专利名称：水稻颖花发育的一种新基因Dhl及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及水稻的功能基因分析技术领域。
背景技术：
T-DNA标签是一种高通量的克隆和分析植物功能基因的方法，在拟南芥等高等植物上，已广泛开展利用T-DNA标签技术来阐明基因的功能，并相继克隆了一批基因(Jeon等，2001；Tyagi等，2000；Krysan等，1999等；Green等，1999；Papi等，2000；Oyama等，2002)。随着高效的农杆菌介导的T-DNA水稻转化技术体系的建立(Heli等，1994)，在水稻上也已有了构建T-DNA插入突变体库和成功利用该体系分离、克隆基因的报道(Jung等，2003；Jeon等，2000；Jeong等，2002；Wu等，2003；Lee等2004)。
虽然水稻基因全序列已为人类所获知，但各基因片段分别在水稻生长、传代过程担任的角色还不为人所知。
发明内容
本发明目的在于探究影响水稻颖花发育的基因及其克隆该基因的方法，以为人类进一步对水稻功能的完全识别。
水稻颖花发育的一种新基因Dh1长度为1207bp，其基因全序列为aggttaatta gcaagtgagt cgtagtaagg cagaggacgt tggccttctt attcaacgca 60gcattaacac gtttgctccc ctcgaaccag acaccctacc ctacctgtcc tcctctcttc 120ttcctcctct cctctccttc ctcctcttat aaatccacct cctccatctc aagttgcacc 180gctactagca gctaacctac ctacactaca ctacaccaca cactacactt ggagagaagc 240acacgtagct agagtgatcg attcattttc ttgctcgatc ttgatcggta tggctggtgc 300tacggctgcc ggcgctgccg ctgccgcggc ggggacggga gccgggtcgc cgtgcggcgc 360gtgcaagttc ttgcggcggc ggtgcgtgcc ggagtgcgtg ttcgcgccct acttcagctc 420ggagcaaggg gcggcgaggt tcgcggcgat ccacaaggtg ttcggcgcca gcaacgcctc 480caagctcctc tcccacctcc ccgtcgccga ccgctgcgag gccgtcgtca ccatcaccta 540
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水稻颖花发育的一种新基因Dh1的克隆方法是先获取日本晴相应BAC(AP004048)，用核酸内切酶Hind III切割日本晴相应BAC，电泳后回收目标DNA片段，与用相同酶切割的载体连接。
本发明通过对项目组T-DNA插入突变体库的筛选，发现一种颖花颖壳退化突变体(Degenerated hull1，简称Dh1)，侧翼序列比对和共分离分析结果显示是一种LOB domain-like protein的基因突变引发的功能丧失(减弱)。通过互补试验验证了其功能。通过构建GFP融合表达载体研究其时空表达模式，进一步证实了其功能。
图1为突变体库构建设采用的载体图片。
图2为T-DNA插入序列GAL4/VP16的特异PCR分子检测的电泳图。
图3为预测的1基因的基本情况示意图。
图4为互补转化实验真转化子的表型照片。
图5为对转化获得的拟杂合体进行PCR扩增的两侧扩增出特异条带电泳图。
图6为互补转化实验各转化子的RT-PCR分析图。
图7为GFP融合蛋白基因转化后代的电泳图。
图8为不同时期基因在发育早期的幼穗和颖花中表达荧光图。
图9为构建突变体库所用载体示意图。
图10为互补实验构建的载体示意图。
具体实施方法一、突变体的筛选采用农杆菌介导T-DNA插入方法，构建水稻品种中花11号插入突变体库，突变体库构建设采用的载体，如图1所示。
每个转化子的T1代株系种植20株，共种植4000余个转化子。发现1个株系内突变出2株颖花退化的变异个体。对其全部单株进行基于T-DNA插入序列GAL4/VP16的特异PCR分子检测，上下游引物序列为5’-GGCATCGGTAAACATCTGCT-3’和5’-GCCTCAAGAAGCTCAAGTGC-3’，扩增片段长度为0.611kb。检测结果突变株为阳性(能够扩增出1条特异性电泳条带)，正常型植株中阳性率为67％。收获阳性正常株种植T2代36株，继续上述分子检测，群体中的9个突变株均表现为阳性，正常株中9株为阴性，而且，在这一世代发现杂合体有表型，即杂合株穗子上有少数颖花的颖壳退化，18个杂合株检测结果均为阳性，如图2所示，从左向右各泳道依次为4-9为突变体，1-3和10-22为表型正常植株，22为阳性对照(载体)，23-24为阴性对照(分别水和野生型植株)，25为marker。
至此，确认突变表型与T-DNA插入共分离，即该插入为T-DNA单拷贝插入，突变表型系由T-DNA插入引起的单基因突变所致。
二、侧翼序列的获得和共分离检测通过TAIL-PCR的方法分离侧翼序列，其方法参见Liu等(1995)的介绍。经过测序，获得长度为316bp(碱基对)的侧翼序列。
通过侧翼序列与水稻全基因组序列的比对，其与水稻BAC克隆AP004048中的一段DNA序列几乎完全相同。至此，将突变基因初步定位于水稻第2染色体。
在T-DNA插入点的两侧设计基因组序列引物F1(CCA ACG TCC TCT GCCTTA C)、R1(AGT GGC TAC ATT TAG TTT GCT G)，在T-DNA右边界设计引物F2(GAC ACT CCC AGT TGT TCT TC)，分别以F1/R1和F2/R1配对进行PCR扩增，电泳结果与表型对应进行分析，证实侧翼序列与突变表型共分离，即该侧翼序列确系T-DNA插入点的旁侧序列，可以据此确定插入点处被破坏的基因的DNA序列。
