专利名称：三系杂交水稻多用途恢复系的分子标记辅助选育方法
技术领域：
本发明涉及一种三系杂交水稻多用途恢复系的选育方法，确切地说是应用分子标记技术辅助聚合不同来源的恢复基因和广亲和基因，以选育三系杂交水稻多用途恢复系。
背景技术：
细胞质雄性不育是作物杂种优势利用的基础。我国利用细胞质雄性不育在杂交水稻育种方面已取得了巨大成功。根据细胞质来源的不同，目前生产上利用的水稻细胞质雄性不育按细胞质的来源可分为野败型、矮败型、冈型、D型、印度尼西亚水田谷型、K型、红莲型、包台型、滇一型、马协型等，按对细胞质雄性不育的恢保关系则主要有野败型、红莲型和包台型3种，同时这3种细胞质雄性不育也是生产上最常用的类型。遗传研究表明，野败型细胞质雄性不育(WA-CMS)有2个主效育性恢复基因Rf3、Rf4，其中Rf3位于水稻第1染色体，与RFLP标记Y2-33和SSR标记RM1紧密连锁，Rf4位于水稻第10染色体，与RFLP标记Y3-8和SSR标记RM228紧密连锁(Runchun Jing et al，2001，Bot.Bull.Acad.Sin.42167-171；杨存义等，2002，华南农业大学学报，23(4)30-33；张群宇等，2002，遗传学报，29(11)1001-1004；何光华等，2002，遗传学报，27(4)304-310)。红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)也有2个主效育性恢复基因Rf5、Rf6，这2个恢复基因均被定位于水稻第10染色体，连锁分析证明，Rf3与SSR标记RM1108的遗传距离仅0.9cM，而Rf6和RM5373共分离(刘学群，2004，武汉大学博士论文)。包台型细胞质雄性不育(BT-CMS)的2个紧密相连的主效恢复基因Rf1a、Rf1b已经被日本和中国学者克隆，也位于水稻第10染色体上，与fL610标记紧密连锁(Komori等，2003，Euphytica，129241-247；王中华，2004，华南农业大学博士论文)。我国学者进行的遗传连锁分析表明，同位于水稻第10染色体上的Rf4、Rf5、Rf6以及Rf1a、Rf1b基因之间是不等位的(刘学群，2004，武汉大学博士论文)。
水稻广亲和性的发现和广亲和基因的深入研究，为籼粳亚种间杂种优势的成功利用提供了理论依据和物质基础。位于水稻第6染色体上的S5-n是水稻籼粳亚种间最早发现的广亲和基因位点，可以解释多数典型籼粳亚种间杂种不育现象。S5-n位点处于标记基因C(紫色稃尖)和wx之间，并被定位于RFLP分子标记RG138和RG2349之间，距RG2349仅1.0cM(朱速松，2005，南京农业大学博士论文)。
利用广亲和材料与不同的籼、粳恢复系杂交，在后代选系中通过连续选择和不断测交鉴定，前人已培育出一些广亲和恢复系。任光俊等(1999，中国水稻科学，13(2)120-122)以871028/Lemont杂交，后代材料经多代连续选择，至F6代选优良株系花药培养，育成的广亲和恢复系成恢448对5种细胞质源的7个不育系(珍汕97A、金23A、大粒A、冈46A、K17A、II-32A、D62A)的自然结实率均达到80％以上；经4个广亲和性测验种鉴定，成恢448具有广亲和性。朱旭东等(2004，中国农学通报，20(1)40-42)以轮回422为广亲和、野败恢复基因的供体，与意大利粳稻Cripto杂交，在3000株的F2群体中，选择43个优异单株，F3测交122个成对交，F4选择7个优异株系中的82个单株，F5进行53个成对交，F6选择3个优异株系中的7个单株，F7进行7个成对交，F8代均表现优异，从而选育成具有良好一般配合力、广谱广亲和的偏粳恢复系T461，该恢复系能恢野败、矮败、印尼水田谷、包台型、滇型等籼、粳三系不育系，与籼型和粳型测验种杂交的结实率非常接近。
