专利名称：新的促神经营养因子及其编码序列,及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经学和基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的大鼠蛋白和核苷酸编码序列。更具体地说，本发明涉及一种新的促神经生长因子tropic 1808及其cDNA序列。本发明还涉及这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
近10年来，脑与神经科学领域飞速发展，其中有关神经损伤修复及抗衰老的课题更是该领域的研究热点，并且带动神经生物学、临床解剖学、创伤外科学等前沿学科的发展。在该领域的任何研究进展，无论是对于实验室的基础理论研究；抑或是对于医院临床应用，都有着重要的意义。
目前，对于神经科千百万罹患老年性痴呆、外周神经退行性病变、截瘫、外伤后神经损伤等疾病的病人而言，可以接受的有效治疗方法极为有限。其中，就常规使用的药物而言，譬如用于营养神经的维生素B12，以及地巴唑、激素类和神经节苷脂等，无论是品种还是效果都非常有限。
虽经过多年研究，但是目前已知的、具有促进神经生长作用的蛋白主要仅包括神经营养因子(TNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子3和4(NT-3和NT-4)等。因此，人们对神经发育生长和修复过程中所涉及的因子和多肽还知之甚少，迫切需要找到与神经发育、营养及损伤修复等有关的各种因子和/或多肽，以便设计和制造出造福于人类的药物。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码一种新的促神经生长因子，本发明的促神经生长因子成员被命名为tropic 1808。
本发明的另一个目的是提供一种新的大鼠的促神经生长因子，该蛋白被命名为tropic 1808蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种生产所述的新的大鼠tropic 1808多肽的方法。
本发明还提供了这种大鼠tropic 1808核酸序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有tropic 1808蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸101-928位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸101-928位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸101-928位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的tropic 1808蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有tropic 1808蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有tropic 1808蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成tropic 1808蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸101-928位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成tropic 1808蛋白的重组细胞；(c)在适合表达tropic 1808蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有tropic 1808蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为2196个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于101-928位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“tropic 1808蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有tropic 1808蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中101-928位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框101-928位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中101-928位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.1中从核苷酸101-928位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸101-928位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与tropic 1808相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“tropic 1808蛋白或多肽”指具有tropic 1808蛋白活性的SEQID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与tropic 1808相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括tropic 1808蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与tropic 1808 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗tropic 1808多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含tropic 1808多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了tropic 1808多肽的可溶性片段。