专利名称：肿瘤新生血管特异性结合多肽与重组人Tum－5融合蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域的基因克隆、基因重组、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白的纯化、肿瘤新生血管特异性结合多肽与重组人Tum-5融合蛋白的体外活性测定及理化性质鉴定等技术，涉及一种抗肿瘤药物及其制备方法，特别涉及能够特异性结合于肿瘤组织新生血管内皮细胞及肿瘤细胞的肿瘤新生血管特异性结合多肽与重组人Tum-5融合蛋白(Tum-5-NGR)及其制备方法。
背景技术：
导向肽NGR的应用已在专利“肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白及制备”(专利号ZL 02139537.3)中有比较详尽的介绍，这里就不再赘述。下面主要介绍肿瘤新生血管形成及Tumstatin和Tum-5的研究进展。
1.1肿瘤血管生成与其生长转移及其治疗的关系血管生成angiogenesis即新生的血管形成是肿瘤发展及转移的重要条件。血管生成包括1).内皮细胞向邻近组织基质内浸润；2).迁移；3).伸展；4).增生；5).内皮细胞之间的相联；6).血管腔的形成。人体内正常的血管生成包括胚胎发育、器官形成、黄体形成和伤口愈合等，而异常的血管生成则主要见于慢性炎症、糖尿病性视网膜病、风湿性关节炎和恶性肿瘤等。如血管生成过程中一个或数个环节被抑制，血管生成就会中断。血管生成的病理生理过程受诱导剂和抑制剂的调节。诱导剂主要为各种生长因子和炎性物质等，它能够刺激新的血管生成，而抑制剂指各种抗血管生成的物质或制剂具有对抗血管生成的活性。20世纪70年代初，Folkman提出了“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”这一理论。肿瘤一旦发生瘤细胞数量的增加必须依赖肿瘤血管的形成随后的研究支持该理论，自此抑制肿瘤血管生长就成为了一种新的肿瘤治疗策略，而被广泛重视。
1.1.1肿瘤血管的生成1.1.1.1肿瘤血管形成机制血管形成的多环节涉及内皮细胞、外膜细胞、可溶性血管生长因子以及不溶性细胞外基质成分等。肿瘤血管形成首先始于围绕在已经存在的毛细血管后静脉周围的基底膜溶解，这是肿瘤产生的胶原酶或其他金属蛋白酶、血浆酶原激活物以及血管渗透因子作用的结果。肿瘤血管形成的第二阶段是不处于有丝分裂期的内皮细胞移出血管，向肿瘤迁移。尽管内皮细胞没有有丝分裂，但内皮细胞的迁移是新生血管形成的先决条件。内皮细胞的迁移可引起毛细血管伸长，伸长的内皮细胞最终沟通成管形成新的血管腔这些未成熟的血管进一步形成血管分支和血管网。当管周基底膜成分的沉积和管周起支持作用的外膜细胞形成后，成熟的毛细血管网才真正形成。可溶性细胞因子、内皮细胞、活化基质蛋白酶整和素在血管生成中都起到很重要的作用。
①.可溶性细胞因子常见的血管生长因子包括酸性和碱性成纤维细胞生长因子(a-FGF、b-FGF)、转化生长因子α(TGF-α)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血管调理素、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管渗透因子(VPF)、滤泡性星状衍化因子(FSDGF)血管生成素、低分子非肽类血管生长因子等，这些血管生长因子在肿瘤血管形成的不同阶段以不同的方式调节着血管形成。
②.内皮细胞活化血管内皮细胞增殖逐渐形成管腔结构，从而发挥功能。成年人，内皮细胞的增殖几乎停止，仅在外伤或疾病如肿瘤时成为体内许多因子和基质成分作用的对象，增殖才相对活跃。抑制内皮细胞的增殖已经成为抗肿瘤浸润和转移的研究途径之一。针对内皮细胞增殖抑制的研究较多而较为成功的是TNP-470，它是从烟曲霉菌中提取的一种化合物，有较强的内皮细胞抑制作用，通过与一些高亲和性的分子相结合，阻止DNA合成，直接或间接导致增殖的上皮细胞停留在G0或G1期，使G2或M期细胞显著减少。生长因子依赖细胞或含有生长因子受体的细胞对TNP-470较为敏感，小剂量出现细胞抑制，较大剂量时有细胞毒性作用。