严菊强等(1995，遗传学报，22(5)361-371)用广亲和材料CPSLO17与明恢63杂交，F1经花培育成的广亲和恢复系TG7、TG8均带有1对广亲和基因，TG7和TG8分别带有2对WA-CMS和1对滇一型CMS的育性恢复基因。滕利生等(1996，作物学报，22(2)142-146)以结实率为育性指标，研究了粳稻恢复系C57和ZH157对BT型、WA型CMS恢复性的遗传，发现C57同时带有BT-CMS的一对显性强恢复基因和WA-CMS的一对不完全显性恢复基因，ZH157则同时带有BT-CMS的一对不完全显性恢复基因和WA-CMS的一对显性强恢复基因，且两者的强恢复基因对不育系的育性恢复起主导作用。黄青阳等(2000，中国农业科学，33(3)8-13)在研究丛广41A、珍汕97A和马协A的育性遗传时发现，虽然丛广41A与珍汕97A、马协A的核不育基因非等位，恢保关系也明显不同，但当应用特青、密阳23、胜优2号、明恢63、6078、IR661、3037及IR72等恢复系与丛广41A、珍汕97A和马协A测交时，F1均能正常结实，说明上述恢复系中同时具有恢复这三种不育系的恢复基因。这些研究证实了培育水稻广谱多用途恢复系的可能性。
大量研究证明，将不同来源的水稻恢复基因和广亲和基因聚合，能够培育出广谱广亲和恢复系，但在系统选育过程中，由于事先不知所选单株的基因型，必需经过后裔测验才能确定所选单株是否含有恢复基因和广亲和基因，为了减少盲目性，不得不选择大量单株进行后裔测验，从而需花费较多的人力物力，延长育种年限。因此目前还未见能同时对野败型、红莲型、包台型细胞质雄性不育均具有强恢复性的广谱广亲和恢复系的报道。
随着现代水稻分子生物学的发展，人们不断筛选出与不同来源的水稻细胞质雄性不育恢复基因和广亲和基因紧密连锁的分子标记，但由于实验条件和信息沟通等方面的原因，实际从事田间育种的广大科技工作者难以直接利用这些分子标记，导致这些分子标记未能在广谱广亲和恢复系选育中得到广泛应用。
发明内容
本发明是一种方法上的创新，是将现代分子生物学的分子标记技术、花药培养技术与传统的作物遗传育种中的杂交、回交、复交、测交以及多种选择技术有机结合，为作物新品种选育、新材料创制提供快捷、准确、可预见且实用的方法。具体地说本辅助选育方法包括选取含广亲和基因材料分别与野败型、红莲型和包台型恢复系进行聚合杂交，对其大群体分离世代中的优异单株辅以分子标记技术进行选择，对选择出的含有多个目的基因的优异单株进行花药培养，直至获得含有4种以上的目的基因的均纯合稳定的优异材料，再经测交、复交选择得到稳定的多用途恢复系。所述的分子标记技术就是提取分离世代中优异单株的DNA为模板，用一定核苷酸序列(5’-3’)的双引物进行PCR反应和SSR多态性分析，以确定含有多个目的基因。在电泳图上能清楚显示出不同的目的基因。
具体内容如下1、选取具有广亲和基因的材料(如CPSLO17、零轮11、CB-1、培矮64、02428、HP121等)分别与野败型(明恢63、057、明恢86、蜀恢527、镇江084、浙恢7954、9019等)、红莲型(扬稻6号、绿稻24等)、包台型(C57、C418、R18、皖恢9号、C堡等)等的恢复系杂交，并根据育种目标，进行不同方式的聚合杂交以野败型为主的多用恢复系选育——野败型恢复系///粳广亲和系/红莲型恢复系//籼广亲和系/包台型恢复系，以红莲型为主的多用恢复系选育——红莲型恢复系///粳广亲和系/野败型恢复系//籼广亲和系/包台型恢复系，以包台型为主的多用恢复系选育——包台型恢复系///粳广亲和系1/野败型恢复系//粳广亲和系2/红莲型恢复系。
2、在大群体的分离世代中，先根据株叶形态、长势长相等选择优异单株，再用分子标记鉴定初选单株中是否含有目的基因，标注同时含有至少4种不同目的基因的入选单株。
