专利名称：β－半乳糖苷酶菌株、β－半乳糖苷酶及其生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物及微生物发酵领域。具体的说，本发明涉及一种产生一种β-半乳糖苷酶的乳球菌菌株、β-半乳糖苷酶及其生产工艺。
背景技术：
β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)，又称乳糖酶，广泛存在于各种动物、植物及微生物中。对此酶的最初应用是利用其水解乳糖的性质来降低乳制品的乳糖含量。随着生物技术的发展，可获取具有一定优良特性更高酶活的β-半乳糖苷酶，并对编码此酶的基因结构有了相当了解，探讨了其反应作用机制，使得β-半乳糖苷酶不仅在食品工业中的用途越来越广泛，而且在生物技术领域如基因工程、酶工程、蛋白质工程方面都发挥着重要作用，并广泛应用于化学、医药等领域。β-半乳糖苷酶的应用于降解乳糖和生成低聚半乳糖。牛奶及其乳清中含有大量乳糖，世界上有相当大的人群属乳糖不适者。据有关资料介绍，我国成年人饮用奶制品后吸收不良的发生率高达86.7％，乳糖不耐受现象占到其中的90％，青少年、婴幼儿所占比例约为25％。而解决乳糖不耐受现象，最快捷的途径就是为他们提供低乳糖奶制品。因此开发低乳糖奶制品将大大增加乳制品的消费人群，国内乳制品的市场容量将大幅扩展。由于乳糖不易发酵，溶解度较低。在冷冻制品中易形成结晶影响食品加工性能，液态牛奶在通过管道进行超高温瞬时杀菌时乳糖的存在会产生胶状物堵塞管道。乳清中的大量乳糖使得乳清的排放造成很大的环境污染问题。乳糖经乳糖酶水解生成其组分单糖-葡萄糖和半乳糖，不仅大大改善了其加工性能，而且甜度提高，发酵性能好，更易被小肠消化吸收。人们用β-半乳糖苷酶水解乳糖生产低乳糖牛奶，水解乳清中的乳糖生产甜味剂并作为添加剂加入到其它食品中。
近20年来越来越多的证据显示了乳糖水解过程中形成的低聚糖对人体的保健作用。这种转移反映的产物是双糖、三糖和分子再大一些的低聚糖，是由多种组分构成的混合体系。我们所说的低聚半乳糖是以高浓度乳糖作为β-半乳糖苷酶的底物而生成的，是在乳糖分子的半乳糖残基上以β键接上1-4个半乳糖而形成的杂低聚糖。构成式可用Gal-(Gal)n-Glc来表示，其中n＝1-4，其主要成分为6′-半乳糖基乳糖。低聚糖败血病不被小肠消化，是一种低分子量的、不粘稠的水溶性膳食纤维。低聚半乳糖作为肠道内双歧杆菌的增殖因子，只能为双歧杆菌利用而不能为肠道中腐败细菌所利用，增殖的双歧杆菌竞争性地拮抗腐败菌如产气荚膜梭菌的生长，减少有害毒素和酶的产生，有整肠功能。双歧杆菌与此相关的保健功能还有抗癌，治疗腹泻与便秘，降血清胆固醇和降血压，增强肝脏功能，产生B族维生素、尼克酸、叶酸等。
据1995年报道，日本的保健食品市场上19种功能性低聚糖的消费量达到4.7万吨，其中低聚半乳糖在1988年上市以来年需求量就达7000吨。低聚半乳糖甜度为蔗糖的20％-40％，热稳定性良好，在酸性条件下很稳定，粘度接近蔗糖，并有良好的保湿性。食品工业用于发酵乳、饮料、冰淇淋、糖果、奶粉、口服液等。
β-半乳糖苷酶普遍存在于各种植物中，了解它在果蔬各个生长时期的含量对于果蔬的成熟、风味、颜色及采收后加工都有重要意义。一般在植物成熟期β-半乳糖苷酶含量增加。它降解含半乳糖苷的胞壁多已用于梨、苹果、土豆和中国水粟的软化和番茄、胡椒、甜瓜、樱桃、核果和牛油果的成熟。