③.基质蛋白酶的作用基质在肿瘤血管形成过程中也发挥着重要作用。肿瘤细胞分泌许多基质蛋白酶，内皮细胞在血管生长因子刺激下，在增殖的同时，也分泌一些蛋白酶降解基底膜，以利于肿瘤和内皮细胞的迁移、浸润和血管的形成。基质蛋白酶大部分都含有一个金属离子结合区又称金属蛋白酶(MMP)，以无活性的形式存在于组织中，在肿瘤浸润和血管形成时可被激活，基质降解产物如层粘蛋白也可刺激内皮细胞增殖。
④.整合素的作用整合素家族成员为一类跨膜异源二聚体糖蛋白受体，电镜下呈位于细胞膜表面的球茎形结构，介导细胞-细胞外基质(ECM)、细胞-细胞间的粘附及相互作用。在血管发生过程中，整和素表达于活化的内皮细胞表面可以调节细胞与多种ECM分子如纤粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白、血纤维蛋白、胶原蛋白I型和IV型、降解的胶原、von Willebrand因子间的粘附反应，每种粘附反应又可以调节细胞迁移增殖和分化。另外组织间粘附分子组成的差异，决定了血管发生的组织差异。αvβ3整和素是一种可以识别含RGD三肽序列的ECM分子，但αvβ3也可以以非RGD依赖的形式结合于金属基质蛋白酶-2(MMP-2)，并将活性状态的MMP-2定位于新发生的血管细胞表面，这就使得新发生的血管的内皮细胞在伸展过程中能够降解、改建ECM。天然状态的含RGD的胶原不能与αvβ3连接，只有当MMP对胶原进行酶解后，这些RGD位点才能与αvβ3连接。
1.1.1.2肿瘤侵袭转移与肿瘤血管生成肿瘤侵袭转移是目前肿瘤治疗失败的主要原因，肿瘤侵袭转移是一复杂的多阶段过程，可以概括为原发瘤增殖、肿瘤新生血管生长；瘤细胞侵袭基底膜；穿入血管或淋巴管；在循环系统中存活，形成瘤栓并转运到远隔靶器官；滞留于靶器官的微小血管中；穿出血管并形成微小转移灶；肿瘤血管形成，转移癌灶增殖。可见在肿瘤发生侵袭转移的多步骤过程中，无论肿瘤转移的起始或终末阶段，血管生成均发挥着重要作用。
1.1.1.3肿瘤治疗与血管生成肿瘤的生长依赖于血管的新生，因此，抑制肿瘤血管的生成已经成为一种肿瘤治疗的策略。传统治疗肿瘤的方法主要是针对肿瘤细胞的治疗，如手术切除肿瘤、化疗、放疗及免疫生物治疗等。但是在临床上疗效却不能完全令人满意如穿透肿瘤能力的有限性、靶细胞种类的局限性、引起副作用的毒性等；而且由于肿瘤细胞种类繁多，易发生变异和突变。所以，针对肿瘤细胞的治疗方法所面临的最主要的问题就是，大多数肿瘤经过一段时间的化疗或放疗后都将产生不同程度的耐药性。肿瘤产生耐药性是目前所用的放射免疫以及化学疗法面临的严重问题，抗药性的出现部分原因是遗传不稳定性、异性生殖和肿瘤细胞的高突变率。相比较而言，内皮细胞遗传稳定、同源突变率低，抗血管生成疗法直接针对肿瘤内皮细胞，内皮细胞对这种疗法的抗药性很小甚至没有抗药性。无论何种肿瘤，其生长和转移均呈严格的血管形成依赖性，即需要血管新生以输送营养及生长因子。血管生成抑制剂直接作用于运动的及增殖的毛细血管内皮细胞，故特异的血管生成抑制剂不太可能造成骨髓抑制、胃肠道反应或脱发等传统化疗药物造成的毒副反应。因此，针对血管内皮细胞来治疗肿瘤效果稳定，对多种肿瘤都有抑瘤作用。
1.1.1.4肿瘤血管生成抑制剂的研究策略以血管生成的各个环节及其发生过程中的系列化改变为靶点，研制血管生成抑制剂，控制肿瘤生长和转移，将成为肿瘤防治的一个重要途径。血管生成抑制剂的研究主要有几种策略1).内皮细胞增殖抑制剂CAI；2).内皮细胞迁移抑制剂TNP470、烟曲霉素(fumagillin)、酞胺哌啶酮(thalidomide)、白介素12(IL12)；3).基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)；4).胶原酶抑制剂(Col-3)；5).促血管生成因子抑制剂VEGF抗体、bFGF抗体PF-4；6).αvβ3整和素抑制剂抗αvβ3的单克隆抗体LM609(vitaxin)；7).内源性肿瘤血管内皮细胞生长抑制因子Angiostatin、Endostatin、Tumstatin、Canstatin。