通常，该片段具有tropic1808多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供tropic 1808蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然tropic 1808多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“tropic 1808保守性变异多肽”指与SEQ ID No.P的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还包括tropic 1808多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内tropic 1808的表达。
本发明还包括一种可用作探针或引物的核酸分子，该分子通常具有tropic1808多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码tropic 1808的核酸分子。
本发明还包括检测tropic 1808核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于tropic 1808多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对tropic 1808 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于tropic 1808基因产物或片段。较佳地，指那些能与tropic 1808基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制tropic 1808蛋白的分子，也包括那些并不影响tropic 1808蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的tropic 1808基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的tropic 1808基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达tropic 1808或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断tropic 1808功能的抗体以及不影响tropic 1808功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用tropic 1808基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与tropic 1808基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的tropic 1808核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆人载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明的发明人，通过对比大鼠正常神经组织和损伤后神经组织的蛋白质表达情况，意外地发现有一种分子量约为18kDa的蛋白在受损伤后的神经组织有特异性地高表达。分离后该18kDa蛋白，将其作为免疫原来制备单克隆抗体。利用获得的抗体，对SD品系大鼠损伤性周围神经的cDNA表达文库进行混合筛选，得到12个阳性克隆。测序后发现有6个克隆含有相同或部分相同的序列，其中8号克隆含有2196bp的片段并含有828bp的完整阅读框。根据测序结果，设计引物(SEQID No.3和4)，分别以8号阳性克隆和新生大鼠周围神经组织mRNA为模板，通过PCR或RT-PCR扩增后得到了含tropic 1808编码序列的片段。经瞬时表达，测定了表达产物对大鼠背根神经节的影响，发现本发明的新蛋白有明显的促神经生长作用。
本发明所提供的新的tropic 1808多肽和编码序列，为进一步研究tropic 1808在生物体内的功能以及由该类基因引起的疾病提供了基础，并为将来的疾病治疗提供了新的前景。
本发明提供了一个新的tropic 1808的同源基因，该基因的发现为进一步研究tropic 1808在生物体内的功能以及由该类基因引起的疾病，进而为将来的疾病治疗提供了新的前景。
本发明的tropic 1808除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明tropic 1808还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。
针对本发明tropic 1808的抗体，用于筛选与tropic 1808同源的蛋白，或者用于亲和纯化相关蛋白。
此外，本发明tropic 1808核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高tropic 1808的表达水平或者抑制tropic 1808的过度表达。本发明的tropic 1808蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因tropic 1808缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
在附图中，
