专利名称：人白细胞介素8拮抗蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域的基因克隆、基因重组、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白的纯化、人白细胞介素8拮抗蛋白在体外对天然人白细胞介素8趋化活性的抑制作用等技术，涉及一种抗炎症药物蛋白及其制备方法，特别涉及能够与天然人白细胞介素8竞争性结合受体的突变蛋白及其制备方法。
背景技术：
1.IL-8的相关研究白细胞介素8(Interleukin-8，IL-8)是一种能激活嗜中性粒细胞的趋化因子，最初是在被激活的单核细胞上清液中发现的，在1989年一次世界细胞因子会议上被命名为IL-8。IL-8属于趋化因子家族的C-X-C类趋化因子，由单核巨噬细胞产生，能诱导多种白细胞趋化运动。
1.1 IL-8的结构和特点白细胞介素8(Interleukin-8，IL-8)是一种能激活嗜中性粒细胞的趋化因子，是一种具有内源性白细胞趋化性和活化性作用的碱基-肝素结合性蛋白质。IL-8最初是在被激活的单核细胞上清液中发现的一种具有中性粒细胞趋化活性的物质，在1989年一次世界细胞因子会议上被命名为IL-8。IL-8属于趋化因子家族的C-X-C类趋化因子，由单核巨噬细胞产生，能诱导多种白细胞趋化运动。IL-8有不同的异构体，分别在N端减少不同数目的氨基酸。细胞首先合成IL-8前体蛋白即I型IL-8(99肽，N端20个氨基酸残基组成高度疏水的信号肽)，再由不同的特异性蛋白酶直接酶解IL-8前体N端的不同部位，产生不同分子量的IL-8。IL-8的成熟形式有4种，即分别由72个(70％)、77个(17％)、70个(8％)和69个(5％)氨基酸残基组成。其中III型IL-8为72肽，活性最强，即通常所指的成熟IL-8。其分子量只有8Kd(SDS-PAGE)，含两个活性必需的二硫键(7-34，9-50)，没有糖基化位点，等电点(PI)为8～8.5。IL-8对胰蛋白酶和糜蛋白酶敏感，并且耐热、耐酸，70℃60分钟处理不能使之灭活，在pH2.4～9.0之间保持稳定。核磁共振和X晶体衍射证明溶液中的IL-8是非共价键连接的同源二聚体，二聚体的交界面以β片层为主，Leu25、Val27、Glu29之间形成的氢键参与二聚体的稳定性，α螺旋结构与β片层的交叉也与二聚体形成有关。IL-8的ELR(Glu4-Leu5-Arg6)结构与其活化中性粒细胞和促血管生成效应有关，无ELR的PF-4、IP-10等C-X-C趋化因子不能活化中性粒细胞并且具有抗血管生成作用，但是，有ELR结构的GRO却抑制血管生成。IL-8C末端(Lys54～C端)是结合毛细血管后静脉内皮细胞表面聚葡糖胺的位点，这种结合可促进在血管表面滚动的白细胞粘附于内皮细胞，并进一步穿过血管。
1.2 IL-8的产生和调节许多细胞在适当刺激后都能产生IL-8，包括单核巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、髓样细胞前体、滑膜细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、角质细胞、软骨细胞、间皮细胞、羊膜细胞、星形细胞、肾小球细胞和肝细胞。一些肿瘤细胞株也能产生IL-8，例如黑色素瘤细胞、纤维肉瘤细胞、肺的大细胞癌细胞、骨肉瘤细胞等。
许多不同的因子均能诱导IL-8的产生。人们最早发现的能诱导单核细胞产生IL-8的诱导剂是LPS，后来发现IL-1β和TNF-α等也能诱导一些细胞产生IL-8，但是LPS对单核细胞的作用最强，而在大多数细胞类型中IL-1β和TNF-α的诱导IL-8表达的作用最强。PHA能诱导T淋巴细胞产生IL-8。肺泡巨噬细胞和内皮细胞经LPS刺激也能表达IL-8。白细胞介素-17诱导上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞等产生IL-8。总之，不同类型的细胞对不同的诱导剂的反应是不相同的。