在免疫、检测及疾病诊断方面的应用也较广泛。免疫学方面，将β-半乳糖苷酶与人体胞外淀粉状蛋白前体融合形成融合蛋白，可作为Alzheimer病的免疫源，并进一步制备其单克隆抗体。还有报道将β-半乳糖苷酶作为一种辅蛋白，用来稳定和增加UR5-UR1融合蛋白的溶性，以此作为猫白血病毒gp70的疫苗。在诊断方面，将抗菌性HIV病毒基因与β-半乳糖苷酶基因LacZ重组后作为诱导基因在COS细胞中产生HIV-LacZ缺陷型病毒，最后在CD4+靶细胞中表达β-半乳糖苷酶。用这一系统咳定量HIV利用循环的早期抑制作用，并预先化合物抗HIV的活性。在环境检测方面，大肠杆菌β-半乳糖苷酶活性检测可快速分析浴场和渔场地区海水水体受排泄污染程度。
目前乳品工业用于乳品分解乳糖的乳糖酶多从酵母、曲霉菌或乳酸菌中经诱导产酶后提取获得，但均不耐热，仅能在常温下工作(Boyer PD，1972)。因在常温下化学反应速度较慢，所需时间较长，鲜奶容易受到细菌污染而发生变质，且生产流程延长，占用设备时间也长。此外，为缩短水解时间所需添加的酶量又较大，因此成本也较高。改用耐热乳糖酶则有可能在50℃左右的温度下对乳品中的乳糖进行水解。因温度较高，反应速度较快，所需时间缩短，需要的酶量也可减少，并且可以与鲜奶生产中的巴斯德消毒工序合为一道工序，即在巴斯德消毒的过程中同时进行乳糖酶水解，省时省工并且能防止杂菌污染。
发明内容
针对常温乳糖酶均不耐热，仅能在常温下工作(Boyer PD，1972)。而在常温下化学反应速度较慢，所需时间较长，鲜奶容易受到细菌污染而发生变质的缺点，本发明根据生物与环境相适应的原理，在冷库与冷冻土壤中分离出一批微生物菌株，通过进一步选育、驯化，获得稳定表达的菌株，利用符合本菌株的特性，设计出一套发酵生产工艺技术，获得能适应反应温度高的乳糖酶。
本发明提供的一株产半乳糖苷酶的菌株，是通过在冷库与冷冻土壤中分离、筛选获得。其编号为G2005的菌株，具有生产乳糖酶的优良特性，经微生物学鉴定，定为乳球菌(Lacfococcus sp.)。
本发明在获得的短芽孢杆菌的基础上，提供了一种乳糖酶的生产工艺。
同时，本发明还提供，利用本发明的菌株经过确定的具体发酵工艺而获得一种乳糖酶。
本发明提供了一种乳糖酶菌株，命名为G2005，其能够产生乳糖酶。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编100080。保藏日期是2005年7月25日，保藏号是CGMCC.No.1425。它为乳球菌(Lacfococcus sp)，该菌株细胞呈球形或者卵圆形，0.5-1.2um×0.5-1.5um，在液体培养基中成段和短链，不生芽孢，革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。化能异养，发酵代谢，以一些碳水化合物发酵产酸，以革兰氏阳性乳酸为主，不产气，营养要求复杂，接触酶阴性，最适温度30℃，能在4℃-42℃中生长。该菌能利用葡萄糖产酸，也能利用L-阿拉伯糖，D-甘露糖，D-木糖，水解淀粉，液化明胶，分解酪素，能利用柠檬酸盐生长，不产生吲哚，并能在6％氯化钠盐度下生长。生长pH范围为5-8，最适生长pH7。依照伯杰氏系统细菌学手册第二卷，G2005菌为乳球菌属中的成员，定为乳球菌(Lacfococcussp.)。
本发明进一步建立菌种保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。
一、菌种保藏菌种在矿物油和真空冷冻条件下进行了保藏试验。其效果如表1所述表1不同保藏方法对菌株存活率的影响
二、菌种活化取保存菌株，用接种针刮取或挑取少量接于固体TSA上，在适合菌株生长的温度下培养一定时间后，连续活化数次，并进行菌株产酶能力的测定。