图1为本发明的含有pcDNA3-tropic 1808表达载体的CHO细胞与新生SD大鼠背根神经节在无血清培养基中联合培养的照片。
图2是含有空载pcDNA3的CHO细胞与新生SD大鼠背根神经节在无血清培养基中联合培养的照片。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1tropic 1808蛋白的分离取将大鼠正常及损伤后的周围神经组织，均浆化后，5000rpm/min离心2分钟，取上清液分别进行非变性-PAGE电泳。经对比发现损伤后的神经组织含有一种特异性的、分子量大小约为18kDa的蛋白。
实施例2制备抗tropic 1808的单克隆抗体将实施例1中18kDa蛋白从电泳凝胶上分离出来，作为抗原，按常规方法免疫小鼠，将免疫过小鼠的脾脏细胞(含有大量抗体产生细胞)与在体外培养的骨髓瘤细胞(不产生抗体，但具有无性繁殖能力)在聚乙二醇(PEG)的作用下进行融合，通过选择培养基的筛选，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测有无抗体分泌，将产生抗体的细胞移至24孔培养板增殖，进行克隆化。由此建立起能够分泌单克隆抗体的细胞株，通过体外培养或将上述细胞培养物注入小鼠腹腔繁殖，将可获得大量单克隆抗体。共制备7株单克隆抗体。
实施例3大鼠损伤性周围神经cDNA的制备按谭湘陵，顾晓松，印其友等人。“大鼠损伤性周围神经组织cDNA文库的构建”。《解剖学报》，1998，29(2)139-144的方法，以SD大鼠手术损伤后的坐骨神经组织为材料，提取mRNA，逆转录合成cDNA，以λgt11为载体，构建cDNA表达文库，测定该文库的容量为1.5×106，滴度为1.4×1012(pfu/ml)。
实施例4tropic 1808编码核苷酸序列的获得利用实施例2制备的单克隆抗体，在SD大鼠损伤性周围神经的cDNA文库中混合筛选、寻找与神经生长相关的新基因。参照Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的“筛选构建于λ噬菌体载体的表达文库”方法。将文库以10000个噬斑/皿的密度铺培养平皿，出现噬菌斑后原位印迹到浸过IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的硝酸纤维素膜上，用免疫组化方法筛选那些可以被诱导表达与已知抗体相互作用蛋白的噬斑，进一步扩增为阳性克隆。共获得12个阳性克隆，测序发现其中有6个阳性克隆为相同或部分相同序列，插入片段在1.8kb-2.7kb之间。
其中一个阳性克隆8号有2196bp的插入片段(SEQ ID No.1)，并有完整的828bp的阅读框架ORF(即SEQ ID No.1中第101-928位)，该ORF编码一个275个氨基酸的多肽(SEQ ID No.2)。
将如上获得的核酸序列和氨基酸序列(SEQ ID No.1和2的序列)，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库以及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR等数据库中用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果未发现与其他已知蛋白有明显的同源性。因此，该序列是为未见报道的新序列，并将其命名为tropic 1808，GenBank登录号为AF078811828bp(因申请保密，故在本申请之前序列未公开)。
实施例5制备tropic 1808编码序列分别用以下两种方法来制备含有tropic 1808的cDNA编码序列片段(1)人工合成寡核苷酸引物，即为TAAAGCTTCA AGATGAATTTGGCTCAAATC GC(SEQ ID NO.3)和GCGGAATTCA GATATGACTAAGGTTAGTGT CG(SEQ ID NO.4)，分别作为上下游引物。以获得的含有tropic 1808完整编码序列的阳性克隆8号的DNA作为模板，使用GENE公司的TaqDNA聚合酶(5U/μl，Cat.#GT-TAQ251)，进行PCR扩增。结果，获得含有完整tropic 1808结构基因的DNA片段，长度为864bp，且上游携带Hind III酶切位点，下游携带EcoR I酶切位点。
(2)如上合成寡核苷酸引物，即为TAAAGCTTCA AGATGAATTTGGCTCAAATC GC(SEQ ID NO.3)和GCGGAATTCA GATATGACTAAGGTTAGTGT CG(SEQ ID NO.4)，分别作为上下游引物。使用GENE公司的Taq DNA聚合酶(5U/μl，Cat.#GT-TAQ251)，以1月龄SD大鼠周围神经组织的mRNA作为模板，寡核苷酸引物GCGGAATTCA GATATGACTAAGGTTAGTGT CG(SEQ ID NO.4)作为逆转录引物，进行RT-PCR扩增。先进行逆转录反应(cDNA第一链的合成)在50μl反应体积中含有纯化的mRNA200ng，逆转录引物300ng，4mmol/L dNTP及20U的MMLV逆转录酶(20U/μl，Promega公司产品)。37℃反应60min，合成cDNA第一链。加入PCR扩增引物，91℃变性5min后加入Taq酶，然后进行PCR扩增，每100μl反应体系中包括逆转录反应产物10μl，上下游寡核苷酸引物各100pmol，及10mmol/L Tris-Hcl(pH8.3，20℃)，1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，2mmol/L dNTP，20μg/ml BSA，2.5单位Taq DNA聚合酶，再覆盖100μl液体石蜡。在PERKINELMER/CETUS公司的DNA ThermalCycler480上94℃变性1min，55℃退火1min及72℃延伸3min，共进行30个循环，最后在72℃保温10min。取5μl反应产物在1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，紫外灯下观察鉴定。获得含有完整tropic 1808结构基因的DNA片段，长度为864bp，且上游携带Hind III酶切位点，下游携带EcoR I酶切位点。
