专利名称：富集和纯化糖基化蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种将凝集素连接到修饰后的磁微粒上，利用这种固定在磁微粒上的凝集素特异地结合糖基化蛋白，从而对其分离、富集和纯化的方法。
背景技术：
凝集素(Lectins)是一类非抗体的蛋白质或糖蛋白，能与糖类专一的非共价结合，并具有凝集细胞和沉淀聚糖和复合糖的作用。其结构含有糖类识别域(CRD)，并因此能与糖类发生专一结合，对残基的异头构型、糖苷键类型以及寡糖链的结构或构象具有专一性。如伴刀豆凝集素(Con A)是来自刀豆的一种凝集素，能专一的结合糖链内部的或非还原端的α-甘露糖(Man)。而伴刀豆凝集素可通过适当的化学方法连接到固相支持物上，N-连接的高甘露糖型糖蛋白中富含甘露糖残基，因此可以利用固相支持物上的伴刀豆凝集素从蛋白混合物中提纯高甘露糖型糖蛋白。目前，国外已有商品化的用于分离一些特异结构糖基化蛋白的亲和层析柱。
现有糖基化蛋白分离富集技术主要存在如下缺点1.由于已有商品化的是用于分离一些特异结构糖基化蛋白的亲和层析柱。亲和层析纯化必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，这就要求亲和层析柱专柱专用，即一个柱子只能提纯一类糖蛋白，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制，方法较为复杂。
2.分离富集糖基化蛋白的亲和层析柱对糖基化蛋白的回收率较低。
3.分离富集糖基化蛋白的亲和层析柱价格昂贵。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于微纳米磁性技术分离、富集和纯化糖基化蛋白的方法，其解决了背景技术中用亲和层析柱对糖基化蛋白分离富集方法复杂、回收率较低及价格昂贵的技术问题。
本发明的技术解决方案是一种富集和纯化糖基化蛋白的方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)凝集素的固定化(1)环氧乙基衍生化磁粒的预制将环氧乙基衍生化的磁粒加入离心管中，标为1号离心管；再加入偶联缓冲液，摇匀，在磁性分离器上分离、弃上清液；(2)固定化反应取凝集素溶液，加于1号离心管中，摇匀；置于空气振荡器中，摄氏35～40℃反应40～90分钟；反应完毕，在磁性分离器上分离、弃上清液；则，1号离心管中的凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒上；(3)清洗向1号离心管中加入清洗缓冲液，摇匀，在磁性分离器上分离、弃上清液；(4)封闭向1号离心管中加入封闭液，摇匀，置于空气振荡器中，摄氏35～40℃反应1～2小时；反应完毕，在磁性分离器上分离、弃上清液；(5)清洗在1号离心管中加入清洗缓冲液，混匀，在磁性分离器上分离、弃上清液；重复清洗3次；(6)保存加入保存缓冲液，于摄氏2～6℃保存；2)糖基化蛋白的分离纯化(1)预制取制备好的凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒，加入4号离心管，在磁性分离器上分离、弃上清液；(2)结合向4号离心管中加入结合缓冲液，再加入标准糖基化蛋白，然后再加入超纯水，置于摇床上，在室温下摇动4～6小时；将4号离心管，在磁性分离器上分离、弃上清液；(3)清洗向4号离心管中加入清洗缓冲液1，置于摇床上，摇动1～3分钟，在磁性分离器上分离、弃上清液；再重复清洗一次；(4)清洗向4号离心管中加入清洗缓冲液2，清洗1～3分钟，在磁性分离器上分离、弃上清液；再重复清洗二次；(5)洗脱向4号离心管中加入清洗缓冲液3，摄氏20～30℃清洗20～40分钟，在磁性分离器上分离，取上清液移入5号离心管中，即得富集纯化的糖基化蛋白；(6)脱盐将富集纯化的糖基化蛋白装入透析袋中，用水于摄氏2～6℃透析1.5～2.5小时后换水，重复透析三次，脱去清洗缓冲液3。
上述凝集素的固定化中，所述的偶联缓冲液以采用pH8.3 0.1M的NaHC030.5M的NaCl缓冲液为宜；也可采用或磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐等缓冲液。
上述凝集素的固定化中，所述的封闭液为加入1mg/ml的脱脂奶粉或牛血清白蛋白的磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐等缓冲液。
上述凝集素的固定化中，所述的清洗缓冲液、保存缓冲液均以采用0.5％的含吐温-201×磷酸盐为宜，也可采用或碳酸盐缓冲液，或乙酸盐缓冲液等。
