流式细胞仪－微载体基因芯片的制作方法

专利名称：流式细胞仪－微载体基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用流式细胞仪-微载体基因芯片，对核酸进行“高通量”式分析的技术，材料和试剂盒。
背景技术：
随着分子生物学的高速发展，以PCR和核酸杂交为基础的核酸分析技术在疾病诊断中显示出愈来愈重要的作用。这些技术具有极高的灵敏性，反应可在10-20对核酸链(RNA或DNA)存在的情况下启动。以感染性疾病为例，核酸分析技术对许多病原体，特别是对那些变异性强、传染快、致死率高的病原体(例如，非典病毒、禽流感病毒等)的早期诊断、病原体分型、和监控疫情具有举足重轻的作用。这些作用是常规的抗原和抗体检测法所不能替代的。
经典的PCR技术是以待测样本的核酸链(RNA或DNA)作模板，在转录酶(transcriptase)、反向转录酶(reverse transcriptase)、或核酸聚合酶(polymerase)、的作用下，由引物启动靶RNA或DNA扩增。由此产生的核酸单链经凝胶电泳(gel-electrophoresis)，进行定性和半定量分析。核酸杂交是用标记的核酸探针(probe)特异性结合待测核酸分子，通过标记物显示(如P32放射性显影)，阅读结果，即Southern blot或Northern blot试验.这一过程一般在硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane)或尼龙膜(nylonmembrane)等支持物上进行。
然而，这些以PCR和核酸杂交为基础的核酸分析技术，耗时(一般需要12-24小时)、技术要求高、成本高。这些缺点使该技术只能在具备一定条件的实验室进行。不仅如此，该技术复杂的操作过程限制了每次检测的靶核酸的数量。即使对一个熟练的操作者来说，也是如此。因此，这种技术倘不能满足临床上大量标本的检测和筛选。
近几年来，出现了用高聚分子微粒(例如聚苯乙烯或乳胶微粒)作为载体，经流式细胞仪测定游离的生物分子的新技术。例如，用该技术测定病毒，细菌，和真菌抗原(U.S.Patent No.6,159,719；6,225,046B1)；蛋白分子(U.S.Patent No.6,696,304)；抗磷酸脂抗体(U.S.Patent No.5,840,587)，抗核抗体(U.S.Patent No.6,159,748)。流式细胞仪-微载体技术被用于测定抗HLA抗体(U.S.Patent No.6,514,714；5,948,627；6,150,122)白细胞介素(美国BD公司；美国Luminex公司)。用流式细胞仪-高聚分子微粒测定核酸顺序、核酸配体，也相继报道(U.S.Patent No.5,853,984；6,355,431)，但还存在许多缺点。首先、待测核酸单链缺乏有效的分离提纯，特异性差，背景染色高；其次、一个试管内的PCR和流式细胞仪分析一般都是单价的，即针对一种靶核酸，所以效率低。这些缺点使该技术在应用中受到限制。
使用不同直径和内置荧光的高聚分子微粒的混合，可同时测定一个试管内的多项不同指标，称之为多价分析。当这些指标达到一定数量时，即形成‘高通量’(High-throughput)分析。不久前，本文作者发明了“流式细胞仪-微载体临床诊断芯片”(中国发明专利申请号200510041973.0)，主要涉及对多种病原体的抗原和血清学进行高通量式检测的技术，材料和试剂盒。

发明内容
本发明涉及使用流式细胞仪-微载体基因芯片，对核酸进行“高通量”式分析的技术，材料和试剂盒。
本发明的具体内容之一，用至少一种连接生物素蛋白(Biotin)的引物启动靶核酸扩增；在核酸探针上连接磁性微粒(magnetic beads)和荧光物质，将至少一种探针与扩增的靶核酸单链杂交，形成靶核酸单链-探针复合物；通过磁场，将携带磁性微粒的靶核酸单链-探针复合物分离提纯；用高聚分子微粒(例如乳胶微粒)作为微载体，微载体表面包被抗生物素蛋白(avidin)；将至少一种靶核酸单链-探针通过其生物素蛋白与微载体上的抗生物素蛋白特异性连接，产生可供流式细胞仪分析的微载体-靶核酸单链-探针(荧光)。
本发明的另一具体内容，涉及使用“双探针-三明治法”测定靶核酸单链。设计识别靶核酸单链两端(3’和5’)序列的两个探针，一个探针连接磁性微粒和荧光，作为检测探针；将至少一种检测探针与靶核酸单链杂交，再通过试管外磁场将杂交产物分离纯化，产生靶核酸单链-检测探针复合物；另一探针连接生物素蛋白，作为捕获探针。将至少一种捕获探针通过其生物素蛋白与包被在微载体上的抗生物素蛋白连接，使捕获探针固定于微载体表面；将该微载体与至少一种靶核酸单链-检测探针杂交，产生可供流式细胞仪分析的微载体-捕获探针-靶核酸-检测探针(荧光)。
本发明的另一具体内容，是流式细胞仪-微载体多价基因分析。根据微载体的不同直径和不同内置荧光，以及探针的不同荧光，在一个试管内同时测定多种靶核酸单链，形成高通量式分析模式。
本发明的另一具体内容，是提供流式细胞仪-微载体核酸芯片检测试剂盒。用于病原体(病毒，细菌，真菌，衣原体和支原体等)、炎症反应、免疫反应、肿瘤、细胞内信号蛋白等基因测定。


