专利名称：一种新型神经营养因子及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型神经营养因子的克隆、制备与应用，涉及遗传工程领域，属于 生物技术领域。
背景技术：
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是主要作用于外周神经系统的感觉和 交感神经元的蛋白质，通过细胞表面特异受体支持靶神经元的生存、促进神经突起的生长 和增强神经元的分化。NGF的作用导致神经元细胞膜结构、蛋白磷酸化状态和特定基因表 达水平的改变。前脑胆碱能神经元也是NGF的靶细胞，并且NGF的营养支持作用是必须的。 NGF及其受体在中枢神经系统的分布和发育学特点表明，NGF是基底前脑胆碱能神经元的 靶源性神经营养因子。继NGF被发现之后，又有许多神经营养因子被鉴定出来，包括脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、睫状神经营养因子(ciIiarneurotrophic factor，CNTF)、胶质源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophicfactor，⑶NF) 等。除了营养支持作用，近些年对神经营养因子功能研究的突破在于，神经营养因子可以调 控神经突触可塑性，参与学习和记忆的形成。神经营养因子改变参与大量神经系统疾病的发生发展。神经营养因子已经广泛用 于神经系统疾病模型的治疗，效果明确。相关临床实验也在进行之中，BDNF用于治疗脊髓 侧索硬化症的三期临床实验表明高剂量有疗效。NGF用于阿尔茨海默病的治疗已经通过临 床二期实验。GDNF用于治疗帕金森病的临床二期实验效果明显，但临床三期实验效果不明 显，可能跟整个治疗环节不够完善有关系。
发明内容
本发明的目的在于鉴定一种新型神经营养因子，获得其编码核苷酸序列，通过培 养细胞重组表达获得该因子，制备该因子的抗体，提供利用该基因和蛋白进行疾病诊断、预 防保健和治疗的方法。本发明首次提供一种新型神经营养因子的核苷酸序列，该序列包含完整编码区， 该神经营养因子主要由神经元细胞合成并分泌，因此命名为神经元衍生的神经营养因子 (neuron-derived neurotrophic factor,NDNF)。一方面，获得的编码完整NDNF的核苷酸片 段保存于载体上；同时，含有NDNF编码区的载体转染培养细胞，从培养基上清中获得NDNF 蛋白。获得的NDNF蛋白作用于原代培养神经元，结果表明NDNF蛋白可以促进神经元迁移 和分化成熟，因此可以用于神经系统疾病的预防保健、诊断和治疗。本发明的目的是这样实现的从正常人脑组织中提取总RNA，进行反转录合成 cDNA—链，以之为模板，采用引物进行PCR扩增；扩增出的特异片段电泳回收，使用XhoI和 HindIII限制性内切酶进行酶切，然后克隆到pcDNA3. 1 (-Vmyc-His A质粒载体上，进行序 列测定，测序得到的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列(见序列表)，该序列编码的蛋白质含有568个氨基酸残基，分子量为64. 7kD ；经与相关数据库检索对照发现，未发现与所示序 列相同的已知功能的序列，证明本发明得到的蛋白质属于功能未知的新蛋白质。功能实验 研究表明该蛋白质可以促进神经元迁移和分化成熟，属于神经营养因子。结构分析表明，该 蛋白含有III型纤连蛋白结构域，与经典的NGF家族神经营养因子结构不同。同时，组织分 布和细胞分布实验研究表明，该蛋白主要在神经系统的神经元表达。综上结果，我们将其命 名为神经元衍生的神经营养因子(neuron-derived neurotrophic factor, NDNF)。另外，由于专业人士常使用C0S7(非洲绿猴肾细胞系)制备基因重组蛋白质，因而 本发明采用C0S7细胞制备神经营养因子NDNF。具体过程为⑶S7细胞采用DMEM培养基、 10%胎牛血清、37°C和5%二氧化碳条件下培养。