三、菌种复壮在摇瓶发酵中，确定了一套保持产酶特性稳定菌株筛选的流程。
依次在液体TS和固体TSA中接种活化好的菌并进行培养，检测该菌特性，选取优良菌株接种于斜面培养基上培养，并将此菌株用摇瓶进行发酵实验，以检测其产酶能力。检测其产酶能力未发生退化后，此菌株可作为生产菌株使用。
本发明提供一种乳糖酶的生产工艺，其包括A对乳球菌(CGMCC.No.1425)进行菌种活化培养步骤；B利用步骤A获得的活化菌种进行发酵步骤。
发酵过程中，以选择乳糖酶酶产量最高的条件为优选条件。优选发酵温度30℃，通气量1∶0.2-0.5vvm，搅拌速度为150-200rpm，发酵周期24-32小时。
在发酵罐发酵工艺上，采用单批发酵工艺，发酵酶活达21u/ml。
在发酵过程中，培养基是发酵工艺的基础。本发明在实验中，利用摇瓶发酵对发酵培养基进行筛选与优化，并对菌种活性进行检测。本发明的乳球菌(CGMCC.No.1425)对培养基的营养源并无特殊的规定，可使培养基中含有常规的用于微生物培养的碳源、氮源。例如，乳球菌(Lacfococcus sp)可以葡萄糖、乳糖等作碳源，生长并产酶。其中，以乳糖为碳源菌体生长最快。可利用胰蛋白胨、豆蛋白胨等可作为氮源使用，但胰蛋白胨为最佳氮源，其获取、使用容易，且可使生产菌株达最大的产酶量。
通过实验证明，金属离子对发酵有一定的作用，Cu离子对产酶具有不同的抑制作用，Zn离子对产酶无显著作用，而Na离子对产酶具有促进作用，K离子可使菌体生长加快，有益于产酶。优选0.2％-0.7％的Na离子、K离子。
在发酵过程中，物料灭菌与菌体代谢都会使发酵液pH发生较大的变化，因此，在发酵培养基中本发明使用磷酸盐调节发酵过程的pH变化，使用碳酸盐控制物料灭菌过程带来的pH变化。
本发明同时提供了利用乳球菌(CGMCC.No.1425)，获得的乳糖酶，其不仅具有一般乳糖酶特性，而且克服了常温乳糖酶反应温度偏低的缺点，提供了一种具有良好高温活性、酶活较高的乳糖酶，可使乳糖酶的应用温度较常温乳糖酶提高13℃。本领域普通技术人员已知，高温乳糖酶指乳糖酶的反应温度较高，一般反应温度40-60℃。本发明的乳糖酶是生产菌株(CGMCC.No.1425)的代谢产物，通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，并利用酶分子的物化性质进行产物分离。本发明的乳糖酶，最适反应温度为50℃，具有高温乳糖酶特性，最适反应pH值为7.0；金属离子对酶的作用其中以Na作为标准(100％)，高于Na对酶活起促进作用，低于Na则起抑制作用，结果显示，Mg对酶活起促进作用，其他离子则抑制酶活。Mg离子对酶分子有激活作用的相对酶活为129.15％，而Cu离子、Fe离子、Hg离子及Zn离子对酶分子的活性有不同程度的抑制作用，其相对酶活分别为20.52％、93.88％、34.15％、60.49％；酶的半衰期在40℃保温1小时，酶活力下降4％，在60℃下酶的半衰期30分钟。
通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。
A、定向筛选到G2005乳糖酶高产菌株经鉴定为乳球菌(CGMCC.No.1425)。利用本发明的菌株发酵获得的乳糖酶反应温度40-60℃，最适反应温度为50℃，该酶在其他温度的酶活都很低。而该菌生长温度为4℃-42℃，最适生长温度为30℃。该酶具有反应温度高特点，同时说明该酶最适反应温度滞后于菌株最适生长温度的规律。
