A)，8只(31.25μg/kg/d ip 0.1ml/10g)一日量分2次给予，早晚各1次。
2.2.2.2 检测指标数据处理及统计方法同上。
2.2.2.2.1 体重、摄食量给药0-10d每天定时记录小鼠体重及24h摄食量。
2.2.2.2.2 血糖浓度，胆固醇，甘油三酯给药第10天21:00各组小鼠禁食；第11天7:00给药，9:00眼球采血，血样4℃放置20min，8000r/min低温离心8min，取血清采用全自动生化分析仪测定上述指标(mmol/L)。
2.2.2.2.3 脂肪指数小鼠处死后取两侧睾丸周围脂肪，称湿重，并计算脂肪指数。计算方法同前。
2.2.2.2.4 动物行为及脏器观察实验期间随时观察小鼠每天的饮食情况，精神活动及粪便干稀程度。实验结束时处死小鼠，检查各脏器，包括其肝、肾、脾、心脏等。
2.2.2.3 CNTF(A)的量效关系研究第一次试验2.2.2.3.1 体重方面I.不同剂量CNTF(A)对小鼠体重的影响，结果见表6。
体重增长率＝(受试动物某日体重-受试动物0天体重)/受试动物0天体重表7 不同剂量CNTF(A)给药5天和10天后的体重情况
备注#表示p＞0.05，*表示p＜0.05结果表明，实验5天时对照组与，125.00，250.00，500.00μg/kg/d组相比体重增长率有显著性差异。与31.25和62.50μg/kg/d组比较差异不显著。实验10天时，对照组与62.50，125.00，250.00，500.00μg/kg/d组相比体重增长率有显著性差异，而与31.25μg/kg/d组相比无明显差异。
图5更为直观地反映了给药各组与空白对照组相比体重增长率的情况。从图中可以明显看出空白对照组与62.50，125.00，250.00，500.00μg/kg/d组相比体重增长率有显著性差异。与31.25μg/kg/d组比较差异不显著。
从对照组与给药组体重增长率的比较结果来看，除低剂量的31.25μg/kg/d组外，其它各给药组均能有效的抑制小鼠的体重增长。
II.CNTF(A)给药5天时对小鼠的减重作用，结果见表7。
某日体重减少量＝受试组某日体重-对照组某日体重某日体重减少率＝某日体重减少量/对照组某日体重×100％表8 CNTF(A)给药5天时小鼠的体重情况
采用SIGMAPLOT软件，以四参数方程拟和表7的数据，经分析得到给药5天时，CNTF(A)的半数有效浓度是150.986μg/kg/d。
III.CNTF(A)给药8天时对小鼠的减重作用，结果见表8。
量值的计算方法同上。
采用SIGMAPLOT软件，以四参数方程拟和表8的数据，经分析得到给药8天时，CNTF(A)的半数有效浓度是149.048μg/kg/d。
表9 CNTF(A)给药8天时小鼠的体重情况
IV.CNTF(A)给药10天时对小鼠的减重作用，结果见表9。
量值计算方法同上。
表10 CNTF(A)给药10天时小鼠的体重情况
采用SIGMAPLOT软件，以四参数方程拟和表9的数据，经分析得到给药10天时，CNTF(A)的半数有效浓度是149.771μg/kg/d。
表7-表9的三组数据表明各实验组在给药的5天，8天，10天均有体重的减轻，且程度与给药剂量及受药天数呈明显的依赖关系。
V.给药10天对照组与各实验组体重比较，结果见表10。
表11 不同剂量的CNTF(A)给药10天各组体重情况
上表的结果表明，给药10天后，对照组的体重与实验1组，实验2组，实验3组，实验4组的体重均有显著的差异p＜0.05，而与实验5组相比则无显著性差异p＞0.05。说明小鼠的减重作用与A蛋白的施用剂量呈现良好的剂量依赖关系。
从对照组与各剂量组老鼠形态比较的结果来看(图6)，对照组小鼠明显比500μg/kg/d，250μg/kg/d，125μg/kg/d，62.5μg/kg/d组的小鼠肥胖，而对照组与31.25μg/kg/d组的小鼠比较则差异不明显，这与前面的在体重测定方面的结果相吻合。
2.2.2.3.2 脂肪指数方面不同剂量CNTF(A)对小鼠的影响，结果见表11。
小鼠处死后，取两侧睾丸周围脂肪，称湿重，并计算脂肪指数。
脂肪指数＝脂肪重量(mg)/体重(g)×10
表12 不同剂量CNTF(A)给药10天后小鼠脂肪指数情况
上表的数据表明，125.00，250.00和500.00μg/kg/d组与对照组相比，可使小鼠的脂肪指数明显下降。而31.25和62.50μg/kg/d组与对照组相比，对小鼠脂肪指数的降低则无显著的作用。
取下的脂肪的照片(图7)直观的反映了上述的结果，其中125.00，250.00和500.00μg/kg/d组与对照组的差异显著，而其它两组则不明显。
2.2.2.3.3 摄食量方面不同剂量CNTF(A)对小鼠的影响，结果见表12和图8。