受到适宜刺激后，细胞能很快地表达IL-8mRNA。应用同位素标记的寡核苷酸探针或IL-8cDNA探针作Northern杂交，发现在受刺激后1h内可以检测到特异性IL-8mRNA。如果在刺激之前，用放线菌素酮处理内皮细胞，能够超强诱导IL-8mRNA的表达。说明IL-8基因表达不依赖某些细胞内蛋白的合成，而是在一种阻遏蛋白的控制之下。层流低切应力(后微静脉水平)作用于体外培养的人脐静脉内皮细胞后1h，IL-8mRNA表达明显增高同时伴有细胞内基因结合核因子(Nuclear-factor-genebinding，NF-κB)的激活，激活程度与作用时间有关。2h达到峰值，3h时开始下降，4h后IL-8mRNA持续低表达，呈现IL-8mRNA随切应力作用时间的双相性变化规律。低切应力可以诱导内皮细胞表达IL-8，可能参与炎症性疾病和心脑血管疾病的发生、发展和预后过程。
1.3 L-8受体IL-8是通过受体发挥作用的。几乎所有细胞上都有IL-8受体。IL-8和其他中性粒细胞趋化物质之间没有交叉反应。有两种高亲和力受体(Kd＝0.2～1.2nmol/L)CXCR1(IL-8Rα、IL-8R I或IL-8A)和CXCR2(IL-8Rβ、IL-8RII或IL-8B)，两者的氨基酸序列有77％的同源性，都属于有7个穿膜区的GTP结合蛋白(G蛋白)相关受体超家族。CXCR1含350个氨基酸，其细胞外部分有5个糖基化位点，一个二硫键和两个游离的Cys巯基，分子量约40kD，糖基化后55～69kD。CXCR2含有355个氨基酸，只有5个糖基化位点，分子量约59kD。CXCR1与IL-8特异性结合，与其它C-X-C趋化因子亲和力低，而CXCR2也能高亲和力结合NAP-2、GRO-α、GRO-β等，IL-8受体结合配体的异质性取决于受体分子N末端，受体结合IL-8的区域有两个构象上接近的游离巯基，它们是结合活性所必需的。两种IL-8R基因以及一个IL-8R假基因均位于人染色体2q34-35。红细胞膜上还有一种39kD的IL-8结合蛋白或称趋化因子的Duffy抗原受体(Duffyantigenreceptorforchemokines，DARC)，也是Duffy血型抗原和介导间日疟原虫进入红细胞的分子。其它C-C和C-X-C趋化因子也可结合该受体，并能与IL-8相互竞争。脑中，肾和脾脏的毛细血管后静脉内皮细胞均表达DARC。
1.4 IL-8的生物学活性IL-8选择性诱导中性粒细胞、T淋巴细胞和嗜碱性粒细胞趋化，而对嗜酸性粒细胞和单核细胞没有趋化作用。
IL-8可增强中性粒细胞的功能诱导中性粒细胞脱颗粒，释放颗粒中的β葡萄糖苷酸酶、弹性蛋白酶、髓过氧化物酶、胶原酶B、维生素B12结合蛋白和乳铁蛋白；刺激胞浆内钙离子快速增加；诱导呼吸爆发产生超氧化离子和过氧化氢。在有外源性花生四烯酸时，IL-8和C5a、FMLP、PAF一样能活化中性粒细胞中花生四烯酸-5-脂氧化酶，释放LTB4(白三烯B4)。IL-8能刺激中性粒细胞吞噬调理颗粒，并间接增强中性粒细胞对白色念珠菌的生长抑制作用。IL-8能抑制中性粒细胞对细胞因子活化的内皮细胞单层的粘附，防止中性粒细胞对内皮细胞的损伤作用；高剂量IL-8则增强中性粒细胞粘附未活化内皮细胞的能力。IL-8诱导中性粒细胞表达L选择素、CD11a/CD18和CD11b/CD18分子，促进细胞粘附内皮细胞单层和穿过血管壁。中性粒细胞结合肝素或硫酸肝素后对IL-8的反应增强。
IL-8对T细胞的趋化作用有不同的报道比中性粒细胞强10倍，相等或不能趋化T细胞；对IL-8反应的T细胞是活化的T细胞或小T细胞。IL-8能选择性抑制IL-4诱导的B细胞产生IgE。
IL-8能诱导经GM-CSF或IL-3处理的嗜碱性粒细胞趋化，特应性匹炎和过敏性哮喘病人的外周嗜碱性粒细胞对IL-8的趋化反应增强。
IL-8能诱导IL-2激活的NK细胞趋化，诱导黑色素瘤细胞接触性移动，促进内皮细胞趋化。IL-8诱导角质细胞和黑色素细胞增殖和趋化。IL-8能刺激功能性造血细胞从骨髓进入外周，但抑制髓样造血前体细胞增值。IL-8也能诱导血管生成。
在体内，局部注射IL-8能增加血管的通透性，诱导中性粒细胞、淋巴细胞浸润。皮内注射IL-8导致血浆渗出和中性粒细胞积聚于局部，两种反应发生快、持续时间短，抗白细胞整合素抗体抑制这些效应。IL-8诱导的组织学损伤包括中性粒细胞积聚在血管、凝块形成和血管壁损伤。