图1.靶核酸单链-探针-微载体的制备。用连接生物素蛋白(Biotin)的至少一种引物启动靶核酸扩增；在核酸探针上连接磁性微粒(magnetic beads)和荧光物质，形成一个核酸探针-磁性微粒-荧光复合物；将特异性探针与扩增的靶核酸单链杂交，形成靶核酸单链-探针复合物，通过磁场，将靶核酸单链-探针复合物分离提纯；用高聚分子微粒(例如乳胶微粒)作为微载体，表面包被抗生物素蛋白(avidin)，形成微载体-抗生物素蛋白复合体；将靶核酸单链-探针复合物通过其携带的生物素蛋白与微载体上的抗生物素蛋白特异性连接，产生可供流式细胞仪分析的微载体-靶核酸单链-探针(荧光)。
图2.“双探针-三明治法”测定靶核酸单链。设计识别靶核酸单链两端(3’和5’)序列的两个探针。一个探针连接磁性微粒和荧光，作为检测探针；将至少一种检测探针与扩增的靶核酸单链杂交，再通过试管外磁场将杂交产物分离纯化，产生靶核酸单链-检测探针复合物；另一探针连接生物素蛋白，作为捕获探针。将至少一种捕获探针通过其生物素蛋白与包被在微载体上的抗生物素蛋白连接，使捕获探针固定于微载体表面；将该微载体与靶核酸单链-检测探针杂交，产生可供流式细胞仪分析的微载体-捕获探针-靶核酸单链-检测探针(荧光)。
图3.流式细胞仪-微载体多价基因分析。标本为丙肝疑似患者血清，经RT-PCR同时扩增三种靶核酸(艾滋病毒-1、艾滋病毒-2和丙肝病毒)，扩增的靶核酸单链与标记有不同荧光的探针杂交；经磁场分离后，连接到直径3μM的微载体，进行流式细胞仪分析。用正向光衍射(x-轴)比电子密度(y-轴)确定微载体大小(图3A)。选择3μM直径的微载体(图3A椭圆形区)，进行单色荧光分析。结果显示丙肝病毒阳性(图3C)。
具体实施例方式
本发明的具体实施方式
之一，是在核酸引物上连接生物素蛋白(Biotin)，使该生物素蛋白-核酸引物在转录(transcription)、逆向转录(reverse transcription；RT)或RT-PCR过程中，被整合到扩增的靶核酸链(RNA或DNA)中；在同一试管中加入多种核酸引物，可同时扩增多种靶核酸。
本发明的另一具体实施方式
，是在核酸探针上连接磁性微粒(magnetic beads)和荧光染料，不同探针标记不同波长的荧光，包括荧光素异硫氰酸(FITC)、四甲基若丹明(red tetramethylrhodamine)，藻红素蛋白(R-phycoerythrin；PE)，Cy-色素(Cy-chrome)，硫氰酸(Allophycocyanin)，Peridinerophyllaprotein(PerCP)，6-FAM，CY3，碘化物(Propidium Iodide；PI)，硅纳米微粒，等其它任何生物或非生物发光染料。通过层析除去未结合的荧光染料。
本发明的另一具体实施方式
，是将至少一种探针与至少一种扩增的靶核酸单链(生物素蛋白-核酸引物-靶核酸单链)杂交，形成靶核酸单链-探针复合物；通过试管外磁场，将靶核酸单链-探针复合物吸附固定在管壁，分离提纯。
本发明的另一具体实施方式
，是用高聚分子微粒作为微载体。将抗生物素蛋白通过(但不限于)共价键等结合到高聚分子微粒表面。高聚分子微粒的材料可根据需要而异，例如，乳胶、硅、树脂，以及各种可塑性聚合材料，包括由苯乙烯，溴苯乙烯，丙烯酸，丙烯酸胺，甲基丙烯酸盐，氯化乙烯，氯化苯乙烯，乙烯醋酸盐等制成的聚亚胺脂和聚合性单体。高聚分子微粒的直径可在1-100微米，1-50微米较好，最理想的是1-20微米。一种直径的高聚分子微粒可携带一种波长、或一种强度的内置荧光。高聚分子微粒与抗生物素蛋白的共价结合，一般通过胺基、巯基、羰基、环氧基树脂、乙醛、碳二胺等基团完成。还可通过携带胺基或其它活性基团的中间分子(例如琥珀酰酯)来完成。未结合的抗生物素蛋白经洗涤、离心除去。
本发明的另一具体实施方式
，是将至少一种靶核酸单链-探针复合物与一种直径和内置荧光的微载体共培养，二者通过生物素蛋白-抗生物素蛋白特异性连接，产生可供流式细胞仪分析的微载体-靶核酸单链-探针(荧光)(图1)。
本发明的另一具体实施方式
，涉及使用“双探针-三明治法”测定靶核酸单链。设计识别靶核酸单链两端(3’或5’)序列的探针，一个探针连接磁性微粒和荧光，作为检测探针；将至少一种检测探针与扩增的靶核酸单链杂交，再通过试管外磁场将杂交产物分离纯化，产生靶核酸单链-检测探针复合物；另一探针连接生物素蛋白，作为捕获探针；将至少一种捕获探针通过其生物素蛋白与包被在微载体上的抗生物素蛋白连接，将捕获探针固定于微载体表面；将微载体与靶核酸单链-检测探针杂交，产生可供流式细胞仪分析的微载体-捕获探针-靶核酸-检测探针(荧光)(图2)。
本发明的另一具体实施方式
，是将至少一种上述的微载体-靶核酸单链复合物，在同一试管内进行流式细胞分析。根据微载体的不同直径和不同内置荧光，以及探针的不同荧光，在同一试管内同时收获分析多种靶核酸单链，形成高通量式分析模式。在流式细胞仪分析时，用正向光衍射(forward scatter)比电子密度(side scatter)确定高聚分子微粒的大小(图3A)。选择单一直径的微载体(图3A)，进行单色或双色荧光分析，测定结合在微载体上的不同靶核酸单链(图3B-D)。使用适当的对照(例如阴性标本、阳性标本和重组靶核酸单链标准)，可对以上检测结果进行定量分析。
本发明的另一具体实施方式
，是提供流式细胞仪-微载体核酸芯片临床诊断和实验室检验试剂盒。用于病原体(病毒，细菌，真菌，衣原体和支原体等)，以及其它与炎症反应、免疫反应、肿瘤等相关的蛋白分子(白细胞介素、生长因子、细胞内信号蛋白等)的基因测定。
举例病原体检测系统根据本发明的具体实施方式
之一，将至少一种引物-生物素蛋白加入待测核酸试管，经过PCR或RT-PCR使靶核酸扩增；给扩增后的试管中加入至少一种结合有磁性微粒和荧光的探针，在适当温度和时间杂交。然后，将试管置于磁场，抛弃管中液体，加入新鲜杂交缓冲液，提纯靶核酸单链-探针复合物；将试管内产物与一种直径和内置荧光的微载体-抗生物素蛋白在4℃培养30分钟后，用磷酸缓冲液(PBS)离心洗涤离心一次，进行流式细胞仪分析。根据微载体的不同直径和不同内置荧光，对比探针的不同荧光，在同一试管内同时测定多种靶核酸单链，形成高通量式分析模式。设立阴性(如正常生物标本)、阳性(如感染生物标本)或标准(重组靶核酸单链)对照，可进行定量分析。
例1.禽流感病毒分型诊断药合

