专利名称：高比活人α－2b干扰素突变体序列、酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法
技术领域：
本发明涉及具有高比活人α-2b干扰素突变体序列的确认、该序列酵母表达载体的构建、分泌表达α-2b干扰素的酵母菌株IFNα-2b-m/pGAPZα-A/GS115构建的关键技术、构建结果及利用它来生产α-2b干扰素的纯化方法。
背景技术：
目前，国内生产的α-2b干扰素，多为大肠杆菌表达产物，主要工艺缺陷是大肠杆菌的表达系统为包含体型，生产过程中需要复性，复性率低，最高为40％，因而比活性低，只有1.0×108单位/毫克蛋白，有较大的副作用；并且，分离纯化中要用价值昂贵的单抗柱，纯度才能达到95％以上；而目前国产的单抗柱，无论在产量和质量上，都不能够满足厂家需要，需要花大量经费进口，生产成本很高。
发明内容一种人α-2b干扰素突变体具有如下序列GluPheMetCysAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlySerArgArgThrLeuMetLeuLeuAlaGlnMetArgArgIleSerLeuPheSerCysLeuLysAspArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheGlyAsnGlnPheGlnLysAlaGluThrIleProValLeuHisGluMetIleGlnGlnIlePheAsnLeuPheSerThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluThrLeuLeuAspLysPheTyrThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeuGluAlaCysValIleGlnGlyValGlyValThrGluThrProLeuMetLysGluAspSerIleLeuAlaValArgLysTyrPheGlnArgIleThrLeuTyrLeuLysGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValValArgAlaGluIleMetArgSerPheSerLeuSerThrAsnLeuGlnGluSerLeuArgSerLysGlu该序列的特点是在天然干扰素序列的N端外加了三个氨基酸GluPheMet，这种改变在理论上使蛋白分子具有更好的稳定性。
同时，本发明采用酵母分泌表达系统取代大肠杆菌表达系统，目标蛋白α-2b干扰素不需要复性，其生物比活性可达到1.0×109单位/毫克蛋白；在纯化过程中，不需要价值昂贵的单抗柱，即可从发酵液中提取获得纯度达95％以上的目标蛋白α-2b干扰素，降低了生产成本。
人α-2b干扰素酵母重组株的构建方法为将克隆修饰的人α-2b干扰素基因插入pGAPZα-A之GAP启动子/α-factor信号肽下游位点，删除载体上Kex2位点Lys-Arg之后的Ste13位点Glu-Ala-Glu-Ala，构建成人α-2b干扰素基因分泌型表达载体；利用Invitrogen公司的Pichia EasyComp Transformation Kit的方法，将α-2b干扰素基因分泌型表达载体转化毕赤氏酵母(Pichiapastoris)的菌株GS115，构建成分泌型表达人α-2b干扰素突变体的酵母工程菌株-hIFNα-2b-m/pGAPZα-A/GS115；通过抗生素筛选、SDS-PAGE分析及生物比活性测定，获得目标酵母重组株。
上述的酵母重组株目标蛋白α-2b干扰素突变体的表达量为目标蛋白占分泌总蛋白的50-60％，比活性为1.08×109单位/毫克蛋白；目标蛋白α-2b干扰素突变体具有与天然α-2b干扰素相似的免疫原性和更强的结构稳定性。
本工程菌株接受外源基因是以整合于基因组形式，这与大肠杆菌、酿酒酵母的独立染色体组外质粒表达体系有显著差别，故本工程菌株较大肠杆菌、酿酒酵母稳定，不易发生外源基因丢失现象，一旦以工程菌作为样品模板，通过PCR、分子杂交等技术鉴定选择出来的阳性菌株一定是真实可靠的，且其目标表达产物α-2b直接表达分泌在培养液中，因此检测其蛋白表达量及目标产物的生物活性非常简易，这较大肠杆菌表达体系——表达产物需复性——优越得多；另外，酵母是一种简单的真核生物，因此其表达后加工模式类似高等真核生物，故用它表达的基因产物不仅具有天然产物相同的生物活性，而且低毒副作用，产品加工成本低，适用性更广。
人α-2b干扰素的纯化方法为利用获得的高产物表达量、高产物活性的酵母重组株进行发酵，离心收集上清液，以醋酸调节pH，过阳离子层析柱，收集目标洗脱峰，加硫酸铵至稍混浊，离心取上清液，过疏水层析柱，收集目标洗脱峰，过阴离子层析柱，收集目标洗脱峰，过Sephacryl分子筛层析柱，收集目标峰，得到α-2b干扰素。
本发明提供的α-2b干扰素的纯化方法，缩短了纯化时间，不需要价格昂贵的单抗柱就可以得到纯度大于95％的α-2b干扰素原液，降低了成本，在工业生产中应用将良好的经济效益。
附图为人α-2b干扰素表达载体构建图。
pGAPZα-A/hIFNα-2b-m表达载体分子大小为3.579kb。
其中pGAPZα-A为3.147kb，hIFNα-2b-m为510bp(包含终止密码子3bp)；hIFNα-2b突变体插入于载体pGAPZα-A第747bp与第824bp(XbaI位点)之间。
pGAPZα-A载体结构为磷酸甘油酸脱氢酶基因启动子区域第1-483bp磷酸甘油酸脱氢酶基因启动子引物位点第455-476bpα-交配因子分泌信号肽序列第493-759bpα-交配因子分泌信号肽引物位点第696-716bp载体多克隆位点第760-828bpmyc抗原决定簇包第827-856bp多聚组氨酸包第872-889bp3’-乙醇氧化酶1基因引物位点第974-994bp乙醇氧化酶1转录终止区域第893-1233bp转录延伸因子1启动子区域第1234-1644bp合成原核启动子第1645-1712bp