1.2Tumstatin和Tum-5Tumstatin是2000年发现的一种内源性血管内皮细胞生长抑制因子，与较早发现的Endostatin相类似。Tumstatin也来源于胶原，但具有比Endostatin更强的抗血管生成作用，并且用量也明显减低。另外，它还具有其他内源性抑制因子所没有的，直接作用于肿瘤细胞引起肿瘤细胞凋亡的特性。因此，它将成为一种潜在的治疗肿瘤和其他血管异常增生性疾病的药物。
1.2.1Tumstatin的发现1994年，Monboisse等发现牛晶状体来源的胶原IVα3链的非胶原区域1[α3(IV)NC1]185-203氨基酸功能肽，能够抑制多型核白血病细胞活化，从而阻断I型胶原诱导的多形核白血病的发生。1997年，Han进一步发现该肽能够提高黑素瘤细胞的黏附能力并抑制其增殖。2000年，Petitelerc等用重组的α3(IV)NC1进行体内体外实验，证明了该蛋白质能抑制毛细血管内皮细胞的增殖和诱导内皮细胞凋亡，抑制血管形成，进而抑制肿瘤生长，因此，将此蛋白命名为Tumstatin。
1.2.2Tumstatin的结构及分布血管基底膜是一薄层细胞外基质，是血管内皮细胞和血管平滑肌细胞生长的支持物。IV型胶原是组成血管基底膜的主要大分子物质，在内皮细胞增殖和血管新生中起重要作用。IV型胶原是由6条α链(α1-α6)形成的三聚体，并近一步形成网状结构，从而为其他基底膜大分子物质提供蛋白质支架。IV型胶原的α链由三个结构域组成N末端的7S结构域；三螺旋体结构域；C末端的非胶原结构域1(NC1)。IV型胶原蛋白α链的6种同工体的非胶原区域均普遍存在不同程度的抑制肿瘤血管生成的作用，其中以α3(IV)NC1的作用最强。
Tumstatin是由IV型胶原α3链中间的三螺旋体结构域C端的12个氨基酸和非胶原结构域1(NC1)非胶原蛋白1功能区共244个氨基酸组成，相对分子量28kD，编码核苷酸序列为738bp。Tumstatin的分布具有组织和器官特异性。它的转录产物在胚胎存在于肾脏和肺，在成人见于肾脏、骨骼肌纤维和肺；少量见于晶状体囊、耳蜗、卵巢、睾丸的基底膜，主动脉血管基底膜内含量很少，成人的脑、心脏和肝脏中均不存在。
1.2.3Tumstatin的生物学活性
1.2.3.1抑制血管生成Tumstatin抑制内皮细胞蛋白的合成，导致内皮细胞凋亡，使肿瘤血管的生成受到抑制，从而抑制肿瘤细胞的生长、浸润和转移。其分子机制为Tumstatin可以经与内皮细胞膜上的αvβ3整合素结合，进而抑制FAK、PI3K、PKB/Akt)信号转导通路的活化，降低了mTOR活性，进而降低了真核起始因子4E的磷酸化，使在翻译过程中真核起始因子蛋白4E无法与4E结合蛋白解离，导致帽依赖性翻译受到抑制，最终内皮细胞蛋白合成受到抑制，抑制血管的新生。Tumstatin的这种抑制血管生成的作用只存在于病理的过程，而对于生理过程的血管新生，并没有抑制作用。
1.2.3.2抗肿瘤特性Tumstatin直接抑制肿瘤细胞增生、促进肿瘤细胞凋亡的功能位点是靠近C端的185-203位氨基酸组成的19肽，此19肽可直接抑制黑色素瘤细胞和其他上皮肿瘤细胞以及多形核白细胞的生长，它与整合素αvβ3/CD47复合体结合后，引起不同细胞粘附、趋化以及增生的抑制。但这19肽与细胞之间的作用不依赖于CD47。在CD47不存在的情况下，也可直接激活FAK、PI3K来抑制黑色素瘤细胞和纤维瘤细胞的转移。有研究认为，抑制黑色素瘤细胞的作用可能与位于序列中189-191的-SNS-有关，此序列的空间结构是位于两个β片层之间的转角，是黑色素瘤细胞粘附和增生所必需的。在保持-SNS-的空间结构不变的条件下，缩简19肽的长度，其抗黑色素瘤细胞生长的活性不发生改变。