例2.人类免疫缺陷病毒(HIV)分型诊断药合

例3.非典病毒(SARS-CoV)分区诊断药合

例4.疱疹病毒诊断试剂盒(Herpesviruses detection kit)

例5.呼吸病毒诊断试剂盒Respiratory viruses detection kit

例6.肝炎检测试剂盒(Hepatitis kit)

例7.病毒性肺炎检测试剂盒(Pneumonia diagnostic kit)

例8.病毒性咽炎检测试剂盒(Pharyngitis diagnostic kit)

例9.结膜炎诊断试剂盒(Conjunctivitis diagnostic kit)

例9.感染性单核细胞增多症诊断试剂盒(Infectious mononucleosis diagnostic kit)

例10.胞状溃疡诊断试剂盒(Vesicular/ulcerative diagnostic kit)

例11.小儿急疹诊断试剂盒(Exanthematous diagnostic kit)

例12.心肌/心包膜炎诊断试剂盒(Myocarditis/pericarditis diagnostic kit)

例13.胃肠炎诊断试剂盒(Gastroenteritis/Colitis diagnostic kit)

例14.骨髓抑制诊断试剂盒(Bone marrow suppression diagnostic kit)

例16.病毒性血液巨嗜细胞综合症诊断试剂盒(Virus associated hemophagocytic syndromediagnostic kit)


例17.溶血性贫血诊断试剂盒(Hemolytic anemia diagnostic kit)