动物静脉注射IL-8立即引起白细胞减少，然后是较长时间的中性粒细胞血症，伴有各个阶段的中性粒细胞从骨髓中释放。IL-8诱导的中性粒细胞血症对体内抗感染的非特异性防护可能有重要作用。中性粒细胞与血管内皮细胞的粘附同样会引起全身血管效应中性粒细胞积聚、凝块形成和血管壁损伤。
大鼠脚趾压迫试验证明，IL-8是交感神经疼痛的介质之一。除了促炎症效应外，IL-8还有生长调节作用促进大鼠角膜中血管生成作用，诱导兔角膜囊模型产生新的血管，启动内皮细胞增殖和增加神经原存活期等。
1.5 IL-8的作用机理IL-8与其受体结合后，配体-受体复合物被内吞，然后受体再循环，在60分钟内迅速重现在细胞膜表面，阻断其受体的再循环可引起IL-8介导的趋化反应的减弱。IL-8与受体结合后激活百日咳毒素敏感的受体偶联G蛋白，特别是Gαi蛋白。G蛋白转换成GTP结合的形式后，解离成Gα和Gβγ两个亚单位。其中Gβγ处于与受体复合物相近的位置，募集并激活磷脂酰肌醇3激酶γ(PI3K-γ)，后者产生3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3激活蛋白激酶K(Akt)和GTP酶(GTPases)，导致直接的细胞迁移。如果缺乏磷脂酶Cβ2+3，一种产生1，4，5-三磷酸肌醇和甘油二酯的关键酶，IL-8诱导的细胞外钙离子升高、蛋白激酶C磷酸化、p47的移位以及超氧化阴离子的产生等作用就会消失，但是能增强其介导的趋化作用。在PI3K-γ基因敲除小鼠中，由IL-8介导的中性粒细胞迁移、PIP3的产生、Akt的磷酸化以及呼吸爆发(细胞外钙离子浓度快速上升)等作用都减弱了。这些结果都表面了IL-8介导的细胞趋化作用是通过PI3K-γ依赖和非依赖途径进行的。
1.6 IL-8在疾病发生、发展中的作用目前已发现有50多种趋化因子和20多种趋化因子受体。但IL-8自发现以来，一直在趋化性细胞因子中是一个比较活跃的研究领域。据不完全统计，在1987～2000年间已发表的涉及趋化性细胞因子的文献有150000多条。其中和IL-8有关的文献则有1/5之多，约为其它趋化性细胞因子的2～10倍。这个现象至少反映一个问题，即在各种非特异性炎症的病理发生过程中极其频繁地有IL-8的参与，以及IL-8基因易于受到外界的刺激而被激活。
1.6.1 IL-8在类风湿性关节炎中的作用。
在类风湿关节炎患者的滑膜组织和滑膜液中的都存在着大量的IL-8，而且在受累关节中IL-8的蛋白和mRNA水平与未受累关节相比明显升高，提示IL-8在类风湿性关节炎的发生、发展过程中起着重要作用。给兔子关节腔中直接注射IL-8可以观察到剂量和时间依赖性的关节炎的起始病理变化，包括关节腔内中性粒细胞的聚集，这充分证明了IL-8在类风湿关节炎的病理变化过程中起着重要作用。另外一些研究也证实了IL-8在单核细胞向滑膜组织的运动过程中起着主导作用。
1.6.2 IL-8在缺血再灌注损伤中的作用。
短暂缺血后再灌注会引起比缺血更严重的损伤。缺血再灌注损伤中会产生大量的氧自由基，病理表现为大量的中性粒细胞浸润，有一些证据表明氧自由基可以调节IL-8的产生。在心肌再灌注过程中，IL-8基因的表达发生在中性粒细胞浸润及其介导的组织损伤之前。在肺缺血再灌注损伤中，缺血可以诱导IL-8在局部的表达、大量的中性粒细胞浸润、肺水肿，最后导致肺结构的严重破坏。在脑的缺血再灌注损伤中，IL-8在再灌注开始后6小时的脑组织匀浆中的浓度明显升高，而血浆中的IL-8水平却没有明显变化。在肝脏的缺血再灌注损伤中，抗IL-8单克隆抗体可明显阻断再灌注过程中中性粒细胞对肝脏的浸润，肝细胞虽仍有肿胀现象，但细胞呈正常的规则排列，细胞壁结构完整，显示在肝再灌注损伤过程中，IL-8是趋化中性粒细胞浸润的关键因子。
1.6.3 IL-8在肿瘤中的作用IL-8在黑色素瘤、肝和胰腺及结肠癌细胞中都具有生长因子的作用。研究发现，IL-8是一个血管生成因子，重组IL-8能够在体外介导内皮细胞的趋化和增殖活性，在体内介导血管生成活性[24，25]。IL-8诱导血管生成的活性与TNF-a，aFGF，bFGF，angiogenin，angiotropin和VEGF等相当。人肿瘤细胞系能够直接表达IL-8，新鲜分离的人非小细胞肺癌中的IL-8水平明显升高，这与人非小细胞肺癌肿瘤组织中42-80％的血管生成活性有关，这表明肿瘤细胞分泌IL-8这个血管生成因子可能对肿瘤新生血管的生成是非常重要的，而后者是肿瘤发生、发展的必要条件。临床研究表明，在人乳腺癌组织中IL-8在mRNA水平明显高于人正常乳腺组织[28]，高表达IL-8的乳腺癌细胞系的侵袭性明显增强。在黑色素瘤细胞系中，IL-8表达水平与它们的生长与侵袭密切相关[29]。