上述糖基化蛋白的分离纯化中，所述的结合缓冲液以采用1mM CaCl2、1mMMnCl2、10mM Tris-HCl、pH7.0的缓冲液为宜，也可采用磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐等缓冲液；所述的清洗缓冲液1以采用1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl、pH7.0的缓冲液为宜，也可采用磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐等缓冲液；所述的清洗缓冲液2以采用1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl、pH7.0的缓冲液为宜，也可采用磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐等缓冲液。
上述糖基化蛋白的分离纯化中，清洗缓冲液3以采用1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mM KCl、100mM α-甲基甘露糖、10mM Tris-HCl、pH7.0的缓冲液为宜，也可采用磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐等缓冲液；所述的再生缓冲液1以采用1mM CaCl2，1mM MnCl2、10mM Tris-HCl、pH4.5的缓冲液为宜，也可采用磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐等缓冲液；所述的再生缓冲液2以采用1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mMTris-HCl、pH8.0的缓冲液为宜，也可采用磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐等缓冲液。
上述凝集素的固定化中，于空气振荡器上的反应温度以摄氏37℃为宜，反应时间以60分钟为宜；所述凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒的保存温度以摄氏4℃为宜；所述糖基化蛋白的分离纯化中，富集纯化的糖基化蛋白的透析温度以摄氏4℃为宜，每次透析的时间以1小时为宜。
上述糖基化蛋白经分离纯化后，凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒上的凝集素可再生，再生步骤包括1)再生向4号离心管中加入再生缓冲液1，摄氏20～30℃清洗20～40分钟，在磁性分离器上分离、弃上清液；重复再生一次；2)保存向4号离心管中加入保存缓冲液，于摄氏2～6℃保存。
上述环氧乙基衍生化磁粒经预制、固定化反应、清洗后，凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒上，该凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒上的固定化效率可进行检测，检测步骤包括1)将固定化反应中1号离心管在磁性分离器上所弃的上清液液移入2号离心管中；2)在固定化反应后的清洗中将1号离心管在磁性分离器上所弃的上清液移入3号离心管中；3)固定化效率的检测以偶联缓冲液为空白，取凝集素溶液及2号离心管中的溶液，将两者在280nm处的吸光度值记作OD1及OD2；以清洗缓冲液为空白，3号离心管中溶液在280nm处的吸光度值记作OD3，则偶联效率为偶联效率％＝(OD1-OD2-OD3)/OD1。
本发明具有以下优点1.分离、富集和纯化糖基化蛋白的方法简便。
2.回收率较高。
3.分离富集糖基化蛋白的亲和层析柱成本低。
4.使用便利。用时可随时连接，不受凝集素种类的影响。
图1为本发明的原理示意图；图2为本发明富集纯化的糖基化蛋白的SDS-PAGE电泳效果示意图。
附面说明1-泳道1，是蛋白Mark；2-泳道2，是未连接到磁微粒上的蛋白泳道；3-泳道3，是由洗液1洗下来的蛋白泳道；4-泳道4，是由洗液2洗下来的蛋白泳道；5-泳道5，是由洗液3洗下来的蛋白泳道。
具体实施例方式
本发明将凝集素连接到功能化的纳米级的磁微粒，如环氧乙基、氨基衍生化的纳米级的磁微粒上，用于分离富集糖基化蛋白。糖基化蛋白是蛋白质和单糖链共价相连接后形成的，主要用于细胞识别，生理功能主要用于免疫系统的细胞识别等。