例18.非典型淋巴细胞症诊断试剂盒(Atypical lymphocytes diagnostic kit)

例19.脑炎诊断试剂盒(Encephalitis diagnostic kits)


例20.表1-18.脑脊髓膜炎诊断试剂盒(Meningitis diagnostic kit)

例21.多价病毒诊断试剂盒(Hemorrhage fever diagnostic kit)


例22.多价病原体检测试剂盒(Multi-microorganism test kits)

例23.性病检测试剂盒(Sexual disease test kits)

例24.优化生育检测试剂盒(Healthy pregnancy and birth test kits)

权利要求
1.一种涉及流式细胞仪-微载体基因芯片，对靶核酸进行“高通量”式分析的技术，材料和试剂盒，其特征是一种多价靶核酸扩增技术；一种探针-靶核酸单链的杂交和提纯技术；一种使用流式细胞仪-微载体对多价靶核酸单链的高通量式分析技术、和高选择性临床诊断试剂盒。
2.根据权利要求1所述的一种多价靶核酸扩增技术，其特征是在一个试管内，用至少一种连接有生物素蛋白的核酸引物，通过PCR、RT-PCR、或TMA(Transcription Mediated Amplification)等反应，进行核酸(RNA或DNA)合成的过程。多价引物扩增数个靶核酸。
3.根据权利要求1所述的一种探针-靶核酸单链的杂交和提纯技术，其特征是用至少一种荧光标记的、结合磁性微粒的探针，与扩增的靶核酸单链杂交；通过试管外的磁场，将杂交产物分离。该荧光标记的、结合磁性微粒的探针，是在探针制作过程中或制成后，将荧光物质和磁性微粒连接到探针上。一种探针标记一种波长的荧光；荧光物质，包括(但不限于)所有能发光的生物、化学和晶体材料，例如荧光素异硫氰酸(FITC)、四甲基若丹明(Red tetramethylrhodamine)，藻红素蛋白(R-phycoerythrin；PE)，Cy-色素(Cy-chrome)，硫氰酸(Allophycocyanin)，Peridine rophyllaprotein(PerCP)，6-FAM，CY3，碘化物(PropidiumIodide；PI)，硅纳米微粒等；磁性微粒，是经过生物处理的纳米磁珠，对生物分子或分子集团(例如胺基、巯基、或羰基等)有很强的亲和力；试管外的磁场，是在试管外放置高强磁铁，将携带磁性微粒的靶核酸单链-探针吸附在管壁，抛弃管中的杂交缓冲液，将靶核酸单链-探针纯化。
4.根据权利要求1所述的一种使用流式细胞仪-微载体对多价靶核酸单链的高通量式分析，是用高聚分子微粒作为微载体，特异性地将靶核酸单链-探针结合在微载体表面，产生可供流式细胞仪分析的微载体-靶核酸单链-探针(荧光)。一种微载体结合至少一种靶核酸单链-探针。流式细胞分析时，根据微载体的不同直径和不同内置荧光，以及探针的不同荧光，在单一试管内同时分析多种靶核酸单链，形成高通量式分析模式。
5.根据权利要求4所述的高聚分子微粒，是指乳胶、硅、树脂，以及各种可塑性聚合材料，包括(但不限于)由苯乙烯，溴苯乙烯，丙烯酸，丙烯酸胺，甲基丙烯酸盐，氯化乙烯，氯化苯乙烯，乙烯醋酸盐等制成的聚亚胺脂和聚合性单体。高聚分子微粒的直径可在1-100微米，1-50微米较好，最理想的是1-20微米；微载体的内置荧光，是微载体在聚合过程中或聚合后结合不同波长或不同强度的荧光物质，形成自身携带荧光。荧光物质，包括(但不限于)所有能发光的生物、化学和晶体材料。
6.根据权利要求4所述的特异性地将靶核酸单链-探针结合在微载体表面，是通过(但不限于)靶核酸单链-引物上的生物素蛋白与微载体上的抗生物素蛋白的结合来完成；微载体上的抗生物素蛋白，是将抗生物素蛋白共价结合在微载体表面。这一过程一般通过胺基、巯基、羰基、环氧基树脂、乙醛、碳二胺等基团完成，还可通过携带胺基或其它活性基团的中间分子(例如琥珀酰酯)来完成。
7.作为权利要求6所述的靶核酸单链-微载体的连接的另一个实施方式，是用“双探针-三明治法”将靶核酸单链结合到微载体上。具体方式是，设计识别靶核酸单链两端(3’或5’)序列的探针，一个探针连接磁性微粒和荧光，作为检测探针；将至少一种检测探针与扩增的靶核酸单链杂交，再通过试管外磁场将杂交产物分离纯化，产生靶核酸单链-检测探针复合物；另一探针连接生物素蛋白，作为捕获探针；将至少一种捕获探针通过其生物素蛋白与包被在微载体上的抗生物素蛋白连接，固定于微载体表面；将微载体与靶核酸单链-检测探针杂交，产生可供流式细胞仪分析的微载体-捕获探针-靶核酸单链-检测探针(荧光)。