1.6.4 IL-8在肺部疾病中的病理作用IL-8在肺部疾病中起着重要的作用。在细菌或病毒感染性的肺部疾病中，由于细菌或病毒的产物能够诱导IL-8的表达，从而引起中性粒细胞向肺组织趋化，最后引起炎症反应.在呼吸窘迫综合症(ARDS)病人中，在支气管肺泡灌洗液中的IL-8的含量明显增高，这提示IL-8在ARDS的发生、发展过程中起着重要作用。另外，在特应性肺纤维化、类肉瘤病、金属烟尘热、石棉沉积症等病人的肺泡灌洗液中有高水平的IL-8，在慢性哮喘和囊性纤维变性病人的支气管上皮细胞产生IL-8也升高，提示IL-8是引起肺组织病理变化的重要介质。
2.1阻断IL-8活性对疾病的治疗作用2.2.1抗IL-8单克隆抗体在炎症性疾病中的应用急性呼吸窘迫综合症(ARDS)是临床上一种比较严重的肺部疾病，死亡率达到50％。Mukaida等给兔子静脉注射细菌内毒素(LPS)，诱导兔子产生与临床上极为相似的ARDS的症状，从而制成ARDS的动物模型。利用抗IL-8单克隆抗体可以防止ARDS的发生支气管肺泡灌洗液中的髓过氧化物酶的活性(代表中性粒细胞的聚集)、蛋白浓度(代表渗漏到肺泡中的蛋白量)以及肺的湿/干比(代表肺水肿的程度)在接受了LPS后的升高几乎完全被抗IL-8单克隆抗体抑制了。同样，抗IL-8单克隆抗体明显提高了兔子的存活率6-8小时内抗IL-8单克隆抗体治疗组只有30％的兔子死亡，而对照组则有70％的兔子死亡。这个试验说明在LPS诱导的ARDS动物模型中，IL-8起着重要的病理作用，抗IL-8单克隆抗体能够有效治疗ARDS。
在LPS和IL-1诱导的关节炎模型中，抗IL-8单克隆抗体能够显著降低中性粒细胞向关节腔的浸润，降低的幅度在4小时和8小时分别为93％和89％，同时能够保护关节腔滑膜不受到破坏。在内毒素引起的胸膜炎动物模型中，能够降低中性粒细胞向胸膜腔的浸润，降低的幅度达到77％。
一种叫做ABX-IL8的完全人源化的抗IL-8单克隆抗体(IgG2)用于治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)已经进入临床试验，临床II期的试验结果表明该抗体应用于人体是安全的，人体对其耐受性良好，没有发现明显的毒副作用。COPD病人每隔一个月注射一次ABX-IL8，一共三个月，可以改善病人的呼吸困难的症状。呼吸困难的症状从第一次注射后两周开始减轻，抑制作用持续两个月的时间。这个试验结果为进一步研究该药物提供了初步的支持。
在我国，含有抗IL-8单克隆抗体的乳剂已经进入临床应用，在治疗银屑病方面取得了较好的疗效。
2.2.2抗IL-8单克隆抗体在肿瘤中的应用由于IL-8在肿瘤生长、转移中的作用近年来日益引起人们的重视，所以利用抗IL-8单克隆抗体来治疗肿瘤成为肿瘤治疗的研究热点之一。
利用抗IL-8单克隆抗体与表皮生长因子受体(EGFR)的抗体联合治疗乳腺癌的小鼠移植瘤模型，虽然抗IL-8单克隆抗体单独应用没有明显的抑制乳腺癌转移的作用，但是与EGFR的抗体联合应用却能够明显加强后者的抗肿瘤效果，提高荷瘤小鼠的存活率[45]。抗IL-8单克隆抗体的这种作用可能是通过中和肿瘤细胞产生的IL-8，从而减少IL-8诱导的金属基质蛋白酶(MMP)的产生，抑制肿瘤的转移。
将人黑色素瘤细胞系A375SM(高表达IL-8)和TXM-13(中度表达IL-8)分别皮下接种到裸鼠体内，然后用抗IL-8单克隆抗体(腹腔注射，一周共1mg，分三次注射，治疗3周)。与对照组相比，治疗组的肿瘤生长受到了明显的抑制。同时，抗IL-8单克隆抗体也能明显抑制经静脉注射黑色素瘤细胞引起的肿瘤转移。体内外试验均表明抗IL-8单克隆抗体通过阻断IL-8，抑制MMP-2的表达，降低肿瘤细胞的侵袭性。另外，体外小管形成试验证实抗IL-8单克隆抗体能够直接干预脐带静脉内皮细胞的血管形成试验[46]。