B、通过本发明优选实施方案，例如培养基配方及发酵工艺条件的优化，确立了乳球菌(Lacfococcus sp)稳定的发酵工艺，使发酵酶活由15u/ml升高到21u/ml。
图1显示本发明乳糖酶酶活力测定方法流程图。
图2显示发酵流程图。
图3显示整体酶活与温度的关系。
图4显示温度对G2005酶活的影响。
图5显示温度对G2005菌株的影响。
图6显示不同温度G2005酶活与菌株间的关系。
以下是对本发明的整体方案的具体示例，并不以任何方式限定本发明。
具体实施例方式
实施例1本发明选用菌种的保藏与复壮在乌鲁木齐冷库中分离得到了一株乳糖酶产生菌G2005，经鉴定为乳球菌，所产生的乳糖酶最适反应温度50℃，60℃下酶的半衰期约50分钟。
采用两种方法进行菌种保藏，即液体石蜡保藏法和真空冷冻干燥法。前者用于菌种短期保存(4-6个月)，后者用于生产菌种的长期保藏(6个月—数年)。
保存菌种的活化取保存菌株，用接种针挑取菌种接种装有2毫升无菌水的试管中，振荡10分钟。然后用无菌吸管取0.2毫升加到平板培养基TSA(胰蛋白胨15g，豆蛋白胨5g，磷酸氢二钾2.5g，酵母浸膏3g，乳糖2.5g，氯化钠5g，琼脂15g，水1000ml；pH7.0)平板培养基上，再用玻璃刮铲涂匀，置25℃温箱中培养24小时后取出培养基平板。
高产菌株的筛选将活化好的菌种接种于液体TS培养基中，于25℃、200rpm下培养24小时，将此菌株用摇瓶进行发酵实验，以检测其产酶能力及高低。检测其产酶能力未发生退化者可作为生产菌株使用。液体发酵，用500mL三角瓶装入60mL发酵培养基里，120℃20min，冷却后接入普通培养菌种2mL，25℃，200rpm培养，测定乳糖酶活性进行复筛。
取纯化的菌株，在TSA平板上25℃涂布倒置培养24h，用8.5％生理盐水5ml洗涤1次，将其接种于含60ml摇瓶培养基的500ml摇瓶中，200r/min，28℃摇床培养24h。
实施例2G2005乳糖酶活力检测方法根据FCC标准，fourth edition，July 1，1996，page 801 to 802/乳糖酶(中性)/(β-半乳糖苷酶)的活性(Lacttase(neutral)β-gulactosidase/activity)。乳球菌乳糖酶测试方法及G2005乳糖酶特性，在测试过程中温度定为50℃、pH为7.0。
1.定义1克固体酶粉(或1ml液体酶)，在一定温度下和pH条件下，1分钟水解ONPG(邻硝基苯酚半乳糖苷)产生1umol酪氨酸为一个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。
2.比色法2.1原理G2005乳糖酶在50℃，pH7.0条件下，水解ONPG底物，产生含有酚基的ONP，在碱性条件下，ONPG显黄色，用分光光度计测定，计算其酶活力。
2.2试剂与溶液2.2.1磷酸钠缓冲液的制备分别取1mol/LNa2HPO4与1mol/LNaH2PO4缓冲液30ml与70ml混合于容量瓶中，定容至1000ml，即0.1mol/L磷酸钠缓冲液，贮于棕色瓶内。
2.2.2碳酸钠溶液c(Na2CO3)＝0.5mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)50g，用水溶解并定溶至1000ml。
2.2.3 2.5g/L ONPG底物溶液称取ONPG 0.250g，精确至0.001g，用70ml蒸馏水后，再加入适量的pH6.5的磷酸缓冲液约30ml，加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入25ml容量瓶中，用适量的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液于棕色试剂瓶中冰箱中保存，有效期为半年。