8.根据权利要求4所述的流式细胞仪高通量式分析模式，是将至少一种上述的微载体，在同一试管内进行流式细胞分析。在流式细胞仪分析时，用正向光衍射(forward scatter)比电子密度(side scatter)确定高聚分子微粒的大小(图3A)。选择单一直径的微载体，进行单色或双色荧光分析，测定结合在微载体上的不同靶核酸单链(图3B-D)。使用适当的对照(例如阴性标本、阳性标本和重组靶核酸单链标准)，可对以上检测结果进行定量分析。
9.根据权利要求1所述的高选择性诊断试剂盒，是用于测定生物样本中的病原体、炎症反应、免疫反应、肿瘤、细胞内信号蛋白等基因的试剂盒。生物样本，包括(但不限于)血浆、血清、组织液、细胞培养液、细胞提取物、组织提取物、分泌物、排泄物等。
10.根据权利要求9所述的病原体、炎症反应、免疫反应、肿瘤、细胞内信号蛋白等基因，包括(但不限于)以下范围；病原体，是病毒，细菌，真菌，衣原体和支原体等。包括(但不限于)单纯泡疹病毒1/2、水痘病毒、E-B病毒、巨细胞病毒、人类泡疹病毒-6/8、流感病毒A/B、付流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腺病毒、非典病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒、腺病毒、付流感病毒、肠病毒、鼻病毒、病毒性结膜炎、带状疱疹病毒、巨细胞病毒、人类免疫缺陷病毒1/2、风疹病毒、登革热病毒、细小病毒、轮状病毒、Norwalk病毒、腮腺炎病毒、虫媒病毒、流行性乙脑病毒、FSME/TBEV病毒、狂犬病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、流行性出血热病毒、脊髓灰质炎病毒、禽流感病毒、兔弓形体病毒、多瘤病毒、人类乳头瘤病毒、疯牛病病毒、柯萨奇病毒；百日咳杆菌、破伤风杆菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌、大肠杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、伤寒和斑疹伤寒杆菌、布鲁氏菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体、梅毒螺旋体、Burgdorferi螺旋体、流产螺旋体、幽门螺旋体、棘球蚴；曲霉菌、白色念珠菌、隐球菌、酵母菌、组织球孢子菌、类球孢子菌、青霉菌炎性反应基因，包括(但不限于)以下基因白细胞介素及受体IFNA1，IFNA10，IFNA13，IFNA14，IFNA16，IFNA17，IFNA2，IFNA21，IFNA4，IFNA5，IFNA6，IFNA7，IFNA8，IFNB1，IFNG，IFNK，IFNW1；IK，IL10，IL11，IL12A，IL12B，IL13，IL14，IL15，IL16，IL17，IL17B，IL17C，IL17E，IL17F，IL18，IL19，ILIA，IL1B，IL1F10，IL1F5，IL1F6，IL1F7，IL1F8，IL1F9，IL2，IL20，IL21，IL22，IL24，IL26，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL8，IL9；BMP1，BMP10，BMP15，BMP2，BMP3，BMP4，BMP5，BMP6，BMP7，BMP8B，GDF1，GDF10，GDF11，GDF15，GDF2，GDF3，GDF5，GDF8，GDF9，INHA，INHBA，INHBB，NODAL，TGFA，TGFB1，TGFB2，TGFB3；FIGF，PDGFA，PDGFB，VEGF，VEGFB；LTA(TNF-β)，LTB，TNF(TNF-α)，TNFSF4(OX40 ligand)，TNFSF5(CD40 ligand)，TNFSF6(FasL)，TNFSF7，(CD27 ligand)，TNFSF8(CD30 ligand)，TNFSF9(4-1BB ligand)，TNFSF10(TRAIL)，TNFSF11(TRANCE)，TNFRSF11B(TR1)，TNFSF12(APO3L)，TNFSF13(April)，TNFSF13B，TNFSF14(HVEM-L)，TNFSF15(VEGI)，TNFSF18；AREG，CSF1(M-CSF)，CSF2(GM-CSF)，CSF3(G-CSF)，FGF10，MDK，PTN，SPP1，THPO。