抗IL-8单克隆抗体在体外对膀胱癌细胞的生长没有影响，但是如果将膀胱癌细胞皮下接种到裸鼠体内，经过四周的治疗(每周100μg腹腔注射)，抗IL-8单克隆抗体能够明显抑制肿瘤的生长，通过阻断IL-8能够明显抑制MMP-2和MMP-9的表达、活性和转录，这种作用是通过调节转录因子NF-κB的表达和转录实现的。
2.3 IL-8受体拮抗剂的研究进展除了单克隆抗体外，抑制IL-8与其受体的结合是降低其活性的另一种有效的方法。由于IL-8分子N端的ELR序列对于与受体结合和激活是必需的，有报道用化学合成的方法将ELR基序突变成AAR后可以与IL-8受体结合，但不能激活受体。迄今为止，尚无用基因工程表达IL-8受体拮抗剂蛋白的报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种能够与天然IL-8分子竞争结合受体，从而抑制其生物学活性的IL-8受体拮抗蛋白(rmhIL-8)及其制备方法。本发明的人白细胞介素8拮抗蛋白有可能为急、慢性炎症的治疗提供一种新的蛋白质药物。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是，利用PCR的方法使天然IL-8的活性部位即N端的ELR基序突变为AAR，使其保留了与受体结合的能力而失去了激活受体的的能力，从而构建出一种IL-8的受体拮抗剂蛋白。其特点是，能竞争性抑制天然IL-8的活性，对炎症性疾病起到治疗作用。PCR方法构建的IL-8突变体基因，在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到rmhIL-8蛋白。
表达产物经裂菌、加热、SP离子层析柱的纯化，蛋白纯度可达95％以上。纯化后的rmhIL-8在体外能够抑制IL-8诱导的中性粒细胞的趋化。在大鼠体内rmhIL-8能够抑制糖原诱导的中性粒细胞向腹腔的转移。
本发明的IL-8的受体拮抗剂蛋白，其制备方法是，PCR方法对天然IL-8基因进行突变，构建rmhIL-8基因；含有目的基因rmhIL-8的原核表达载体的构建及重组蛋白表达；表达产物的鉴定；重组蛋白的纯化；rmhIL-8在体外对天然IL-8趋化活性的抑制作用的研究和在大鼠体内对IL-8诱导的中性粒细胞趋化的抑制作用的研究。
本发明的IL-8的受体拮抗剂蛋白(rmhIL-8)，通过与IL-8受体结合，竞争性的抑制天然IL-8的趋化作用，从而有可能为急、慢性炎症的治疗提供一种新的蛋白质药物。
图1是pET-22b(+)-rmhIL-8的测序的基因序列的结果；图2是PCR产物琼脂糖电泳图，图中1表示DNAmarker；2表示目的基因；图3是pET-22b(+)-rmhIL-8重组质粒的酶切鉴定结果图；图中1表示DNAmarker；2表示pET-22b(+)-rmhIL-8；图4是rmhIL-8表达产物的SDS-PAGE；图中41为肽marker；42为诱导前；43诱导后；44裂菌沉淀；45裂菌上清；图5是表达菌体裂菌产物加热后的上清；图中标号41为肽marker；52加热前裂菌上清；53为50℃加热10min上清；54为60℃加热10min上清；55为70℃加热10min上清；56为80℃加热10min上清；图6是rmhIL-8纯化产物的SDS-PAGE；其中图(A)是ArmhIL-8纯化后的图片，图(B)BWestern-blot的图片，图中标号61、肽marker，62、加热后上清，63、纯化后rmhIL-8(非还原)，64、纯化后rmhIL-8(还原)；65、纯化后rmhIL-8(非还原)，66纯化后rmhIL-8(还原)；图7是rmhIL-8在体外对天然IL-8趋化活性的抑制作用；图中符号◆rmhIL-8，▲抗TNF无关抗体，■抗IL-8抗体。
图8是体内对IL-8诱导的中性粒细胞趋化的抑制作用直方图。
为了更清楚的理解本发明，以下结合发明人完成的实施例对本发明作进一步的详细描述。
具体实施例方式
依本发明的技术方案，IL-8受体拮抗剂蛋白，选择把天然IL-8分子的活性部位即N端的ELR基序突变为AAR基序，构成IL-8分子突变体，它具有与IL-8受体结合的能力，但不能激活IL-8受体。采用PCR方法克隆rmhIL-8基因，构建原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经加热、SP离子层析柱的纯化，蛋白纯度可达95％以上。纯化后的rmhIL-8在体外能够抑制IL-8诱导的中性粒细胞的趋化。在大鼠体内rmhIL-8能够抑制糖原诱导的中性粒细胞向腹腔的转移。