2.2.4 240umol/ml ONP标准溶液称取恒重的ONP3.3386g，精确至0.0002g，用蒸馏水70ml溶解后，再用30ml 0.1mol/L磷酸钠缓冲液定溶至100ml，即为240umol/mlONP标准溶液。
取240umol/ml ONP标准溶液10.00ml，用蒸馏水定溶至100ml，即得到24umol/ml。
2.3仪器和设备2.3.1恒温水浴 50±0.2℃、60±0.2℃。
2.3.2分光光度计 应符合GB 9721的规定。
2.4.测定步骤2.4.1标准曲线的绘制2.4.1.1ONP标准溶液按下表配制
2.4.1.2.分别取上述溶注液各0.5ml磷酸钠缓冲液(须做平行试验)，各加0.4mol/ml碳酸钠溶液0.80ml，置于50℃水浴中显色15分钟，取出用分光光度计于波长420nm，10mm比色皿，以不含ONP的0号管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，ONP的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。
根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的ONP的量(umol)，即为吸光常数K值。其K值应在100左右。
2.5.待测酶样的制备与测定2.5.1粗酶液的制备取5ml培养菌悬液于50ml离心管中，在冰水浴中用超声波仪(破壁)。在10强度下破壁5min，使酶从菌体中释放出来。
2.5.2.测定吸取0.2ml的0.25％ONPG溶液加入试管中，加入0.5ml的磷酸钠缓冲液，水浴5min，加入1ml适当稀释的酶液，保温15min，加入0.8ml的5％碳酸钠溶液终止反应，再加入蒸馏水定容至8ml，于420nm波长处比色，测定OD420nm值。以煮沸失活的酶液同样处理为对照。
(*本实验的稀释倍数均为50倍)先将0.2ulONPG与0.5ml磷酸钠缓冲液放入50℃恒温水浴中，预热5分钟。并按如图1所述的程序操作2.5.3.计算在此条件下，每分钟水解产生1umol邻硝基苯酚(ONP)的酶活力定义为1u单位。ONP浓度与OD420nm值之间存在线性关系，如图1，根据测得的OD420nm值，从图1中查出对应的ONP浓度，通过下式求得酶活力U=C×101000×15×0.5×N×4=2NC375(u/ml)]]>其中C为[ONP]，N为稀释倍数。
(*本实验的稀释倍数均为50倍式中U-样品的酶活力，u/ml(u/g)；8-反应试剂的总体积，ml；15-反应时间15分钟，以分钟计；N-稀释倍数。
所测定的结果表示为整数。平行试验相对误差不超过3％。
实施例3本发明菌株不同温度的酶学特性培养基胰蛋白胨15g，豆蛋白胨5g，氯化钠5g，乳糖2.5g，磷酸氢二钾2.5g，水1000ml，pH7。
于30℃、200转/分钟、60ml物料/瓶(500ml摇瓶)、加棉塞，培养48h，取5ml培养菌悬液于50ml离心管中，在冰水浴中用超声波仪(破壁)。在10强度下破壁5min，使酶从菌体中释放出来。取出用分光光度计于波长420nm，10mm比色皿，以不含ONP的管为空白，于0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃分别测定其吸光度，计算出酶活分别为5.53、5.86、6.06、6.19、6.46、7.85、7.85、9.83、10.76、13.20、7.78。因此本发明乳球菌菌株(Lacfococcus sp.)具有温度对酶活影响大的特性，0℃-35℃酶活较低，40℃-50℃酶活较高，且酶最适反应温度50℃时，该酶产生菌乳球菌(CGMCC.No.1425)不能生长(图1)。