表13 不同剂量CNTF(A)对小鼠摄食量的影响
由以上的图表可知，与空白对照组相比，500μg/kg/d组，250μg/kg/d组和125μg/kg/d组给药后，小鼠的摄食量降低，其中500μg/kg/d组和250μg/kg/d组降低较为明显。其它的两组给药后，摄食量与空白对照组相比无明显的变化。
2.2.2.3.4 血清生化指标不同剂量CNTF(A)对小鼠的影响，结果见表13。
表14 不同剂量CNTF(A)对小鼠血清生化指标的影响
以上结果表明，A蛋白能引起血糖水平的降低，125.00、250.00和500.00μg/kg/d组结果较为明显。但对于甘油三酯、胆固醇的水平无明显作用。
2.2.2.3.5 动物行为及脏器观察实验期间，动物各项行为，包括饮水，精神活动正常，粪便无异常。实验结束时处死动物，检查各脏器，动物的肝、肾、脾、心脏等均正常，肝脏色泽鲜红、光滑。
序列表<110>中国药品生物制品检定所<120>睫状神经营养因子(CNTF)突变体及其生产方法和用途<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>600<212>DNA<213>Human<400>1atggctttca cagagcattc accgctgacc cctcaccgtc gggacctctg tagccgctct 60atctggctag caaggaagat tcgttcagac ctgactgctc ttacggaatc ctatgtgaag120catcagggcc tgaacaagaa catcaacctg gactctgcgg atgggatgcc agtggcaagc180actgatcagt ggagtgagct gaccgaggca gagcgactcc aagagaacct tcaagcttat240cgtaccttcc atgttttgtt ggccaggctc ttagaagacc agcaggtgca ttttacccca300accgaaggtg acttccatca agctatacat acccttcttc tccaagtcgc tgcctttgca360taccagatag aggagttaat gatactcctg gaatacaaga tcccccgcaa tgaggctgat420gggatgccta ttaatgttgg agatggtggt ctctttgaga agaagctgtg gggcctaaag480gtgctgcagg agctttcaca gtggacagta aggtccatcc atgaccttcg tttcatttct540tctcatcaga ctgggatccc agcacgtggg agccattata ttgctaacaa caagaaaatg600<210>2<211>200<212>PRT<213>Human<400>2Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu1 5 10 15Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr20 25 30Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile35 40 45
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权利要求
1.一种睫状神经营养因子(CNTF)突变体，其特征在于其中第17位半胱氨酸变为丝氨酸，并去掉C端的16个氨基酸。
2.根据权利要求1的突变体，所述的突变体进一步包括第53位的丙氨酸变为缬氨酸。
3.根据权利要求1的突变体，所述的突变体进一步包括第35位的苏氨酸变为蛋氨酸，第178位的苯丙氨酸变为缬氨酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的突变体，所述的睫状神经营养因子是人睫状神经营养因子(hCNTF)。
5.根据权利要求1或2的突变体，其包括SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1或3的突变体，其包括SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
7.一种编码权利要求1，2，4或5任一所述的突变体的多核苷酸分子，其特征在于，选自(1)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO3有至少70％同源性的核苷酸序列；(3)与SEQ ID NO3所示的核苷酸序列杂交或互补的核苷酸序列；或(4)与SEQ ID NO3编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