实现本发明IL-8的受体拮抗剂蛋白(rmhIL-8)，其制备方法按以下步骤进行3.1 rmhIL-8基因的克隆及原核表达载体的构建PCR反应引物设计如下，将NdeI酶切位点引入5’端引物，SalI酶切位点引入3’端引物P1(5’端引物29nt)5’AGCATATGGCCGCGCGTTGTCAGTGCATA3’P2(3’端引物29nt)5’AGGTCGACTTATGAGTTCTCAGCCCTCTT3’对pBV220-IL-8质粒按下述条件进行PCR扩增。
PCR扩增反应管组成PBV220-IL-8(模板DNA，200ng/ml)0.5μl2.5mMdNTPs1μl25mMMgCl24μlP1(20μM)0.5μlP2(20μM)0.5μlTaq酶(5.0U/μl)0.5μl10×PCRBuffer5μlH2O38μl总计50μl反应管的配制均在冰浴中进行，配制过程中，先加水、模板DNA及其他反应组分，95℃反应5min，再加入Taq酶，然后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为94℃，60s(变性)；55℃，60s(退火)；72℃，60s(扩增)，进行30个循环，再于72℃延伸15min。PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳，可见预期大小的DNA片段(图2)。
原核表达载体pET-22b(+)经NdeI和SalI双酶切后回收大片段，回收的片段与上述的PCR产物经同样双酶切的回收产物进行连接反应。连接产物转化感受态细胞BL21(DE3)，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段(图3)，进行测序(图1)。测序正确的质粒命名为pET-22b(+)-rmhIL-8。工程菌命名为pET-22b(+)-rmhIL-8/BL21(DE3)。
其基因序列为
CATATGGCCGCGCGTTGTCAGTGCATAAAGACATACTCCAAACCTTTCCACCCCAAATTTATCAAAGAACTGAGAGTGATTGAGAGTGGACCACACTGCGCCAACACAGAAATTATTGTAAAACTTTCTGATGGAAGAGAGCTCTGTCTGGACCCCAAGGAAAACTGGGTGCAGAGGGTTGTGGAGAAGTTTTTGAAGAGGGCTGAGAACTCATAAGTCGAC(参见图1)。
3.2重组蛋白表达挑取工程菌单菌落接种于5mLLB培养液(含Amp100mg/L)中，37℃摇床培养过夜，次日以1∶100的比例转接到含Amp的LB培养液中，在37℃摇床培养3h至对数生长中期(OD600为0.4～0.6)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养4h。离心收集菌体。
3.3表达产物的鉴定用Trcine-SDS-PAGE分析表达产物及表达形式(图4)，并用Western-Blot方法对表达产物的免疫源性进行鉴定。
3.3.1 Tricine-SDS-PAGE3.3.1.1电泳缓冲液的配制如下表所示
*用HCl调pH值，**pH值约为8.25。
3.3.1.2丙烯酰胺贮存液的配制如下表所示
其中T丙烯酰胺的总浓度；C交联度3.3.1.3胶的制备与一般SDS-PAGE相似，按下表配制分离胶和浓缩胶
3.3.1.4电泳过程样品与样品缓冲液混合煮沸2min，将灌胶的玻璃板固定在电泳装置上，用1％琼脂糖封边，倒入阴极缓冲液，加样，放入电泳槽，倒入阳极缓冲液，恒压70V电泳5-7h，染色、脱色、胶保存。