转染前一天细胞铺六孔板，转染当天大约 50%-60%的汇合度，转染前4小时，换新鲜培养液(不含血清和抗生素)。配制转染溶液 加入，孵箱孵育2-3小时后，换上含血清和抗生素的培养液，48小时后收集培养基上清，采 用蛋白免疫印迹法鉴定上清中含有的NDNF蛋白，该上清用于Transwel 1实验，验证NDNF是 否具有促进神经元迁移和分化成熟功能。Transwell小室培养实验中，如果下层蛋白对上层细胞有营养作用和/或促进迁 移作用，上层细胞就会迁移到膜朝下的一侧，通过计数迁移过来的细胞和观察其形态，就可 以知道下层蛋白的作用。本实验结果中，镜检可以发现NDNF和BDNF都可以促进神经元突 起生长，而且NDNF组神经元胞体更大和突起更长(如图1所示)；同时，对照组迁移过来的 细胞很少，NDNF组和BDNF组迁移过来的细胞数目较多，图2显示统计数据，纵坐标表示每个 视野迁移过来的细胞数，对照组、NDNF组和BDNF组分别有22士3、71 士5和80士7个细胞发 生了迁移。总之，该实验结果表明NDNF可以促进神经元迁移和分化成熟，并且其效果优于 已知的BDNF，因此本发明所提供的神经营养因子NDNF可以用于神经系统疾病的预防保健、 诊断和治疗。本发明通过人工合成NDNF羧基末端肽段与免疫原融合，免疫动物并从动物血清 中获得针对NDNF的抗体，制备的抗体(IgG，免疫球蛋白)采用抗原进行ELISA鉴定，制备的 抗体(IgG，免疫球蛋白)用于检测NDNF蛋白的组织分布和细胞分布。免疫印迹研究表明 NDNF主要在神经系统表达，包括中枢神经系统和脊髓；免疫荧光研究表明NDNF主要在神经 系统的神经元表达。其中，抗体的制备过程如下 人工合成人NDNF羧基末端肽段SVKYQSKWKTRKFC，进行HPLC纯度分析和MS鉴定， 纯度大于80%。将合成的肽段与KLH/BSA蛋白偶联，制成免疫原。用生理盐水稀释免疫原， 然后与相应的佐剂进行1 1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子 双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。 具体免疫程序如下第0星期，采血2ml (获得0. 5ml免疫前血清)，用完全弗氏佐剂混合的200 μ g抗 原免疫2只兔子。第2星期，用完全弗氏佐剂混合的200 μ g抗原进行第二次免疫。第4星期，用不完全弗氏佐剂混合的100 μ g抗原进行加强免疫。第5星期，取检测血清，ELISA检测，用溶解在生理盐水中的100 μ g抗原免疫进行 持续免疫。第6-9星期，检测阳性，每周采血20_30ml，并用溶解在生理盐水中的100 μ g抗原进行持续免疫。从兔血中分离得到血清，用Protein A/G对混合血清进行亲和纯化，获得纯化总 IgG IOmg左右，纯度> 95%，最后进行ELISA和WB进行质量检测。
图1为NDNF促进原代培养神经元迁移的Transwell实验镜检结果照片(以BDNF 作为阳性对照)图2为NDNF促进原代培养神经元迁移的Transwel 1实验统计数据直方图(以BDNF 作为阳性对照)
具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制 本发明。实施例1从正常人脑组织中提取总RNA，进行反转录合成cDNA —链，以之为模板，采用下述 两条引物进行PCR扩增正义引物5'-CCGCTCGAGAGGATGGTGCTGCTCCACTGGT-3'反义引物5'-CCCAAGCTTACAGAACTTTCTAGTTTTCACAACC-3'PCR扩增体系蒸馏水IOX缓冲液dNTP (2. 5mM)cDNA 模板正义引物反义引物耐热DNA聚合酶_总体系PCR扩增条件 扩增出的特异片段电泳回收，使用XhoI和HindIII限制性内切酶进行酶切，然后克隆到pcDNA3. l(-)/myC-His A质粒载体上，进行序列测定(见序列表)，该序列编码的 蛋白质含有568个氨基酸残基，分子量为64. 