1.2.4Tumstatin的作用机制Tumstatin并不改变血管内皮细胞的mRNA表达水平，而在整体水平上抑制细胞的蛋白质合成，该作用是特异性作用于血管内皮细胞。目前已发现Tumstatin蛋白的54-132位氨基酸能够以非RGD依赖方式结合αvβ3整和素。当使用αvβ3整和素抗体时能阻断人脐静脉内皮细胞与Tumstatin附着91％以上，因此，Tumstatin是以非RGD序列结合αvβ3整和素，再通过抑制FAK活性途径、通过抑制PI3激酶活性途径、以及通过抑制PKB/Akt激酶活性和mTOR活性途径，最终通过阻断真核翻译起始因子(elF4E)和它的结合蛋白的解离来介导内皮细胞特异性的mRNA帽子依赖性的蛋白质合成(cap-dependent translation)，从而抑制内皮细胞的增殖、诱导内皮细胞的凋亡、抑制肿瘤的血管新生进而抑制肿瘤的生长和转移。
1.2.5Tum-5的结构与功能1.2.5.1Tum-5的结构Tum-5由Tumstatin接近N端的54-132位氨基酸组成的，该区域是Tumstatin的抗血管生成活性区域。研究证实Tum-5与全长的Tumstatin具有同等的抗血管生成效能。Tum-5的序列中含有5个半胱氨基酸，但Tum-5的活性依赖于其一级结构，改变Tum-5的二级结构或者对其进行烷基化均不影响其抗血管生成活性。
1.2.5.2Tum-5的功能Tum-5可以特异性抑制内皮细胞增殖和迁移，导致内皮细胞凋亡，使肿瘤血管的生成受到抑制，抑制肿瘤细胞的生长、浸润和转移。Tum-5的抗肿瘤血管生成作用要比先前发现的血管内皮抑素Endostatin强10倍，并呈剂量依赖关系。可抑制体外培养的牛肺主动脉内皮细胞(C-PAE)和人脐静脉内皮细胞增殖、鼠主动脉内皮细胞的形成。当Tum-5剂量为1μg/ml时，内皮细胞的小管形成几乎完全被抑制，同时还可有效的引起内皮细胞凋亡。另外，Tumstatin为肺-肾出血综合征(Goodpasture)的自身抗原，可能对肾、肺和机体的其他器官造成一定的损害。Tumstatin的抗原表位位于N端的1-40个氨基酸，而这段序列没有抗肿瘤作用。Tum-5去除了这段序列，这样可降低其引起肺-肾出血综合征的副作用，却不影响Tum-5本身的抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种能够特异性结合于肿瘤组织新生血管内皮细胞的肿瘤新生血管特异性结合多肽与重组人Tum-5融合蛋白(Tum-5-NGR)及其制备方法。本发明能够进一步提高重组人Tum-5的抗肿瘤活性，同时降低毒副作用，减少用药量。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种Tum-5融合蛋白，其特征在于，依照GenBank中公布的人Tum-5基因序列，将编码Tum-5氨基酸的密码子替换为大肠杆菌惯用的密码子，并在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到Tum-5融合蛋白。
一种肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与重组人Tum-5融合蛋白，其特征在于，选择肿瘤新生血管特异性结合多肽CNGRCVSGCAGRC和人Tum-5基因，构建肿瘤新生血管特异性结合多肽CNGRCVSGCAGRC和人Tum-5基因的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到Tum-5-NGR融合蛋白。
本发明还涉及上述肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与重组人Tum-5融合蛋白的制备方法。