3.3.2免疫印迹反应Tricine-SDS-PAGE结束后，按Bio-Rad产品说明，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维膜(NC膜)靠近阳极一侧，转移缓冲液(25mmol/LTris、192mmol/LGlycine、20％甲醇)，100V恒压1h，将蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转移结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST(含0.02mol/LpH7.4TBS、0.4％Tween20)室温洗3次，浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中37℃1h，洗涤液(TBST)室温洗3次，加鼠抗人IL-8mAb，37℃孵育1h，TBST室温洗膜3次，加入羊抗鼠IgG-AP二抗，37℃孵育1h，TBST室温洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入显色液中，室温避光显色5min，蒸镏水冲洗终止反应。
3.4重组蛋白的纯化将每克诱导后菌体悬浮于10mlSTE[50mmol/LTris.HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA，100mmol/LNaCl]中，加入溶菌酶(0.8mg/g菌体)，搅拌20分钟后，加入脱氧胆酸钠(DOC)，继续搅拌直至悬浮液变为粘稠，再按1克菌体加入1mol/LMgCl20.4ml，搅拌均匀后，按1克菌体加入1mg/mlDNAaseI20μl，搅拌均匀后室温放置30min进行消化。将裂菌产物在70℃加热10min，迅速冷却到0℃，12000r/min离心15min，取上清(图5)。以50倍体积的A液(20mmol/L柠檬酸缓冲液，pH6.0)透析12h，中间换一次透析外液，透析后的上清过用A液充分平衡的过SP-SepharoseFF，洗脱B液为20mmol/L柠檬酸缓冲液pH6.0，1mol/LNaCl，连续梯度，洗脱4-5个柱床体积，收集0.5mol/LNaCl处的洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳检测(图6)。
3.5体外对IL-8趋化活性的抑制作用的研究取新鲜人静脉血加入肝素抗凝管中，与Hank’s液1∶1混合后小心加于2份的PMN细胞分离液的液面上，以1000-1500rpm离心20分钟，收集界面上的细胞，放入含Hank’s液4-5ml的试管中，充分混匀后，以1500-2000rpm离心10分钟。吸取上清液，沉淀用同样方法反复洗涤两次，即得所需的细胞，将细胞悬浮于1ml含5％BSA的RPMI-1640培养液中，检测细胞活力。再用同样培养液将细胞配成3×106/ml立即用于趋化试验。96孔趋化板，其膜厚10μm，孔径3μm。新鲜分离的外周血PMN(中性粒细胞)调节其浓度至106个/ml。上层加20μl的细胞悬液，下层加入29μl样品(用含5％BSA和10ng/mlIL-8的RPMI-1640系列稀释的rmhIL-8，浓度分别为0，0.01，0.1，1，10and100μg/ml)，抗IL-8中和性单抗用作阳性对照，抗TNF无关抗体用作阴性对照。37℃CO2培养箱放置2h后，70％甲醇固定后吉姆萨液染色观察下层膜面上的细胞，用400×光学显微镜观察计算下层细胞数。趋化活性用趋化指数(chemotaticindex，CI)表示，即趋化到膜下表面的细胞数与随机迁移到膜下表面的细胞数(阴性对照组)之比(图7)。
3.6体内趋化抑制试验15只大鼠随机分为3组，试验组大鼠腹腔滴注10ml含0.1％(w/v)牡蛎糖原(sigma)和50μg/mlrnhIL-8的PBS(pH7.2)，阳性对照组大鼠腹腔滴注10ml含0.1％(w/v)牡蛎糖原和50μg/ml的抗IL-8中和性单抗的PBS，阴性对照组大鼠腹腔滴注10ml只含0.1％(w/v)牡蛎糖原的PBS。4h后，处死大鼠，收集腹腔渗出液，计数中性粒细胞含量(图8)。
权利要求
1.人白细胞介素8拮抗蛋白，其特征在于，选择天然人IL-8基因中的活性部位ELR突变为AAR，构建能与天然IL-8竞争结合受体的拮抗蛋白基因rmhIL-8，并在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到rmhIL-8蛋白。