经将如上获得的PCR扩增片段分别进行测序，结果证实扩增产物除去两端酶切位点之外的序列，与SEQ ID No.1中第98-961位的序列相一致。
实施例6tropic 1808的Northern-Blot检测使用GIBCO BRL公司TRIzol ReagentRNA提取试剂(Cat.#15596-026)，从新生SD大鼠脑及损伤后神经组织中分别提取mRNA，按常规进行Northern-blot检测。先进行RNA甲醛变性凝胶电泳，再转印尼龙膜，用已经用同位素标记的实施例5中所述含有tropic 1808编码序列的cDNA作为探针，进行杂交，再经过放射自显影。检测结果发现tropic 1808基因mRNA全长约为3.8kb。
实施例7原位杂交检测用实施例5中获得的含有tropic 1808的编码序列的cDNA，用BOEHRINGERMANNHEIM公司DIG DNA Labeling and Detection(地高辛标记)试剂盒(Cat.#1093637)，标记为非同位素探针，然后分别对正常及损伤后的大鼠周围神经组织进行原位杂交。
结果发现，tropic 1808的mRNA在大鼠损伤后坐骨神经的部分雪旺氏细胞中表达增强，而且tropic 1808基因表达阳性的细胞，特异性地排成束状，提示该因子具有特定的生物学功能。而tropic 1808基因在正常的成年大鼠坐骨神经中基本无表达。
实施例8tropic 1808基因的表达情况1.在损伤神经中的表达情况用RT-PCR方法研究tropic 1808的mRNA在大鼠周围神经损伤后的表达规律。分别提取损伤后不同时间点的大鼠损伤神经的mRNA，参照前述实施例5(2)中的RT-PCR反应条件和方法，进行扩增。最后根据PCR产物的量，来确定tropic 1808在大鼠周围神经损伤后不同时间的表达情况。
结果发现，大鼠周围神经损伤后1周即有tropic 1808的表达；损伤后2周表达水平达到最高；损伤后4周表达下降。正常成年大鼠坐骨神经中未见tropic 1808基因的表达。
2.在中枢神经发育过程中的表达情况按如上基本相同的方法，通过RT-PCR方法研究tropic 1808基因mRNA在中枢神经发育过程中的表达规律。
结果发现新生大鼠的大脑、脑干、脊髓中可见tropic 1808基因的表达；1月龄大鼠的大脑、脑干、脊髓中tropic 1808基因表达量明显上升；2月龄大鼠仅在脊髓中有少量表达，在大脑、脑干中未见表达。新生大鼠及1月龄、2月龄大鼠的小脑组织中均未见tropic 1808基因的表达。
实施例9tropic 1808编码产物在真核表达系统CHO细胞株中的表达将实施例5(2)中的获得的含有tropic 1808的编码序列的cDNA，经Hind III+EcoR I双酶切，克隆人经同样酶切的Invitrogen公司表达载体pcDNA3(Cat.#V790-20)中，经酶切及DNA测序证实插入片段大小及方向正确无误后，转染CHO细胞，进行瞬时表达。
用已经制备的单克隆抗体检测瞬时表达产物免疫原性的West-blot试验为阳性，用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为18KDa。此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。
实施例10重组表达产物的活性检测首先分离新生SD大鼠的背根神经节。按常规准备不含有血清的DMEM基础培养液，经0.22μm滤膜过滤，保存于4℃。另取少量于37℃孵育2天，观察有无污染。用鼠尾胶包被96孔培养板，回收多余的胶。37℃，5％ CO2培养箱孵育过夜。用基础培养液洗涤上述培养板3-4次，于超净台自然风干备用。选用新生SD大鼠(出生24-48hr内)，取材前在75％乙醇中浸泡10min。于无菌条件下，将鼠断头处死，用无菌脱脂棉充分吸净血液。用眼科剪自鼠背部正中剪开皮肤，将棘突两侧的肌肉及软组织仔细剥离、剔除。仔细剪开椎管，尽量剪短并修齐椎弓，小心剥离脊髓，暴露位于两侧椎间孔中的背根神经节。轻柔取出背根神经节，置于装有基础培养液的无菌平皿中，小心去除其它组织，用基础培养液尽量冲洗干净。将上述背根神经节置于已经处理的培养板中。
活性检测时，分别将含有pcDNA3-tropic 1808表达载体的CHO细胞和只含有空载pcDNA3的CHO细胞与新生SD大鼠背根神经节在无血清基础培养基中联合培养。将培养板置于5％ CO2、37℃培养箱中孵育24-48hr。在显微镜下观察培养后的背根神经节，观察是否有明显神经突起生长。
参见附图，图1为含有pcDNA3-tropic 1808表达载体的CHO细胞与新生SD大鼠背根神经节在无血清培养基中联合培养的照片，图中可检查到有许多神经纤维自神经节中心、呈放射状向外生长，这说明本发明的tropic 1808具有明显的促神经生长作用。而图2中只含有空载pcDNA3的CHO细胞与新生SD大鼠背根神经节在无血清培养基中联合培养则无类似效应。因此，本发明的tropic 1808是一种新的促神经生长因子，具有明显的促神经生长效应，并在神经发育与再生过程中起着促进神经生长的重要作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人上海医学生命科学研究中心有限公司南通医学院(ii)发明名称新的促神经营养因子及其编码序列，及制法和用途(iii)序列数目4(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度2196bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO.11 GGGCAACACA GCAGCACCGG CGGCACCCGC AACTAATACT GCGACAACTT ATACGGTTAA61 AGCCGGTGAT ACACTATCAA GAATCGCGGC TCAGTTTAAG