实施例4本发明菌株不同温度的生物学特性培养基胰蛋白胨15g，豆蛋白胨5g，氯化钠5g，乳糖2.5g，磷酸氢二钾2.5g，水1000ml，pH7。
本发明乳球菌(Lacfococcus sp.)菌株具有温度对该菌生长有一定影响特性。乳球菌(Lacfococcus sp.)划线接种于培养基，倒置培养于4℃冰箱，7d菌落直径1mm，说明该菌株G2005在4℃可生长。生长温度范围4℃-42℃，最适生长温度为30℃。乳球菌菌株(Lacfococcus sp.)接种于摇瓶培养基，倒置培养于4℃冰箱，7d菌落直径1mm，说明该菌株G2005在4℃可生长。生长温度范围4℃-42℃，最适生长温度为30℃。分别于30℃、42℃、200转/分钟、60ml物料/瓶(500ml摇瓶)、加棉塞，培养时间分别2d，取5ml培养菌悬液于50ml离心管中，取出用分光光度计于波长620nm，10mm比色皿，以未接种管为空白，分别测定其吸光度。同时用分光光度计于波长620nm，10mm比色皿，以未接菌培养基的管为空白，测定OD320分别为1.201、0.832，说明42℃不利于菌株生长，而30℃有利于菌株生长(图2、图3)。
实施例5本发明发酵培养基的筛选培养基是发酵工艺技术的基础，本着高产酶率、低成本的原则，在实验室研究的基础上进行了工业化中试研究的培养基筛选和优化。碳源选择葡萄糖、乳糖，氮源为胰蛋白胨、豆蛋白胨，并加入一定量Na、K离子，促进菌体生产和产酶率的提高，并以磷酸盐调节培养基在发酵过程中pH的变化。
1、菌株筛选培养基胰蛋白胨15g，豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15-20g，乳糖2.5g，磷酸氢二钾2.5g，X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳吡喃糖苷)0.1g，水800ml，pH6.5-7.2。
2、摇瓶检测培养基胰蛋白胨15g，豆蛋白胨5g，氯化钠5g，乳糖2.5g，磷酸氢二钾2.5g，水1000ml，pH6.5。
3、种子培养基和发酵优选培养基3.1.种子培养基胰蛋白胨15g，豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15-20g，乳糖2.5g，磷酸氢二钾2.5g，水800ml，pH6.5。
用筛选所用的摇瓶培养法，将所有可能影响菌株生长的因素行逐一的测定。在每个组分中，以不缺少各因素为对照，而以缺少其中一因素来进行测定，根据酶活大小判定培养该菌株产酶所需要的培养基组分及因素。在进行了培养基中各组分及各因素的判定后，对所需要的成分利用正交实验进行定量分析，达到培养基中成分的优化组合，以摇瓶检测培养基为水平1，设计正交方案为5水平，4重复进行筛选优化培养基如下，选用L16(4)5正交表。
3.2.摇瓶发酵优选培养基胰蛋白胨7.5g，豆蛋白胨5g，氯化钠5g，乳糖2g，磷酸氢二钾2.5g，水1000ml，pH7.0。