链霉菌zeocin抗性基因阅读框第1713-2087bp细胞色素合成酶1转录终止区域第2088-2405bp大肠杆菌复制子1(来源于pUC载体)第2416-3089bp具体实施方式下面结合实施例详细介绍本发明在人α-2b干扰素重组酵母工程菌株的构建和α-2b干扰素纯化工艺中的具体应用。
实施例1一、hIFNα-2b干扰素酵母工程菌的构建(一)材料1.hIFNα-2b基因2.pGAPZα-A、P.pastoris Strain GS115(his4)购自Invitrogen公司。
(二)方法1.基因PCR扩增(1)引物设计在5’端引物中删除载体上Kex2位点Lys-Arg之后的Ste13位点Glu-Ala-Glu-Ala和启始密码子ATG。
P1-5’GCTCGAGAAAAGAGAATTCATGTGTGATCTGCCTCAAACC3’XhoI Lys-Arg(Kex2位点)P2-5’GTCTAGATCATTCCTTACTTCTTAAACT3’XbaI(2)热循环95℃，5’；95℃，30”→49℃，30”→72℃，60”；72℃，10’；扩增30个循环。
2.PCR扩增产物回收与克隆(1)hIFNα-2b基因经扩增电泳后获得约527bp的DNA带；(2)用德国宝灵曼公司生产的PCR产物高纯度试剂盒回收目标片段并进行T-Vector克隆。
3.基因序列分析采用美国PE公司生产的ABI 377A DNA自动测序仪进行DNA序列分析。
4.酵母分泌型表达载体构建采用基因克隆技术将人α-2b干扰素突变体基因通过XhoI/XbaI插入pGAPZα-A之GAP启动子/α-factor信号肽下游的Xho I/Xba I位点，构建成含α-factor信号肽的分泌型酵母表达载体；pGAPZα-A/hIFNα-2b-m表达载体分子大小为3.579kb其中pGAPZα-A为3.147kb，IFNα-2b-m为510bp(包含终止密码子3bp)；IFNα-2b突变体插入于载体pGAPZα-A第747bp与第824bp(XbaI位点)之间，具体情况见附图。
表达载体转化GS115利用Invitrogen公司生产的PichiaEasyComp Transformation Kit(Cat.No.K1730-01)经稍作改进的方法进行。具体操作如下(1)挑取毕赤氏酵母(Pichiapastoris)GS115单菌落，在30℃，300转/分钟条件下以YPD+Zeocin100毫克/升培养基振荡培养至OD600＝1.3-1.5；取0.1-0.5毫升菌液至50毫升同样培养基中振荡培养至OD600＝6-8，在5000转/分钟、4℃条件下离心5分钟，去上清液，用10毫升溶液I重悬，制成感受态细胞；(2)取100微升感受态，加入5-10微升线性化的α-2b干扰素重组表达载体，再加400毫升溶液II，混匀后28℃培养1小时，加1毫升YPD，30℃培养1小时；(3)将培养物在5000转/分钟、4℃条件下离心15分钟，去上清，用200毫升溶液III重悬，涂布YPD+Zeocin100毫克/升平板，28-30℃培养24-36小时，产生单菌落。
5.高表达酵母工程菌株的筛选用Zeocin抗生素筛选获得阳性菌株后，提取工程菌基因组DNA，进一步以引物P1/P2作PCR分析和以德国宝灵曼公司生产的DiG Labelling and Detection Kit标记α-2b干扰素基因之520bp DNA片段为探针，进行Southern blotting等技术鉴定筛选出阳性菌株，再用SDS-PAGE筛选高表达目标蛋白的hIFNα-2b-m/pGAPZα-A/GS115工程菌株。
实施例2人α-2b干扰素突变体的纯化方法构建人α-2b干扰素酵母工程菌hIFNα-2b-m/pGAPZα-A/GS115后，-80℃保存菌种。发酵前，接种平板，使菌种活化，在YPD+Zeocin100毫克/升培养基中，接种单菌落发酵72小时，离心收集发酵上清液，以醋酸调节pH4.0-5.0，过CM Sepharose柱层析，收集0.4摩尔/升氯化钠洗脱峰，加硫酸铵至30％，离心取上清液，过Phenyl Sepharose柱层析，收集10％硫酸铵洗脱峰，过DEAE Sepharose柱层析，收集0.1摩尔/升氯化钠洗脱峰，过Sephacryl S-200柱层析，收集蛋白峰，得到纯度大于95％的α-2b干扰素原液。
<110>海南国栋药物研究所有限公司<120>高比活人α-2b干扰素突变体序列、酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法<160>1<170>Patent In Version2.1<210>1<211>507<212>DNA<213>人血白细胞(human blood white cell)<220>
<221>mise_feature<222>
<223>n＝a或g或c或t<400>1gaattcatgt gtgatctgcc tcaaacccac agcctgggta gcaggaggac cttgatgctc 60ctggcacaga tgcgcagaat ctctcttttc tcctgcttga aggacagaca tgactttgga 120tttccccagg aggagtttgg caaccagttc caaaaggctg aaaccatccc tgtcctccat 180gagatgatcc agcagatctt caatctcttc agcacaaagg actcatctgc tgcttgggat 240gagaccctcc tagacaaatt ctacactgaa ctctaccagc agctgaatga cctggaagcc 300tgtgtgatac agggggtggg ggtgacagag actcccctga