ATGAATTTGG CTCAAATCGC121 TGCGTTGAAT CAAATTTCAA ATTTGAATGC AATCCGCGTG GGACAAGTTT TGAAGGTATC181 TAACGCCGCC GGTTCAAATA ATACGCAAAA TACAACCCAG CCTTCTGCAG GGGTACCAAC241 GAATACGGCG TCAAGCACAA CAGGTTATAC TGTTAAGTCT GGGGATACGT TGTCAGCAAT301 CGCTGCGGCA AACGGTGTTT CATTGGCGAA CTTGCTCAGC TGGAACAACT TGTCATTGCA361 AGCCATTATC TATCCTGGAC AAAAGTTAAC GATTCAAAAC GCTAACAATG CCACGGTCAC421 AACGCCAAAC GCACCGACAA GTACGCCAAC GGTTATGCCA TCAACGAACG GTAGTTACAC481 GGTGAAGTCA GGCGATACAT TGTATGGTAT TGCAGCAAAG CTAGGGACGA ACGTGCAAAC541 GTTGCTATCT TTGAATGGTT TGCAATTGTC AAGCACCATT TATGTGGGGC AAGTTTTGAA601 AACAACAGGC GCACCAGTTG CTGGTGCTGG AACTGCCACA TCAACACCAA CACCAGTAAC661 ACCAACAGTC TCAAAACCGG CTGCAGCAAA CGGTGTGTCA ACAGCTGGCT TAAGTGCTGC721 GCAAGCCGCA TGGTTGCGGA CAGCGGTTGT TGATGCGCAA GCGGCAACAG CAGGGACGGG781 CGTTTTGGCA TCCGTAACGG TTGCTCAAGC GATTCTTGAA AGCGGTTGGG GACAATCAGC841 GTTGGCTTCA GCACCATACC ATAACTTTAA TTTATATTTA ATAAAGGTGA AAAACACATG901 GAAATTGATG ACATTGCTGC TATCGTAAAA ATATTAAACG ACAATAACCT TAGTCATATC961 TCATTTAAAA AAGGTGATTC GAAAATTAGT GTCTCAAAAA ACATTAATCG TGAGATTCAA1021 ATAGCTGACA GCATAGATAT TGCAAAAGAA CAACCACAGC AAGAGATGCG TTACATCGTA1081 TCACCAACAA TTGGCACGTT TTATGCCGCG TCTGATCCTG AATCGTCACC CTTTGTTACA1141 GTGGGACAGA CAGTAACTCA ATCGACTGTA GTTGGTATTG CAGAAGCCAT GAAAATGATG1201 ACCAACATCT TAGCAGATAA TGAGGGCGTG ATTGCTGAGG TTTTAGTTCA AGATGGTGAT1261 GTAATTGAAT TTGGACAAAA ATTGTTTAGG TTGTCGTGAT GCGCAGTACA GTAGAACACA1321 ACTTTAAAAT TTTAATTGCT AACCGTGGTG AAATTGCGGT CAGAATTATT CGAGCGGCAA1381 AAACATTGGG GTTCACAACA GTAGCGGTTT ATTCGTCCGC CGACAAAGCA TCGCTACATG1441 TCGCAATGGC CGACGAGGCC GTCCAAATAG GTCCTGCAAA TGCGATTGAT AGCTATTTGA1501 ACCAACATGC AATTTTAGCG GCAGCAGAGA TTACACATGC GGATGCCATT CATCCTGGTT1561 ATGGCTTTTT GTCTGAAAAC GCGGATTTTG CCAGTAAAGT CGAATCAATG GGTCTTACAT1621 TTATTGGCCC AACAAGTGAT ACCATTTCTC AAATGGGAGA TAAGGCTAGT GCACGTCAAT1681 TTATGTCAGA AACCGGCGTA CCGATTGTGT CTGGAAGTGA TGTTTTTTTT GATAATGTAC1741 ATGCTGGTTT GACACAGGCT AATCAAATTG GTTATCCTGT GATGCTTAAG TCTGTTGCTG1801 GTGGCGGCGG AAAAGGTATG CGACTGATTC CAAGCCAAGA TAGTTTTCAA TCATTATTCG1861 AGCTTGCCCA GAACGAAATT AAAGCGTCAG TTGGTGATGG TCGTATGTAT CTTGAGAAAT1921 TCATTGATCA GCCACGGCAT ATTGAAGTAC AGGTATTAGG TGATGGGTTA GGAGATGCCA1981 TTGTCTTGGG TGAACGTGAC TGCACTATTC AAAGTCATCA TCAAAAAGTT ATTGAAGAAG2041 CCCCCAGTCA GTACCTGGAT GCAGCCACAC GCTCTGAGAT GTTAGATGTC GCGTTGAAAG2101 CGACAAAAAA GATGGCCTAT CGTAGTGCAG GTACTTTTGA ATTTTTGTAT CAAGGCCCTG2161 GTCGTTATTA TTTCATGGAG ATGAATACAC GATTG(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度275个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(iii)序列描述SEQ ID NO.21 Met Asn Leu Ala Gln Ile Ala Ala Leu Asn Gln