7kD ；经与相关数据库检索对照发现，属于功 能未知的新蛋白质。功能实验研究表明该蛋白质可以促进神经元迁移和分化成熟，属于 神经营养因子。结构分析表明，该蛋白含有III型纤连蛋白结构域，与经典的NGF家族神 经营养因子结构不同。同时，组织分布和细胞分布实验研究表明，该蛋白主要在神经系统 的神经元表达。综上结果，我们将其命名为神经元衍生的神经营养因子(neuron-derived neurotrophic factor, NDNF)。实施例2C0S7 (非洲绿猴肾细胞系，常用于制备基因重组蛋白质)细胞采用DMEM培养基、 10%胎牛血清、37°C和5%二氧化碳条件下培养。转染前一天细胞铺六孔板，转染当天大约 50% -60%的汇合度，转染前4小时，换新鲜培养液(不含血清和抗生素)。配制转染溶液A 液 2 μ g DNA6. 2μ L IMCaCl2X 体积 H2O_共 25 μ LB 液 25 μ L2 X HBS (Hank ‘ s 平衡盐溶液)A液加入B液中，混勻，室温静置20分钟，滴入六孔板中，孵箱孵育2-3小时后，换 上含血清和抗生素的培养液，48小时后收集培养基上清，采用蛋白免疫印迹法鉴定上清中 含有的NDNF蛋白，该上清用于实施例3中的Transwell实验。实施例3 24孔Transwell板(膜孔径8um)，使用多聚赖氨酸和Iaminin蛋白包被，取PO小 鼠脑组织，剥取海马，胰酶消化液消化，获得的细胞悬液种植在上层小室中，下层分别加入 含对照组份的神经元培养基，含NDNF的神经元培养基及含BDNF的神经元培养基，37°C,5% 二氧化碳条件下培养48小时后，小室浸入甲醇中固定20min，然后0. 结晶紫染色20min， 刮去小室上层细胞，光学显微镜下观察穿过小孔的神经元并计数。结果如附图1和图2所示。附图1显示的是显微镜下细胞观察照片，对照组迁移 过来的细胞很少，NDNF组和BDNF组迁移过来的细胞数目较多；同时，可以发现NDNF和BDNF 都可以促进神经元突起生长，而且NDNF组神经元胞体更大和突起更长。附图2显示统计数 据，纵坐标表示每个视野迁移过来的细胞数，对照组、NDNF组和BDNF组分别有22士3、71 士5 和80士7个细胞发生了迁移。总之，该实验结果表明NDNF可以促进神经元迁移和分化成熟， 可以用于神经系统疾病的预防保健、诊断和治疗。以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方 式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何 修改、等同替代和改进等，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围之内。
权利要求
一种新型神经营养因子，其核苷酸序列和编码的氨基酸序列如序列表所示。
2.与权利要求1的核苷酸序列互补或可杂交的核酸分子。
3.一种包含权利要求1或2的核酸分子的表达载体。
4.一种多肽，含有权利要求1的完整氨基酸序列的全长蛋白质或具有生物学活性的片断。
5.权利要求4的多肽的抗体。
6.权利要求1或2的核酸分子作为制备神经系统疾病治疗药物的应用。
7.权利要求1或2的核酸分子作为制备神经系统疾病诊断试剂的应用。
8.权利要求1或2的核酸分子作为诊断和治疗神经系统疾病的应用。
全文摘要
本发明提供了一种新型神经营养因子NDNF及其制备方法和应用，获得NDNF的核苷酸序列，该序列编码的蛋白质含有568个氨基酸残基，分子量为64.7kD；经与相关数据库检索对照发现NDNF属于功能未知的新蛋白质。本发明通过培养细胞重组表达获得NDNF；功能实验研究表明该蛋白质可以促进神经元迁移和分化成熟，因此可以用于神经系统疾病的预防保健、诊断和治疗。
文档编号C12Q1/68GK101885766SQ20101019690
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者匡秀丽, 孙国涛, 赵小美 申请人:河南大学