本发明的Tum-5融合蛋白、Tum-5-NGR融合蛋白分别能与肿瘤新生血管内皮细胞表面高效表达的氨肽酶N(CD13)结合。其在大肠杆菌中获得表达量可占菌体总蛋白的40％，在此基础上，利用Ni-NAT resin柱亲和层析成功纯化Tum-5-NGR，经SDS-PAGE鉴定纯化后融合蛋白的纯度达90％以上。体外EVC304细胞杀伤实验证实Tum-NGR能抑制内皮细胞的增殖，并呈剂量依赖性。小管形成抑制实验中Tum-5-NGR也显示出明确的抑制作用。在昆明种小鼠体内接种瘤细胞S180，建立肿瘤模型，结果表明当剂量为1mg/kg时，Tum-5-NGR的抑瘤效果优于Tum-5，抑瘤率分别为37.78％和26.83％，与对照组相比，均有明显差异(P＜0.01)。免疫组化结果显示，与Tum-5相比，Tum-5-NGR能更好的在肿瘤新生血管处富集。
图1是pQE-T的测序结果图；图2是pQE-TN的测序结果图；图3是pQE-T、pQE-TN的诱导表达图；其中标号表示1.分子量蛋白质标准(从上至下分子量依次为94000/66000Da；43000Da；31000Da，21000Da，14400Da)；2.pQE-TN诱导表达前；3.pQE-TN诱导表达后；4.pQE-T诱导表达前；5.pQE-T诱导表达后。
图4是Tum-5的纯化效果图；其中标号表示1、低分子量蛋白质标准；2、Tum-5 25mmol/L咪唑洗脱；3、Tum-5 100mmol/L咪唑洗脱；4、Tum-5 250mmol/L咪唑洗脱；图5是um-5-NGR的纯化效果图；1.低分子量蛋白质标准；2.Tum-5-NGR 25mmol/L咪唑洗脱；3.Tum-5-NGR 100mmol/L咪唑洗脱；4.Tum-5-NGR 250mmol/L咪唑洗脱。
图6是Tum-5和Tum-5-NGR内皮细胞增殖抑制实验直方图；图7是Tum-5和Tum-5-NGR对内皮细胞小管形成的影响，其中A阴性对照，B、C、DTum-5组，20μg/ml(B)、5μg/ml(C)、1μg/ml(D)，E、F、GTum-5-NGR组，20μg/ml(E)、5μg/ml(F)、1μg/ml(G)；图8是Tum-5和Tum-5-NGR对小鼠移植瘤S180的抑制率直方图；图9是Tum-5和Tum-5-NGR体内分布结果。其中图A、D、G、J分别是阴性对照组的肝、脾、肾和肿瘤组织切片；图B、E、H、K分别是Tum-5-NGR组的肝、脾、肾和肿瘤组织切片；图C、F、I、L分别是Tum-5组的肝、脾、肾和肿瘤组织切片。
以下结合附图对本发明作进一步的详细描述。
具体实施例方式
1.Tum-5和Tum-5-NGR His融合基因原核表达载体的构建1.1Tum-5His融合基因原核表达载体的构建依照GenBank中公布的人Tum-5基因序列，将编码Tum-5氨基酸的密码子替换为大肠杆菌惯用的密码子(有利于目的蛋白在大肠杆菌的高效表达)，交由上海博亚生物技术有限公司全基因合成，上游引入SphI酶切位点，下游引入HindIII酶切位点，并将目的基因克隆入载体pMD-18T中，命名为pMD-18T-Tum-5。
将pMD-18T-Tum-5用SphI和HindIII双酶切后，回收小片段；将质粒pQE30(Qiagen公司产品)用SphI和BamH1双酶切后，回收大片段。以上两个片段用T4连接酶进行连接，连接产物转化感受态DH5α细胞，应用蓝白斑筛选方法，挑取白色克隆，培养过夜，经酶切鉴定，证实获得插入片段大小正确的表达载体，经DNA序列测定，证实其序列与理论值相符。将测序正确的质粒命名为pQE30-Tum-5，简称pQE-TN。