2.实现权利要求1所述的人白细胞介素8拮抗蛋白的制备方法，其特征在于，按以下步骤进行1)人rmhIL-8基因表达载体的构建通过PCR反应获得人rmhIL-8基因，同时将NdeI酶切位点引入5’端引物，SalI酶切位点引入3’端引物，对含有人天然IL-8基因的质粒进行PCR扩增，设计PCR引物如下Primere15’AGCATATGGCCGCGTGTCAGTGCATAAAG3’Primere25’AGGTCGACTTATGAGTTCTCAGCCCTCTT3’PCR扩增反应管的配制均在冰浴中进行，配制过程中，先加水、模板DNA及其他反应组分，95℃反应5min，再加入Taq酶，然后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为94℃，60s变性；55℃，60s退火；72℃，60s延伸，进行30个循环，再于72℃延伸15min；PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，可见预期大小的DNA片段；质粒pET-22b(+)经NdeI和SalI双酶切后回收大片段，回收的片段与上述的PCR产物经同样双酶切的回收产物进行连接反应；连接产物转化感受态细胞BL21(DE3)，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段，进行测序，结果与预期一致；重组后的质粒命名为pET-22b(+)-rmhIL-8；2)rmhIL-8重组蛋白的表达将含有重组质粒pET-22b(+)-rmhIL-8的大肠杆菌BL21(DE3)于37℃置入LB培养基中活化振摇培养过夜，次日清晨，按1∶100的比例接种于LB培养基中后，继续37℃培养3h至对数生长后期，OD650nm＝0.4时，加入IPTG，1mmol/L，培养4h，收集菌体；3)表达产物的鉴定对表达产物的鉴定用Western-blot，用Tricine-SDS-PAGE分离表达产物后，转膜，分别加入鼠抗人IL-8单抗作为一抗，碱性磷酸酶AP标记的羊抗鼠抗体作为二抗，底物显色；4)重组蛋白的纯化将每克诱导后菌体悬浮于10mlSTE中，STE的配方为50mmol/LpH8.0的Tris.HCl，1mmol/LEDTA，100mmol/LNaCl，加入0.8mg/g菌体的溶菌酶，搅拌20分钟后，加入脱氧胆酸钠DOC，继续搅拌直至悬浮液变为粘稠，1克菌体加入1mol/LMgCl20.4ml，搅拌均匀后加入1mg/mlDNAaseI20μl，搅拌均匀后室温放置30min进行消化；将裂菌产物在70℃加热10min，迅速冷却到0℃，12000r/min离心15min，取上清；以50倍体积的20mmol/L柠檬酸缓冲液、pH6.0的A液透析12h，中间换一次透析外液，透析后的上清过用A液充分平衡的过SP-SepharoseFF，洗脱B液为20mmol/L柠檬酸缓冲液pH6.0，1mol/LNaCl，连续梯度，洗脱4～5个柱床体积，目的蛋白峰在0.5mol/LNaCl时洗脱下来，收集目的峰，进行Tricine-SDS-PAGE电泳检测，即得到rmhIL-8蛋白。
3.如权利要求2所述的人白细胞介素8拮抗蛋白的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增反应管组成为200ng/mlpBV220-IL-80.5μl2.5mMdNTPs1μl25mMMgCl24μl20μMP10.5μl20μMP20.5μl5.0U/ulTaq酶0.5μl10×PCRBuffer5μlH2O38μl总计50μl。
全文摘要
本发明公开了重组突变人白细胞介素8蛋白及制备方法，选择天然人IL－8基因中的活性部位ELR突变为AAR，构建能与天然IL－8竞争结合受体的拮抗蛋白基因rmhIL－8，并在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到rmhIL－8蛋白。通过突变体对受体的竞争性结合，抑制IL－8的趋化活性，达到治疗炎症性疾病的作用。本发明的人白细胞介素8拮抗剂蛋白有可能为急、慢性炎症的治疗提供一种新的蛋白质药物。
文档编号C12N15/09GK1789284SQ20051009637
公开日2006年6月21日 申请日期2005年11月17日 优先权日2005年11月17日
发明者张英起, 侯登勇, 颜真 申请人:中国人民解放军第四军医大学