3、对标注的含有至少4种不同目的基因的入选单株，在抽穗期取部分幼穗进行花药培养，以加速多个目的基因的同时纯合；成熟时再根据综合农艺性状确定入选单株并按单株收获足量种子。下季再种成大群体进行第二次分子标记辅助选择，并取幼穗进行花药培养，直至获得含有至少4种以上不同目的基因均纯合稳定的优异材料。
4、种植上述优异材料，用不同类型的不育系进行成对测交，下季选择配合力高的优异材料，再复测；根据复测结果，选择表现优异稳定者定型成多用途恢复系。
四
附图所示为部分电泳图，图中清楚显示出不同的目的基因。
图1、Rf3检测水稻野败型恢复基因图1、Rf4检测水稻红莲型恢复基因图3、Rf1检测水稻BT型恢复基因五具体实施方式
现以选育以野败型为主的多用恢复系为例，叙述如下。
1、配制聚合杂交蜀恢527///02428/扬稻6号//培矮64/C418。该聚合交所用亲本中，蜀恢527是野败型籼稻恢复系，具有恢复力强(含Rf3、Rf4基因)、配合力高、品质优、株叶形态好、较抗稻瘟病等特点；02428是株叶形态好，具有S5-n广亲和基因的粳稻广亲和材料；扬稻6号是红莲型籼稻恢复系，具有恢复力强(含Rf5、Rf6基因)、配合力高、品质优、株叶形态好、抗逆性强等特点；培矮64是株叶形态好，具有S5-n广亲和基因的籼稻广亲和材料；C418是包台型粳稻恢复系，具有恢复力强(含Rf1a、Rf1b基因)、配合力高、品质优、株叶形态好等特点，同时具有一定的广亲和性。
2、分离世代的分子标记辅助选择由于Rf4、Rf5、Rf6、Rf1基因同在水稻第10染色体上，并且不是等位基因，因此要获得4个有利基因的重组就需要比较大的分离群体。在4000多株大群体的聚合交F2、F3等早期世代，先根据株叶形态等初选约400个单株，再用分别与Rf3、Rf4、Rf5、Rf6、Rf1以及S5-n等基因紧密连锁的分子标记对初选单株的基因组DNA进行标记筛选，淘汰不含这些基因或只含少数基因的单株，并尽量选择上述基因均纯合的单株，获得40-50株至少含有4种不同目的基因的入选单株。
2.1、基因组DNA的提取取水稻幼嫩叶片0.5g左右，置于2.0ml离心管中，加液氮研磨至粉末状，加700ul DNA提取缓冲液(含100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5％SDS)，60℃条件下振动水浴1小时，取出后至室温时加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，来回颠倒充分混匀后静置30分钟，10000rpm离心15分钟，将上清液移至1.5ml离心管中，加入等体积的预冷的异丙醇，混匀，室温下静置30分钟，10000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用400ul 70％乙醇洗涤，10000rpm离心10分钟，弃上清，重复洗涤一次，沉淀于室温下干燥后溶于50ul重蒸水中。
2.2、标记双引物序列，由上海生工合成。
2.3、SSR多态性分析在10ul反应体系中，含2ul 5×SSR Buffer，1ul 2mM dNTPs，0.5ul 50mM MgCl2，各0.8ul 2.5uM的上下游引物，0.5U Taq DNA聚合酶，水稻基因组DNA模板1ul，灭菌双蒸水补足至10ul。
PCR反应程序为95℃预变性5分钟，接94℃ 40秒，57℃ 45秒，72℃ 60秒，共30个循环，接72℃ 7分钟，然后4℃保存。反应产物在3％琼脂糖凝胶上水平电泳，稳压180V，电泳1.5-2小时后在凝胶成像系统中记录结果；或在6％PAGE胶上走垂直板电泳，稳压在220V-300V之间，电泳时间一般为1.5-2小时。电泳结束后银染显色，在胶片透视仪上记录标记条带或照相记录。