三、预测基因的全序列和功能根据生物信息学软件的分析，突变基因从前一种基因的末端后开始至下游调控区域结束，全长共2888bp，如图3所示。其包括2个外显子和1个内含子，编码1个含有lateral organ boundary(LOB)-like结构域的蛋白，控制特定器官边界组织的分化和发育。
Dh1基因全序列aggttaatta gcaagtgagt cgtagtaagg cagaggacgt tggccttctt attcaacgca 60gcattaacac gtttgctccc ctcgaaccag acaccctacc ctacctgtcc tcctctcttc 120ttcctcctct cctctccttc ctcctcttat aaatccacct cctccatctc aagttgcacc 180gctactagca gctaacctac ctacactaca ctacaccaca cactacactt ggagagaagc 240acacgtagct agagtgatcg attcattttc ttgctcgatc ttgatcggta tggctggtgc 300tacggctgcc ggcgctgccg ctgccgcggc ggggacggga gccgggtcgc cgtgcggcgc 360gtgcaagttc ttgcggcggc ggtgcgtgcc ggagtgcgtg ttcgcgccct acttcagctc 420ggagcaaggg gcggcgaggt tcgcggcgat ccacaaggtg ttcggcgcca gcaacgcctc 480caagctcctc tcccacctcc ccgtcgccga ccgctgcgag gccgtcgtca ccatcaccta 540cgaggcccag gccaggctcc gcgaccccgt ctatggctgc gtcgcccaaa tcttcgccct 600ccagcagcag gtactatttc atttcatgga tgagaatgag atgatctcgt cgctgctcga 660tcgatcgatc gatcgcctct cggatttgtg actgattcga tcgatgctac atacaggtcg 720cgatcctgca agcgcagctg atgcaggcga gggcgcagct ggcgtgcggc atccagagca 780gctcgcactc tccggtgagc tggccggaca gcggcagcat cagcgcgcta ctccggcagg 840acatggcgag aaggccgccc ggcggcgccc tcgacgactg cttcggcggc ggcggcgcgc 900tgctgccgga gctcatggcg gccggcttca aggacgacgt cgccgccgtg cagatgcagc 960
agcattgctc caaggcggtg gacgccggcg agctccagta tctggcccag gcgatgatga 1020gatcaacctc caactactct cagtagaaag aaaaatcaaa caatgcaacg ctttgcatgc 1080aggagttaga gagtggacaa gcaaaaattt agcctgtgta ctactgaact tttttatcag 1140tgcaacgtca tagtgaagca attagtctgc ttcatgatga tgattagtac gtagtactac 1200taaataa编码的氨基酸序列MAGATAAGAAAAAAGTGAGSPCGACKFLRRRCVPECVFAPYFSSEQGAARFAAIHKVFGASNASKLLSHLPVADRCEAVVTITYEAQARLRDPVYGCVAQIFALQQQVAILQAQLMQARAQLACGIQSSSHSPVSWPDSGSISALLRQDMARRPPGGALDDCFGGGGALLPELMAAGFKDDVAAVQMQQHCSKAVDAGELQYLAQAMMRSTSNYSQ四、互补载体的构建和转化获取日本晴相应BAC(AP004048)，用核酸内切酶Hind III切割该BAC，电泳后回收合乎预计大小的DNA片段，与用相同酶切割的载体连接，电击法转入农杆菌菌株，检测并筛选出单克隆重组体，如图2，构建的载体示意图)。通过农杆菌转化突变株自交后代的成熟胚，在含有抗菌素筛选剂的继代培养基上筛选，再经胚性愈伤分化成苗过程，获得较多转化后代，部分T0代转化子的突变表型得到不同程度的恢复，如图4所示。
五、转化后代的PCR和RT-PCR分析从功能验证载体T-DNA中的两侧载体序列至目的基因内，分别设计2对特异性引物一对引物为5′-GCAGAGGCATCTTGAACGATAG-3′5′-ACGGAGTACTTTACTGAAGTGTTG-3′另一对引物为5′-GTTTTCCCAGTCACGACGTTG-3′5′-GCTTGGTCACTGGCTGTTTG-3′对转化获得的拟杂合体进行PCR扩增，两侧均能扩增出特异条带，如图5所示的个体被认为是真转化子。图5中，I为基因一侧的PCR检测结果，II为基因另一侧的PCR检测结果。扩增片断为从基因外至基因内的基因组序列。Ck为载体对照，1-5为全长基因过表达的不同T0植株，6-9为互补实验的不同T。植株。