1.2Tum-5-NGR His融合基因原核表达载体的构建依照GenBank中公布的人Tum-5基因序列，将编码Tum-5氨基酸的密码子替换为大肠杆菌惯用的密码子(有利于目的蛋白在大肠杆菌的高效表达)；同时设计编码NGR多肽的寡核苷酸序列，并将该序列连于Tum-5基因的3’端，为方便克隆，两者之间加入BamHI的酶切位点(ggatcc)。将该序列交由上海博亚生物技术有限公司全基因合成，并上游引入SphI酶切位点，下游引入HindIII酶切位点，然后将目的基因克隆入载体pMD-18T中，命名为pMD-18T-Tum-5-NGR。将pMD-18T-Tum-5-NGR用SphI和HindIII双酶切后，回收小片段；将质粒pQE30-30用SphI和HindIII双酶切后，回收大片段。以上两个片段用T4连接酶进行连接，连接产物转化感受态DH5α细胞，应用蓝白斑筛选方法，挑取白色克隆，培养过夜，经酶切鉴定，证实获得插入片段大小正确的表达载体，经DNA序列测定，证实其序列与理论值相符。将测序正确的质粒命名为pQE30-Tum-5-NGR，简称pQE-TN。
1.3pQE30-Tum-5和pQE30-Tum-5-NGR的诱导表达正确重组的pQE30-Tum-5/DH5α工程菌和pQE30-Tum-5-NGR/DH5α工程菌，37℃活化振摇培养过夜，次日晨以1∶100比例接种LB(含100μg/ml氨苄)培养基，37℃继续培养4h后，加入IPTG(1mmol/L)，诱导4h。3000rpm离心15min收菌。
1.4Tricine-SDS-PAGE各取500μL的pQE-T/DH5α和pQE-TN/DH5α诱导或未诱导表达的菌液离心取沉淀，加入30μL水及30μL 2×载样缓冲液混匀，沸水中煮5min，12000prm离心5min，取10μL上清加样于15％分离胶6％浓缩胶，上样后电压为55V约1h，样品进入分离胶后电压升至70V约4h，用0.5％考马斯亮兰R-250振荡染色2-3h，脱色直至背景清晰后制备干胶保存。
1.5免疫印迹反应Tricine-SDS-PAGE结束后，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维膜(NC膜)靠近阳极一侧，转移缓冲液(25mmol/L Tris、192mmol/L Glycine、20％甲醇)，100V恒压1h，将蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转移结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST(含0.02mol/L pH7.4TBS、0.4％ Tween20)室温洗3次，浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中37℃ 2h，洗涤液(TBST)室温洗3次，加鼠抗His单抗，37℃孵育1h，TBST室温洗膜3次，加入兔抗鼠IgG-HRP，37℃孵育1h，TBST室温洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入显色液中，室温避光显色5min，蒸镏水冲洗终止反应。
1.6.表达产物的纯化按1克菌体加10ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌。12000rpm，离心15m，弃上清，1克沉淀加10ml A液[8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris(PH8.0)]。4℃搅拌1h，12000rpm，离心15min，收集上清，将其上于用A液充分平衡的Ni柱，然后先用含25mmol咪唑的A液洗脱杂蛋白，再用含250mmol咪唑的A液洗脱目的蛋白。收集洗脱峰，部分纯化产物透析至B液[2.5M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris(PH8.0)]复性，终浓度1mg/ml，进行体内抑瘤实验。部分纯化产物透析至纯水中，冻干后进行体外活性测定。