实施例6本发明的摇瓶发酵工艺研究首先，在菌株筛选培养基上活化菌株G2005于28℃培养箱中24h，然后挑取一单菌落用无菌水稀释，吸取0.2mL涂于筛选培养基上，倒置于28℃培养箱中24h，加入5mL无菌水用接种环刮下菌苔接入发酵摇瓶培养基中(优选发酵培养基胰蛋白胨7.5g，豆蛋白胨5g，氯化钠5g，乳糖2g，磷酸氢二钾2.5g，水1000ml，pH7.0。)，于200rpm恒温摇床30℃培养72h在摇瓶，收集发酵液用于酶制剂的生产。试验中发现摇床温度和三角瓶装料量对该酶的产率有较大影响，在摇瓶试验中发现摇床温度和三角瓶装料量对该酶的产率有较大影响，在一定范围内升高摇床温度可使酶的产率提高，20℃、30℃、35℃摇瓶发酵72小时的酶活分别为15.1、25.3、18.2；500ml三角瓶装60ml培养基较装100ml培养基的产酶率高36.4％。
因此，优化发酵工艺为发酵温度30℃、通气量1∶1.2vvm、搅拌速度为200rpm、发酵周期72h。实验表明，发酵培养基中乳糖浓度对菌株G2005产酶有一定影响，3％乳糖发酵浓度与12％乳糖浓度相比，酶活没有提高。因此优选发酵乳糖浓度为3％。
实施例7本发明酶制剂的制备液体酶制剂的制备过程简单，直接将发酵预处理液取5ml摇瓶培养菌悬液于50ml，在冰水浴中用超声波仪(破壁)。在10强度下破壁5min，使酶从菌体中释放出来。加入防腐剂低温密封即可。
权利要求
1.一种具有产生β-半乳糖苷酶菌株能力的短芽孢杆菌(CGMCC.No.1425)。
2.一种β-半乳糖苷酶的生产工艺，其包括A对乳球菌(CGMCC.No.1425)进行菌种活化培养步骤；B利用步骤A获得的活化菌种进行发酵步骤。
3.如权利要求2所述的生产工艺，其特征在于发酵步骤中，接种量为1％-15％，发酵温度4℃-42℃、pH范围为5-8、通气量1∶0.2-0.5vvm、搅拌速度为150-200rpm、发酵周期24-32小时，还原糖0.5％以下时，发酵结束。
4.如权利要求3所述的生产工艺，其特征在于发酵培养基中加入0.2％-0.7％的Na离子和K离子，并以磷酸盐、碳酸盐中选择一种调节发酵过程中pH。
5.如权利要求3所述的生产工艺，其特征在于发酵中，该菌最适生长温度为30℃，发酵乳糖浓度为3％，最适生长pH7。
6.一种β-半乳糖苷酶，其利用权利要求1所述的短芽孢杆菌(CGMCC.No.1424)，由权利要求2所述的生产工艺制备而成。
7.如权利要求6所述的β-半乳糖苷酶，其特征在于，利用权利要求1所述菌株发酵获得，在发酵过程中，反应温度40-60℃，并且，最适酶反应温度滞后于菌株最适生长温度，发酵酶活达21u/ml。
8.如权利要求7所述的β-半乳糖苷酶，其特征在于，利用权利要求1所述菌株发酵获得，在发酵过程中，乳糖酶最适反应温度为50℃。
全文摘要
本发明公开了一种产生β－半乳糖苷酶的乳球菌(Lacfococcus sp.)和利用此菌株生产β－半乳糖苷酶的生产工艺，本发明还同时提供了β－半乳糖苷酶。本发明利用乳球菌(CGMCC.No.1425)，建立菌种保藏、复壮及选育的工艺技术，通过培养基配方优化筛选及发酵工艺条件优化控制，使发酵周期缩短，确立了稳定的发酵工艺，本发明的β－半乳糖苷酶具有良好的高温活性、高酶活。其产品广泛用于发酵乳、饮料、冰激凌糖等食品医药、环境检测等各个领域，解除乳糖不耐受患者因食用乳制品引起的腹泻、腹胀等多种不良反应，能最大限度地保留其营养及风味物质方面具有重要意义。
文档编号C12N9/38GK1932003SQ200510096898
公开日2007年3月21日 申请日期2005年9月16日 优先权日2005年9月16日
发明者史应武, 娄恺, 魏东, 欧提库尔, 常玮 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所