本发明实施例的实现步骤如下1)凝集素的固定化(1)环氧乙基衍生化磁粒的预制将环氧乙基衍生化的磁粒摇匀后，用移液器移取200μl于离心管中，标为1号离心管。向1号离心管中加入400μl偶联缓冲液，用手摇匀，在磁性分离器上分离3分钟，保持1号离心管在磁性分离器上，用移液器移取上清液弃去。
(2)固定化反应取凝集素溶液，如伴刀豆凝集素(ConA)溶液300μL，约150μg，加于1号离心管中，摇匀，并将其置于空气振荡器中，在37℃条件下反应1小时。反应完毕，磁性分离3分钟，保持1号离心管在磁性分离器上，用移液器移取上清液于2号离心管中。则，1号离心管中的伴刀豆凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒上。
(3)清洗向1号离心管中加入400μl清洗缓冲液，用手摇匀，置于磁性分离器上，分离3分钟，保持1号离心管在磁性分离器上，用移液器移取上清液于3号离心管中。
(4)固定化效率的检测以偶联缓冲液为空白，取800μl伴刀豆凝集素溶液及2号离心管中的溶液，两者在280nm处的吸光度值记作OD1及OD2；以清洗缓冲液为空白，3号离心管中溶液在280nm处的吸光度值记作OD3，则偶联效率为偶联效率％＝(OD1-OD2-OD3)/OD1(5)封闭将1号离心管置于磁性分离器上，分离3分钟，保持1号离心管在磁性分离器上，用移液器移取上清弃去。向1号离心管中加入封闭液800μl，轻摇混匀，置于空气振荡器中，在37℃条件下反应2小时。反应完毕，磁性分离3分钟，保持1号离心管在磁性分离器上，用移液器移取上清液弃去。
(6)清洗在1号离心管中加入800μl的清洗缓冲液，用移液器混匀，置于磁性分离器上分离3分钟，保持1号离心管在磁性分离器上，用移液器移取上清液弃去，重复此步骤3次。
(7)保存在伴刀豆凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒中加入1ml的保存缓冲液，于4℃保存。
2)糖基化蛋白的分离纯化本实施例中的糖蛋白为高甘露糖型蛋白核糖核酸酶B，核糖核酸酶B是一种甘露糖修饰的蛋白酶，其能与伴刀豆凝集素特异结合。
(1)伴刀豆凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒的预制取制备好的伴刀豆凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒，加入4号离心管，在磁性分离器上分离3分钟，保持4号离心管在磁性分离器上，用移液器吸取上清液弃去。
(2)结合向4号离心管中加入200μl的结合缓冲液，如1mM CaCl2、1mMMnCl2，10mM Tris-HCl pH7.0的缓冲液；再加入2mg/ml的标准糖基化蛋白，如核糖核酸酶B 300μl；再加300μl超纯水，置于摇床上，在室温下摇动4～6小时，使之充分偶联。取出4号离心管，摇匀后置于磁性分离器上分离3分钟，移取上清液于5号离心管中。
(3)清洗向4号离心管中加400μl的清洗缓冲液1，如1mM CaCl2、1mMMnCl2、10mM Tris-HCl pH7.04的缓冲液，在摇床上摇动2分钟，置于磁性分离器上分离3分钟，吸取上清液置于6号离心管中；重复清洗一次。
(4)清洗向4号离心管中加400μl的清洗缓冲液2，如1mM CaCl2、1mMMnCl2、10mM Tris-HCl pH7.0的缓冲液，清洗2分钟，置于磁性分离器上分离3分钟，吸取上清置于7号离心管中；再重复清洗两次。清洗缓冲液1、2用于除去非特异性结合的蛋白。
(5)洗脱向4号离心管中加入800μl洗清缓冲液液3，如1mM CaCl2，1mMMnCl2，1mM KCl，100mM α-甲基甘露糖(a-methyl mannose)，10mM Tris-HCl pH7.0；于25℃清洗30分钟。置于磁性分离器上分离3分钟，吸取上清于8号离心管中，即为富集纯化的高甘露糖型蛋白。
(6)脱盐将富集纯化的高甘露糖型蛋白装入透析袋中，用1L水于4℃透析过2小时后换水，重复三次。
(7)检测用SDS-PAGE电泳检测富集纯化的蛋白，参见图2。清洗缓冲液3中有α-甲基甘露糖，其与伴刀豆凝集素的特异结合能力要比核糖核酸酶B与伴刀豆凝集素特异结合能力强。在此发生了竞争性结合，而将核糖核酸酶B洗下来，所以泳道5出现了明显的核糖核酸酶B的条带。
(8)再生向4号离心管中加入800μl的再生缓冲液1，如1mM CaCl2，1mMMnCl2，10mM Tris-HCl pH4.5，于25℃清洗30分钟。置于磁性分离器上分离3分钟，吸取上清液，弃去。
(9)再生向4号离心管中加入800μl的再生缓冲液2，如lmM CaCl2，1mMMnCl2，10mM Tris-HCl pH8.0，25℃清洗30min左右。置磁性分离器上分离3分钟，吸取上清液，弃去。