3、花药培养从含有4种以上不同目的基因的入选单株上取幼穗进行花药培养，加速目的基因的纯合。
4、测交初选在选育的早期世代，用有代表性的不育系对入选单株进行初测鉴定。对分子标记辅助入选的40-50个单株，分别用野败型(珍汕97A)、红莲型(粤泰A)和包台型(六千辛A)不育系进行成对交初测。根据测交的表现，选择对3种不育系均表现配合力高、结实率好(75％)的株系10-15个。从这10几个株系中选择表现优异的单株100个左右，并用分子标记确认目标基因均纯合的单株约10个。
5、复测复选在选育的中期世代，选择各目标基因都纯合的单株，用多种不同类型的不育系进行复测鉴定。将初测中选的每个单株，下一季都种成300-500株的较大群体，从中选择优异单株分别与不同类型的三系不育系珍汕97A、协青早A、金23A、冈46A、II-32A、D62A、K17A、粤泰A、绿三A、六千辛A、80-4A、9201A、23A以及两系不育系培矮64S、X07S、7001S等进行广泛复测。选择复测鉴定中表现恢复谱广、结实率高、配合力强、综合农艺性状稳定优异的单株或株系。
6、决选扩繁对复测鉴定中选的单株或株系扩大繁殖，进一步加大选择压，用在复测中表现优异的不育系有针对性地多次重复测交筛选，一方面鉴定广亲和性，另一方面鉴定杂种优势，从而培育出广谱、广亲和的多用途恢复系。
权利要求
1.一种三系杂交水稻多用途恢复系的分子标记辅助选育方法，包括选取含有广亲和基因材料分别与野败型、红莲型和包台型恢复系进行聚合杂交、并对其分离世代进行分子标记辅助选择以及花药培养、测交和复测，其特征在于所述的分子标记辅助选择就是提取分离世代中优异单株的DNA为模板，用一定核苷酸序列(5`-3`)的双引物进行PCR反应和SSR多态性分析，所述的双引物如下F5’-GCGAAAACACAATGCAAAAA-3’R5’-GCGTTGGTTGGACCTGAC-3’F5’-CTGGCCATTAGTCCTTGG-3’R5’-GCTTGCGGCTCTGCTTAC-3’F5’-GCTCGCGAATCAATCCAC-3’R5’-CTGGATCCTGGACAGACGAG-3’F5’-GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3’R5’-ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3’F5’-TTGACGCCTTCGTCCTCT-3’R5’-AGACGTAACAAGATGATCG-3’F5’-ACTGTACCGGTCGAAGACG-3’R5’-AAATTCCACGTCAGCCTCC-3’。
全文摘要
一种三系杂交水稻多用途恢复系分子标记辅助选育方法，包括选取含广亲和基因材料分别与野败型、红莲型和包台型恢复系进行聚合杂交，对其分离世代中的优异单株进行分子标记辅助选择，选择出含有至少4种不同目的基因的优异单株进行花药培养，直至获得含有4种以上不同目的基因均纯合稳定的优异材料，再经测交、复测选择得到稳定的多用途恢复系。所述的分子标记就是提取分离世代中优异单株的DNA为模板，用一定核苷酸序列的双引物进行PCR反应和SSR多态性分析，以确定含有多个目的基因。本方法为作物新品种的选育提供了快速、准确且可预见的实用方法。
文档编号C12Q1/68GK1831138SQ20051009574
公开日2006年9月13日 申请日期2005年11月21日 优先权日2005年11月21日
发明者易成新, 杨剑波, 李莉, 倪大虎, 汪秀峰, 赵伟, 宋丰顺, 陆徐忠, 张毅, 宁志怨, 宣云 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所