Chemokines及受体CCL1(I-309)，CCL2(MCP-1/MCAF)，CCL3(MIP-1a)，CCL4(MIP-1b)，CCL5(RANTES)，CCL7(MCP-3)，CCL8(mcp-2)，CCL11(eotaxin)，CCL13(MCP-4)，CCL15(MIP-1d)，CCL16(HCC-4)，CCL17(TARC)，CCL18(PARC)，CCL19(MIP-3b)，CCL20(MIP-3a)，CCL21(SLC/exodus-2)，CCL22(MDC/STC-1)，CCL23(MPIF-1)，CCL24(MPIF-2/eotaxin-2)，CCL25(TECK)，CCL26(eotaxin-3)，CCL27(CTACK/ILC)，CCL28；(Cys-X-Cys)CXCL1(GRO1)，CXCL2(GRO2)，CXCL3(GRO3)，CXCL5(ENA-78)，CXCL6(GCP-2)，CXCL9(MIG)，CXCL10(IP 10)，CXCL11(I-TAC)，CXCL12(SDF1)，CXCL13，CXCL14，CXCL16，PF4(CXCL4)，PPBP(CXCL7)；CX3CL1(SCYD1)，SCYE1，XCL1(lymphotactin)，XCL2(SCM-1b)；BLR1(MDR15)，CCBP2(D6/JAB61)，CCR1(CKR1/HM145)，CCR2(mcp-1RB/RA)，CCR3(CKR3/CMKBR3)，CCR4，CCR5(CMKBR5/ChemR13)，CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)，CCR7(CKR7/EBI1)，CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)，CCR9(GPR-9-6)，CCRL1(VSHK1)，CCRL2(L-CCR)，XCR1(GPR5/CCXCR1)，CMKLR1，CMKOR1(RDC1)，CX3CR1(V28)，CXCR4(fusin)，GPR2(CCR10)，GPR31，GPR81(FKSG80)，CXCR3(GPR9/CKR-L2)，CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)，HM74，IL8RA(IL8Ra)，IL8RB(IL8Rb)，LTB4R(GPR16)，TCP10；CKLFSF2，CKLFSF3，CKLFSF4，CKLFSF5，CKLFSF6，CKLFSF7，CKLFSF8；BDNF，C5R1，CSF3，GRCC10(C10)，EPO，FY(DARC)，GDF5，HIF1A，IL8，PRL，RGS3，RGS13，SDF2，SLIT2，TLR2，TLR4，TREM1，TREM2，VHL。免疫反应基因，包括(但不限于)以下基因AKT1，AKT2，AKT3，APPL，BTK，C20orf97，CTMP，GNB1，GRB2，GRB10，HSPB1，HSPCA，HSPCB，ILK，IMPDH1，INPP5D，INPPL1，MTCP1，PDK2，PDPK1，PIK3CA，PIK3CB，PIK3CG，PIK3R1，PIK3R2，PIK3R3，PPP2CA，PPP2CB，PPP2R1A，PPP2R1B，PPP2R2A，PPP2R2B，PPP2R2C，PPP2R3A，PPP2R4，PPP2R5A，PPP2R5B，PPP2R5C，PPP2R5D，PPP2R5E，PTEN，PRKCA，PRKCB1，PRKCZ，TCL1A，TCL1B；JAK1，JAK2，JAK3，STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5A，STAT5B，STAT6，TYK2；MAPK1，MAPK3，MAPK6，MAPK7，MAPK8，MAPK9，MAPK10，MAPK11，MAPK12，MAPK13，MAPK14；MAP2K1，MAP2K2，MAP2K3，MAP2K4，MAP2K5，MAP2K6，MAP2K7；ARAF1，BRAF，DLK1，MAP3K1，MAP3K2，MAP3K3，MAP3K4，MAP3K5，MAP3K7，MAP3K11，MAP3K14，MAP4K1，MAP4K3，MOS，MST1，PAK1，PAK3，RAF1；NFATC1，NFATC2，NFATC3，NFATC4，NFAT5；NFKB1，NFKB2，NFKBIA，NFKBIB，NFKBIL1，NFKBIL2，NFRKB，REL，RELA，RELB；ICAM1，ICAM2，ICAM3，ICAM4，ICAM5，NCAM1，NOS2A，SELE，SELL，SELPLG，VCAM1；CALM1，CALM2，CALM3，CAMK2B，CAMK4，CNR1，ITK，MAP2K7，NCK2，PAK1，PPIA，PPP3CB，PPP3CC，PPP3R1，TRPV6，VAV1，VAV2，VAV3；CCL2，CSF2，CSF3，IFNA1，1FNB1，IFNG，IL1A，IL1B，IL2，IL3，IL4，IL6，IL8，IL10，IL12A，IL12B，IL13，IRF1，LTA，TGFB1，TNF，TNFSF5，TNFSF6，TNFSF11，VEGF；CD3E，CD3G，CD3Z，CD69