(10)保存向4号离心管中加入500μl的保存缓冲液，如1mM CaCl2，1mMMnCl2，0.02％NaN3，10mM Tris-HCl pH6.0，于4℃保存。
这种固定在伴刀豆凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒上的凝集素可多次再生，重复使用，富集纯化糖蛋白的次数至少为10次。
本实施例中的糖蛋白为高甘露糖型蛋白核糖核酸酶B，核糖核酸酶B是一种甘露糖修饰的蛋白酶，因为其具有与伴刀豆凝集素(Con A)特异结合能力，所以由清洗缓冲液1、2洗出的量少，而清洗缓冲液3中有甘露糖，可以和核糖核酸酶B竞争性结合，而将核糖核酸B洗下，所以泳道5的条带更明显。参见图2。
权利要求
1.一种富集和纯化糖基化蛋白的方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)凝集素的固定化(1)环氧乙基衍生化磁粒的预制将环氧乙基衍生化的磁粒加入离心管中，标为1号离心管；再加入偶联缓冲液，摇匀，在磁性分离器上分离、弃上清液；(2)固定化反应取凝集素溶液，加于1号离心管中，摇匀；置于空气振荡器中，摄氏35～40℃反应40～90分钟；反应完毕，在磁性分离器上分离、弃上清液；则，1号离心管中的凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒上；(3)清洗向1号离心管中加入清洗缓冲液，摇匀，在磁性分离器上分离、弃上清液；(4)封闭向1号离心管中加入封闭液，摇匀，置于空气振荡器中，摄氏35～40℃反应1～2小时；反应完毕，在磁性分离器上分离、弃上清液；(5)清洗在1号离心管中加入清洗缓冲液，混匀，在磁性分离器上分离、弃上清液；重复清洗3次；(6)保存加入保存缓冲液，于摄氏2～6℃保存；2)糖基化蛋白的分离纯化(1)预制取制备好的凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒，加入4号离心管，在磁性分离器上分离、弃上清液；(2)结合向4号离心管中加入结合缓冲液，再加入标准糖基化蛋白，然后再加入超纯水，置于摇床上，在室温下摇动4～6小时；将4号离心管，在磁性分离器上分离、弃上清液；(3)清洗向4号离心管中加入清洗缓冲液1，置于摇床上，摇动1～3分钟，在磁性分离器上分离、弃上清液；再重复清洗一次；(4)清洗向4号离心管中加入清洗缓冲液2，清洗1～3分钟，在磁性分离器上分离、弃上清液；再重复清洗二次；(5)洗脱向4号离心管中加入清洗缓冲液3，摄氏20～30℃清洗20～40分钟，在磁性分离器上分离，取上清液移入5号离心管中，即得富集纯化的糖基化蛋白；(6)脱盐将富集纯化的糖基化蛋白装入透析袋中，用水于摄氏2～6℃透析1.5～2.5小时后换水，重复透析三次，脱去清洗缓冲液3。
2.根据权利要求1所述的富集和纯化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述凝集素的固定化中，所述的偶联缓冲液为pH8.3 0.1M的NaHCO30.5M的NaCl缓冲液；或为磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的富集和纯化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述凝集素的固定化中，所述的封闭液为加入1mg/ml的脱脂奶粉或牛血清白蛋白的磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的富集和纯化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述凝集素的固定化中，所述的清洗缓冲液、保存缓冲液均为0.5％的含吐温-20 1×磷酸盐，或碳酸盐缓冲液，或乙酸盐缓冲液。
5.根据权利要求4所述的富集和纯化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述糖基化蛋白的分离纯化中，所述的结合缓冲液为1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mMTris-HCl pH7.0的缓冲液，或为磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐缓冲液；所述的清洗缓冲液1为1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH 7.0的缓冲液，或为磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐缓冲液；所述的清洗缓冲液2为1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH 7.0的缓冲液，也可采用磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐缓冲液。