Ile Ser Asn Leu16 ASn Ala Ile Arg Val Gly Gln Val Leu Lys Val Ser Asn Ala Ala31 Gly Ser Asn Asn Thr Gln Asn Thr Thr Gln Pro Ser Ala Gly Val46 Pro Thr Asn Thr Ala Ser Ser Thr Thr Gly Tyr Thr Val Lys Ser61 Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ala Ala Ala Asn Gly Val Ser Leu76 Ala Asn Leu Leu Ser Trp Asn Asn Leu Ser Leu Gln Ala Ile Ile91 Tyr Pro Gly Gln Lys Leu Thr Ile Gln Asn Ala Asn Asn Ala Thr106 Val Thr Thr Pro Asn Ala Pro Thr Ser Thr Pro Thr Val Met Pro121 Ser Thr Asn Gly Ser Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Tyr136 Gly Ile Ala Ala Lys Leu Gly Thr Asn Val Gln Thr Leu Leu Ser151 Leu Asn Gly Leu Gln Leu Ser Ser Thr Ile Tyr Val Gly Gln Val166 Leu Lys Thr Thr Gly Ala Pro Val Ala Gly Ala Gly Thr Ala Thr181 Ser Thr Pro Thr Pro Val Thr Pro Thr Val Ser Lys Pro Ala Ala196 Ala Asn Gly Val Ser Thr Ala Gly Leu Ser Ala Ala Gln Ala Ala211 Trp Leu Arg Thr Ala Val Val Asp Ala Gln Ala Ala Thr Ala Gly226 Thr Gly Val Leu Ala Ser Val Thr Val Ala Gln Ala Ile Leu Glu241 Ser Gly Trp Gly Gln Ser Ala Leu Ala Ser Ala Pro Tyr His Asn256 Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Lys Val Lys Asn Thr Trp Lys Leu Met271 Thr Leu Leu Leu Ser(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度32碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3TAAAGCTTCA AGATGAATTT GGCTCAAATC GC 32(2)SEQ ID NO.4的信息
(i)序列特征(A)长度32碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4GCGGAATTCA GATATGACTA AGGTTAGTGT CG 3权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有tropic 1808蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸101-928位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸101-928位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码—多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸101-928位的核苷酸序列。
4.一种分离的tropic 1808蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.一种产生具有tropic 1808蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有tropic 1808蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成tropic 1808蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸101-928位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成tropic 1808蛋白的重组细胞；(c)在适合表达tropic 1808蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有tropic 1808蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求4所述的tropic 1808蛋白多肽特异性结合的抗体。
10.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了一种新的大鼠蛋白及其编码核苷酸序列。更具体地说,本发明涉及大鼠蛋白tropic1808的cDNA序列,该序列所编码的蛋白是一种促神经生长因子。本发明还涉及这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
文档编号C12N15/12GK1263156SQ9911347
公开日2000年8月16日 申请日期1999年2月11日 优先权日1999年2月11日
发明者顾晓松, 顾建新, 张沛云, 谭湘陵, 丁斐, 陈淳 申请人:上海医学生命科学研究中心有限公司, 南通医学院