，CNR1，CSF1R，CSF2RB，EDG1，EGFR，EPOR，FCER1A，FCER2，FCGR1A，FCGR3A，IFNAR1，IFNAR2，IFNGR1，IFNGR2，IL1R1，IL1R2，IL2RA，IL2RG，IL4R，IL6ST，IL8RA，IL10RA，IL10RB，IL20RA，IL22RA1，MPL，NOTCH1，OPRD1，P2RX7，PTPRC，RIPK1，TNFRSF6，TNFRSF11A，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TLR10；AKT1，AKT2，AKT3，CHUK，CSNK2A1，CSNK2B，FRAP1，GSK3A，GSK3B，IKBKB，IKBKG，IKBKE，MAP3K7IP1，PRKCA，PRKCB1，PRKCZ，RPS6KB1，SGK，SGKL，TBK1；HMGA1，KPNA5，KPNB3，NCOA1，NMI，NUP214，SH2B，SPI1，SRC，STAM，STUB1，USF1，XPO5，YY1；ATF2，CEBPB，CREB1，CREBBP，EGFR，EGR1，EGR2，EGR3，ELK1，ELK3，ELK4，EP300，ETS1，ETS2，FKBP1B，FLJ14639(NIP45),FOS，FOSL1，FOXO1A，FOXO3A，GATA3，GATA4，GRLF1，ICOS，IRF1，ISGF3G，JUN，JUNB，MADH4，MAPKAPK2，MAPKAPK3，MAX，MEF2A，MEF2B，MEF2C，MEF2D，MHC2TA，MKNK1，MLLT7，MYC，MYF5，NFKB2，NFKBIB，NFKBIE，NR4A2，PCNA，RAF1，RELA，RPS6KA5，SP1，SP3，TP53.；FADD，IRAK1，IRAK2，MAP2K1IP1，MDM2，MYD88，SLA，TNFAIP3(A20)，TRADD，TRF1，TRAF2，TRAF3，TRAF4，TRAF5，TRAF6；A2M，CABIN1，CASP3，CASP9，CDC37，CDC42，CFLAR，CTLA4，CRKL，GAB2，GNG2，GRB2，HRAS，INDO，KRAS2，KSR，MADH1，MADH2，MADH3，MADH4，MADH5，MADH6，MADH7，MADH9，MAPK8IP1，MCM5，MIZ1，NRAS，OSM，PAK1，PAK3，PIAS1，PIAS3，PIASY，PIM1，PREX1，PTPN1，PTPNS1，PTPRC，RAC1，RAC2，SOCS1，SOCS2，SOCS3，SOCS4，SOCS5，SOCS7，SUGT1，TSC1，TSC2；AGT，BAD，BCL2L1，BCL2L11，BF，C3，COL1A1，CRP，CSN2，CXCL9，DUSP1，EIF4EBP1，ENPP2，FN1，G1P2，G1P3，GATA3，GBP1，HSPA5，HSPB1，IRS1，MAF，MMP3，MST1，NPPB，NOS3，OAS1，ORM1，PIN1，SAA1，SFN，SLC2A4，SRF，TERT，YWHAZ；CCNA1，CCNA2，CCNB1，CCNB2，CCND1，CCND2，CCND3，CCNE1，CCNE2，CDK2，CDK4，CDK6，CDKN1A，CDKN1B，CDKN1C，CDKN2A，CDKN2B，CDKN2C，CDKN2D，E2F1，RB1.肿瘤基因，包括(但不限于)以下基因a2-PAG，BCM，BTA，CA19-9，CA50，CA72-4，CA195，CA242，CA549，CA-SCC，CAM17-1，CAM26，CAM29，CAR3，DU-PAN-2，FDP，GCC，MCA，NMP22，NSE，P-LAP，PNA-ELLA，SLEX，SLX，SPAN-1，ST-439，TAG12，TAG72，TAG72，TAG72.3，TATI，TNF-a，TPA；APC，CD44，CDH1(cadherin-1/E-cadherin)，CDH11，CDH6，FAT，FXYD5，ITGA7，PNN，SYK，VEGF；CD44，ITGA7，ITGB3，LAMR1；CTNNA1，FN1，MCAM，MGAT5(acetylglucosaminyltransferase V)，MTSS1；MMP10，MMP11，MMP13，MMP2，MMP3，MMP7，MMP9；TIMP2，TIMP3，TIMP4；COL4A2(collagen a2(IV))，HPSE(heparanse)；HRAS，IL1B，KRAS，TGFB1(TGF-β1)，VEGF；APC，BRMS1(BrMS1)，CDKN2A，MTSS1，NF2，NME1，NME2，PTEN，RB1，TP53；CDKN2A，MYC(c-myc)，RB1，TP53；CDKN2A，CTBP1，GNRH1，IL1B，MDM2，NF2，NME1，NME2，SSTR2；IGF1，IL18，TSHR， VEGF；GNRH1，HGF(Scatter