tgaaggagga ctccattctg 360gctgtgagga aatacttcca aagaatcact ctctatctga aagagaagaa atacagccct 420tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc atgagatctt tttctttgtc aacaaacttg 480caagaagtt taagaagtaa ggaatga 507Glu Phe Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg15 10 15Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys20 25 30Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn35 40 45Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln50 55 60Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp65 70 75 80Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn85 90 95Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro100 105 110Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg115 120 125Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu
130 135 140Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu145 150 155 160Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu165 168
权利要求
1.一种人α-2b干扰素突变体，具有如下序列GluPheMetCysAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlySerArgArgThrLeuMetLeuLeuAlaGlnMetArgArgIleSerLeuPheSerCysLeuLysAspArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheGlyAsnGlnPheGlnLysAlaGluThrIleProValLeuHisGluMetIleGlnGlnIlePheAsnLeuPheSerThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluThrLeuLeuAspLysPheTyrThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeuGluAlaCysValIleGlnGlyValGlyValThrGluThrProLeuMetLysGluAspSerIleLeuAlaValArgLysTyrPheGlnArgIleThrLeuTyrLeuLysGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValValArgAlaGluIleMetArgSerPheSerLeuSerThrAsnLeuGlnGluSerLeuArgSerLysGlu。
2.一种人α-2b干扰素表达载体，其特征在于在表达质料中转入了权利要求1所述的人α-2b干扰素突变体基因。
3.、根据权利要求2所述的人α-2b干扰素表达载体，其特征在于所述的表达质料pGAPZα-A。
4.一种人α-2b干扰素突变体表达载体的构建，其特征在于将克隆修饰的人α-2b干扰素突变体基因插入pGAPZα-A之GAP启动子/α-factor信号肽下游位点，删除载体上Kex2位点Lys-Arg之后的Ste13位点Glu-Ala-Glu-Ala，构建成人α-2b干扰素突变体分泌型表达载体hIFNα-2b-m/pGAPZα-A。
5.一种转化体，其特征在于宿主被权利要求2或3所述的人α-2b干扰素表达载体所转化。
6.根据权利要求5所述的转化体，其特征在于所述的宿主为毕赤氏酵母(Pichia pastoris)菌株GS115。
7.一种α-2b干扰素的方法，其特征在于培养权利要求5所述的转化体，收集其分泌产物。
8.一种α-2b干扰素的方法，其特征在于培养权利要求6所述的转化体，收集其分泌产物。
9.一种α-2b干扰素突变体酵母表达产物的纯化方法，其特征在于直接从分泌型人α-2b干扰素酵母菌株hIFNα-2b-m/pGAPZα-A/GS115的发酵液中分离纯化α-2b干扰素离心收集发酵上清液，以醋酸调节pH，过阳离子交换层析柱，收集目标洗脱峰，加硫酸铵至混浊，离心取上清液，过疏水层析柱，收集目标洗脱峰，过阴离子层析柱，收集目标洗脱峰，过Sephacryl分子筛层析柱，收集目标峰，得到α-2b干扰素。
全文摘要
本发明涉及人α－2b干扰素突变体的序列及其分泌表达的酵母菌株IFNα－2b－m/pGAPZα－A/GS115构建的关键技术、构建结果及利用它来生产α－2b干扰素的纯化方法。本发明采用酵母分泌表达系统取代大肠杆菌包涵体表达系统，目标蛋白α－2b干扰素不需要复性，其生物比活性可达到1.0×10
文档编号C12N15/64GK1916024SQ200510095929
公开日2007年2月21日 申请日期2005年8月17日 优先权日2005年8月17日
发明者郝新保, 梁国栋, 白玉杰, 周鹏, 陈海宁, 蒲广西 申请人:海南国栋药物研究所有限公司