8.一种编码权利要求1，3，4或6任一所述的突变体的多核苷酸分子，其特征在于，选自(1)SEQ ID NO4所示的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO4有至少70％同源性的核苷酸序列；(3)与SEQ ID NO4所示的核苷酸序列杂交或互补的核苷酸序列；或(4)与SEQ ID NO4编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
9.一种重组表达载体，含有权利要求7或8所述的多核苷酸分子。
10.根据权利要求9的表达载体，所述的表达载体是原核表达载体。
11.根据权利要求10的表达载体，所述的原核表达载体是pThioHisA/A或pThioHisA/B。
12.一种宿主细胞，含有权利要求9-10中任一项所述的表达载体。
13.根据权利要求12的宿主细胞，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
14.根据权利要求13的宿主细胞，所述的大肠杆菌是大肠杆菌BL21。
15.制备权利要求1-6中任一项所述突变体的方法，包括下述步骤通过计算机分子模拟系统对CNTF与CNTFRα结合的关键部位进行分析，辅助设计，对人睫状神经营养因子的基因进行修饰改造，获得改造后突变人睫状神经营养因子基因的cDNA，人工合成该cDNA，构建重组质粒，转化大肠杆菌，进行诱导表达；以稀释复性的方法进行复性；以色谱法进行纯化，生产得到高纯度的睫状神经营养因子。
16.权利要求15所述的方法，所述的以色谱法进行纯化包括将复性后的样品，上Q.SepharoseFF阴离子交换柱进行纯化，收集洗脱峰，然后将收集的样品上Sephadex G-25柱，收集蛋白峰，得目标蛋白。
17.权利要求16所述的方法，所述的对人睫状神经营养因子的基因进行修饰改造是对其编码的一级结构进行改变第17位半胱氨酸变为丝氨酸，并去掉C端的16个氨基酸。
18.根据权利要求17所述的方法，所述的改变进一步包括第53位的丙氨酸变为缬氨酸。
19.根据权利要求17所述的方法，所述的改变进一步包括第35位的苏氨酸变为蛋氨酸，第178位的苯丙氨酸变为缬氨酸。
20.根据权利要求17-19中任一项的方法，所述的对其编码的一级结构进行改变是选用大肠杆菌偏爱密码子改造修饰，使其获得高表达。
21.一种药物组合物，含有权利要求1-6任一项所述的突变体作为活性成分以及药学上可接受的载体。
22.根据权利要求21的药物组合物，所述药物组合物的给药方式选自静脉内给药、皮下给药、肌肉给药、鞘内给药或粘膜给药。
23.根据权利要求22的药物组合物，所述的粘膜给药选自鼻腔粘膜给药或口腔粘膜给药。
24.根据权利要求21的药物组合物，所述药物组合物的制剂形式选自口服制剂或肠胃外制剂或其相应的缓控释制剂。
25.根据权利要求24的药物组合物，所述药物组合物的肠胃外制剂选自注射剂、吸入雾剂、冻干制剂或其缓控释制剂。
26.权利要求1-6中任一项所述的突变体在制备治疗肥胖症或与其相关的疾病的药物中的应用。
27.根据权利要求26的应用，所述的肥胖症包括饮食诱导的肥胖症或糖尿病相关的肥胖症。
28.权利要求1-6中任一项的突变体在制备治疗青光眼的药物中的应用。
29.权利要求1-6中任一项的突变体在制备治疗神经变性性疾病的药物中的应用。
30.根据权利要求29所述的应用，其中所述的神经变性性疾病包括视网膜变性、运动神经元疾病、外周神经障碍、阿尔茨海默氏症、帕金森病、亨廷顿病等神经系统疾病或神经损伤。
全文摘要
本发明涉及一种重组睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophic factor，CNTF)突变体，所述突变体的第17位半胱氨酸变为丝氨酸，并去掉C端的16个氨基酸，该突变体进一步可包括第53位的丙氨酸变为缬氨酸或第35位的苏氨酸变为蛋氨酸和第178位的苯丙氨酸变为缬氨酸，优选所述的突变体为CNTF(A)和CNTF(B)，还涉及制备纯化该突变体的方法，以及该突变体在治疗肥胖症或与肥胖症相关的疾病及神经损伤相关疾病中的用途。
文档编号C12N15/12GK1760205SQ20051009798
公开日2006年4月19日 申请日期2005年9月2日 优先权日2005年9月2日
发明者王军志, 饶春明, 毕华, 袁力勇, 李永红, 韩春梅, 刘兰, 史新昌 申请人:中国药品生物制品检定所