Factor)，IGF1，TGFB1(TGF-β1)，VEGF；CCL7，CXCL12，IL18，IL1B，TNFSF10；CXCR4，EPHB2，FGFR4，FLT4，GPR54，IL8RB，MET，NR4A3，PLAUR(uPAR)，RORB，SSTR2，TSHr；DENR，EWSR1，HRAS(c-hRas)，MYC(c-myc)，SET，SRC(c-src)，SYK，TRPM1；HTATIP2，IL18，TIMP3，TNFSF10，TP53；HTATIP2，TGFB1；CXCR4，IL1B；ETV4，HTATIP2，MTA1，MYC(c-myc)，MYCL1，NME2，NR4A3，RB1，RORB，SMAD4，TCF20，TP53；CHD4，EWSR1，SMAD2；CST7，CTSK，CTSL(cathepsin L)，KAI1，KISS1(KiSS-1)，METAP2，NME4.细胞内信号蛋白基因，包括(但不限于)以下基因NFKB1，NFKB2，NFKBIA(IkBa/mad3)，NFKBIB(IkBb)，NFKBIL1，NFKBIL2，NFRKB，REL，RELA，RELB；ICAM1，ICAM2，ICAM3，ICAM4，ICAM5，NCAM1，NOS2A(iNOS)，SELE(ELAM-1/E-selectin)，SELL(L-Selectin)，SELPLG(P-selectin)，VCAM1；CCL2(MCP-1)，CSF2(GM-CSF)，CSF3(G-CSF)，IFNA1，IFNB1，IFNG，IL2，IL6，IL8，IL12A，IL12B，IRF1，LTA(TNF-b)，TNF(TNFa)；AGT(angiotensinogen)，BF，C3(C3 complement)，ORM1(AGP1)，SAA1(serumarnyloid A1)，SRE；IL1A，IL1B，TNF(TNF-a)，TNFSF11(TRANCE)；IL1R1，IL1R2，NOTCH1，RIPK1(RIP)，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TLR10，TNFRSF11A(RANK)；FADD，IRAK1，IRAK2，MYD88，TNFAIP3(A20)，TRADD，TRAF1，TRAF2，TRAF3，TRAF4，TRAF5，TRAF6；AKT1，CHUK(IKK-a)，IKBKB(IKK-b)，IKBKG(IKK-g)，IKBKE(IKKi)，MAP2K4(mkk4/JNKK1)，MAP3K1(MEKK1)，MAP3K2(MEKK2)，MAP3K7(TAK1)，MAP3K14(NIK)，MAPK14(p38 MAPK)，MAPK3(ERK1)，MAPK8(JNK1)，MAPK9(JNK2)，MAP3K7IP1(TAB1)，TBK1；ATF2(CREB-2)，CREB1，EGR1，ELK1，ELK3，FOS，JUN，MAX，MYC，RAF1.
全文摘要
本发明涉及使用流式细胞仪－微载体基因芯片，对核酸进行“高通量”式分析的技术，材料和试剂盒。本发明的具体实施方式
之一，是用连接生物素蛋白(Biotin)的引物启动靶核酸扩增；在核酸探针上连接磁性微粒和荧光物质，与靶核酸单链杂交，并通过磁场，将靶核酸单链－探针分离提纯；用包被抗生物素蛋白的高聚分子微粒作为微载体，连接靶核酸单链－探针，产生可供流式细胞仪分析的微载体－靶核酸单链－探针(荧光)；本发明的另一具体实施方式
，涉及使用“双探针－三明治法”测定靶核酸单链。设计识别靶核酸单链两端序列的两个探针，一个探针连接磁性微粒和荧光，作为检测探针；将检测探针与靶核酸单链杂交，并通过试管外磁场分离纯化，产生靶核酸单链－检测探针复合物；另一探针连接生物素蛋白，作为捕获探针。将捕获探针与微载体上的抗生物素蛋白连接，再与靶核酸单链－检测探针杂交，产生可供流式细胞仪分析的微载体－捕获探针－靶核酸单链－检测探针(荧光)；本发明的另一具体实施方式
，是对以上产物进行多价流式细胞仪分析。根据微载体的不同直径和不同内置荧光，以及探针的不同荧光，在一个试管内同时测定多种靶核酸单链，形成高通量式分析模式；本发明的另一具体实施方式
，是流式细胞仪－微载体核酸芯片临床诊断和实验室检验试剂盒，用于病原体(病毒，细菌，真菌，衣原体和支原体等)、炎症反应、免疫反应、肿瘤、细胞内信号蛋白等基因测定。
文档编号C12Q1/68GK1970789SQ20051009639
公开日2007年5月30日 申请日期2005年11月21日 优先权日2005年11月21日
发明者林远, 郑芳 申请人:林远, 郑芳