6.根据权利要求5所述的富集和纯化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述糖基化蛋白的分离纯化中，所述的清洗缓冲液3为1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mMKCl、100mM α-甲基甘露糖(a-methyl mannose)、10mM Tris-HCl pH 7.0的缓冲液，或磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐缓冲液；所述的再生缓冲液1为1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH 4.5的缓冲液，或磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐缓冲液；所述的再生缓冲液2为1mM CaCl2，1mM MnCl2，10mM Tris-HCl pH 8.0的缓冲液，或磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐缓冲液。
7.根据权利要求6所述的富集和纯化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述的凝集素的固定化中，于空气振荡器上的反应温度为摄氏37℃，反应时间60分钟；所述凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒的保存温度为摄氏4℃；所述糖基化蛋白的分离纯化中，富集纯化的糖基化蛋白的透析温度为摄氏4℃，每次透析的时间为1小时。
8.根据权利要求7所述的富集和纯化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述的糖基化蛋白经分离纯化后，凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒上的凝集素的再生步骤包括1)再生向4号离心管中加入再生缓冲液1，摄氏20～30℃清洗20～40分钟，在磁性分离器上分离、弃上清液；重复再生一次；2)保存向4号离心管中加入保存缓冲液，于摄氏2～6℃保存。
9.根据权利要求8所述的富集和纯化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述的环氧乙基衍生化磁粒经预制、固定化反应、清洗后，凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒上，该凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒上的固定化效率的检测步骤包括1)将固定化反应中1号离心管在磁性分离器上所弃的上清液液移入2号离心管中；2)在固定化反应后的清洗中将1号离心管在磁性分离器上所弃的上清液移入3号离心管中；3)固定化效率的检测以偶联缓冲液为空白，取凝集素溶液及2号离心管中的溶液，将两者在280nm处的吸光度值记作OD1及OD2；以清洗缓冲液为空白，3号离心管中溶液在280nm处的吸光度值记作OD3，则偶联效率为偶联效率％＝(OD1-OD2-OD3)/OD1。
全文摘要
一种富集和纯化糖基化蛋白的方法，其凝集素的固定化是将环氧乙基衍生化的磁粒加入离心管中，经固定化反应、清洗、封闭、重复清洗，凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒，加入保存缓冲液保存。其糖基化蛋白的分离纯化是将制备好的凝集素固定化到环氧乙基衍生化磁粒经结合，加入标准糖基化蛋白充分偶联，再经多次清洗后，洗脱，得富集纯化的糖基化蛋白，装入透析袋中脱盐。本发明解决了背景技术中用亲和层析柱对糖基化蛋白分离富集方法复杂、回收率较低及价格昂贵的技术问题。本发明实现方法简便，回收率较高，分离富集糖基化蛋白的亲和层析柱成本低，使用便利。
文档编号C12N9/24GK1958599SQ200510096270
公开日2007年5月9日 申请日期2005年11月3日 优先权日2005年11月3日
发明者李铮, 陈超, 杨刚龙, 崔亚丽 申请人:陕西西大北美基因股份有限公司