分别提取这些转化子幼穗的总RNA，反转录成cDNA，设计特异引物5′-TCGTCACCATCACCTACGAG-3′和5′-CAATGCTGCTGCATCTGCA-3′进行RT-PCR分析。以组成性表达的actin基因的表达强度和一致性为参照，以正常株和突变株的RT-PCR结果作为对照，对各转化子转基因的表达情况进行研究，如图6所示，以actin基因的RT-PCR结果作为参照，野生型和突变体的RT-PCR结果作为对照。结果田间表现明显杂合表型的个体的RT-PCR电泳条带的亮度均介于正常株和突变株之间而偏向于正常株，说明这些转化子有目的基因的表达。
以上互补实验证实，克隆的基因即为Dh1目的基因。
六、GFP融合表达载体构建设计特定引物5′-CGGGATCCTGGAGGTTGATCTCATCATCG-3′5′-GGAATTCCAATCCAATGGCAGGTGGTC-3′扩增Dh1基因的上游调控序列，插入到带有GFP基因的结构基因区的载体中，构成融合表达载体。同样方法转入农杆菌中。转化亲本中花11号，获得转化植株，如图7所示。
不同时期通过荧光体视显微镜观察，该基因在发育早期的幼穗和颖花中表达，如图8所示。进一步证实预测基因即为目的基因Dh1。
权利要求
1.水稻颖花发育的一种新基因Dh1，其基因全序列长度为1207bp，其基因全序列为aggttaatta gcaagtgagt cgtagtaagg cagaggacgt tggccttctt attcaacgca 60gcattaacac gtttgctccc ctcgaaccag acaccctacc ctacctgtcc tcctctcttc 120ttcctcctct cctctccttc ctcctcttat aaatccacct cctccatctc aagttgcacc 180gctactagca gctaacctac ctacactaca ctacaccaca cactacactt ggagagaagc 240acacgtagct agagtgatcg attcattttc ttgctcgatc ttgatcggta tggctggtgc 300tacggctgcc ggcgctgccg ctgccgcggc ggggacggga gccgggtcgc cgtgcggcgc 360gtgcaagttc ttgcggcggc ggtgcgtgcc ggagtgcgtg ttcgcgccct acttcagctc 420ggagcaaggg gcggcgaggt tcgcggcgat ccacaaggtg ttcggcgcca gcaacgcctc 480caagctcctc tcccacctcc ccgtcgccga ccgctgcgag gccgtcgtca ccatcaccta 540cgaggcccag gccaggctcc gcgaccccgt ctatggctgc gtcgcccaaa tcttcgccct 600ccagcagcag gtactatttc atttcatgga tgagaatgag atgatctcgt cgctgctcga 660tcgatcgatc gatcgcctct cggatttgtg actgattcga tcgatgctac atacaggtcg 720cgatcctgca agcgcagctg atgcaggcga gggcgcagct ggcgtgcggc atccagagca 780gctcgcactc tccggtgagc tggccggaca gcggcagcat cagcgcgcta ctccggcagg 840acatggcgag aaggccgccc ggcggcgccc tcgacgactg cttcggcggc ggcggcgcgc 900tgctgccgga gctcatggcg gccggcttca aggacgacgt cgccgccgtg cagatgcagc 960agcattgctc caaggcggtg gacgccggcg agctccagta tctggcccag gcgatgatga 1020gatcaacctc caactactct cagtagaaag aaaaatcaaa caatgcaacg ctttgcatgc 1080aggagttaga gagtggacaa gcaaaaattt agcctgtgta ctactgaact tttttatcag 1140tgcaacgtca tagtgaagca attagtctgc ttcatgatga tgattagtac gtagtactac 1200taaataa其编码的氨基酸序列为MAGATAAGAAAAAAGTGAGSPCGACKFLRRRCVPECVFAPYFSSEQGAARFAAIHKVFGASNASKLLSHLPVADRCEAVVTITYEAQARLRDPVYGCVAQIFALQQQVAILQAQLMQARAQLACGIQSSSHSPVSWPDSGSISALLRQDMARRPPGGALDDCFGGGGALLPELMAAGFKDDVAAVQMQQHCSKAVDAGELQYLAQAMMRSTSNYSQ。
2.水稻颖花发育的一种新基因Dh1的克隆方法，其特征在于先获取日本晴相应BAC，用核酸内切酶Hind III切割日本晴相应BAC，电泳后回收目标DNA片段，与用相同酶切割的载体连接，得到基因Dh1。
全文摘要
水稻颖花发育的一种新基因Dh1及其克隆方法，涉及水稻的功能基因分析技术领域。用核酸内切酶Hind III切割日本晴相应BAC，电泳后回收目标DNA片段，与用相同酶切割的载体连接，得到水稻颖花发育的一种基因Dh1，并通过互补试验验证了其功能。通过构建GFP融合表达载体研究其时空表达模式，进一步证实了其功能，对于今后研究水稻新品种的开发打下了基础。
文档编号C12N15/10GK1786168SQ200510095020
公开日2006年6月14日 申请日期2005年10月26日 优先权日2005年10月26日
发明者潘学彪, 张亚芳, 李爱宏, 陈宗祥, 左示敏 申请人:扬州大学