2. 体外活性测定2.1内皮细胞增殖抑制实验于96孔培养板中每孔加100μl含500个EVC304细胞的DMEM培养液(含5％FCS)，置于37℃，5ml/L CO2培养箱中培养过夜。弃去培养液，每孔加入100μl含不同浓度Tum-5和Tum-5-NGR的DMEM培养液(含20％FCS)，然后在37℃，5ml/L CO2条件下，孵育36-48h。在培养板中加入20μl MTT溶液，继续培养4-6h。弃上清，每孔加入100μl DMSO至完全溶解后，用酶标仪测定波长490nm的A值，并计算抑制率。
抑制率(％)＝[(A空白对照-A实验组)/A空白对照]×100％2.2对内皮细胞小管形成的影响用无血清的DMEM培养液稀释Matrigel(1∶1)，将Matrigel液铺于96孔板中，每孔100ul，待聚合后，加入含不同浓度Tum-5和Tum-5-NGR的细胞悬液(5×105/ml)，37℃，5％CO2条件下培养8h，观察两种蛋白对内皮细胞小管形态状态的影响，并照相。
3.体内抑瘤实验3.1材料动物昆明种小鼠，体重18-22g，雌性，由兰州大学实验动物中心提供。
药品Tum-5和Tum-5-NGR为受试药物，受试药用2.5mol/L尿素溶液稀释。阳性对照组为注射用环磷酰胺(CTX)(江苏恒瑞医药股份有限公司产品)，阴性对照组为注射用生理盐水。
实验瘤株小鼠S180肿瘤细胞株，兰州大学实验动物中心提供。
3.2接种昆明小鼠，腹腔接种S180肿瘤细胞后7天时，无菌条件下，用5ml的7号针头注射器抽取腹水，加入10ml离心管内，加适量的生理盐水(NS)，1000转/分钟，离心5分钟，倾出上清，按一定比例加入NS制成瘤细胞悬液(细胞数2.5×106/ml)，接种于昆明种小鼠右前腋窝皮下，每只小鼠注射0.2ml，即5×105细胞/鼠。
3.3分组实验第1天，动物接种肿瘤细胞。第2天，动物称重，随机分为四组，即导向性Tum-5(Tum-5-NGR)实验组、Tum-5实验组、环磷酰胺(CTX)20mg/kg阳性对照组和生理盐水组。除生理盐水组为每组20只小鼠外，其他各组均为12只。
3.4给药分组当天开始给药。CTX隔日一次腹腔注射，受试药物每日2次腹腔注射，间隔8h。共给药9天。末次给药后1h时摘眼球取血，离心，取血清，-30℃保存。剥取皮下瘤块、肝、肾和脾脏，称瘤重，计算受试组的抑瘤率(IR)。然后，立即将瘤块和组织切为两块，一块置-30℃保存备用；一块置4％甲醛溶液中固定，石蜡包埋后，制备病理切片，以备免疫组化检测。
3.5实验数据的统计数据以x±s表示，显著性采用双侧Student’s t检验。
3.6体内分布实验3.6.1材料处理荷瘤小鼠静脉注射Tum-5或Tum-5-NGR各1mg/kg，给药后30min时眼眶静脉放血处死后，立即取0.3cm厚的瘤组织块，在固定液(10％中性福尔马林，50mmol/L PBS，pH7.2)中4℃固定3~6h，置于溶液(5％蔗糖，50mmol/L PBS，pH7.2)中4℃过夜，冷50％丙酮脱水，置于纯丙酮脱水2次，二甲苯透明，浸蜡，石蜡(54-56℃)包埋，切片，37℃烤箱烤干，进行鼠抗His单克隆抗体的免疫组化染色。从取材到包埋时间＜36h。
3.6.2免疫组化染色按SP试剂盒所示步骤并加以改进进行免疫组化染色肿瘤组织切片脱蜡至水，经10ml/L H2O2封闭内源酶，室温30min，pH7.2；3M尿素消化暴露抗原部位，室温30min；PBS振洗3次，每次5min；98℃微波炉修复抗原10min冷却至室温，修复液为0.01M的柠檬酸缓冲液(pH6.0)；PBS振洗3次，每次5min；滴加10％非免疫动物血清，室温下孵育5min，吸掉；滴加鼠抗His单克隆抗体后4℃冰箱放置过夜；37℃孵育60min；0.01M的PBS振洗3次，每次5min；滴加生物素标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育10min；PBS振洗3次，每次5min；滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液，37℃孵育10min；PBS振洗3次，每次5min；DAB-H2O2显色5min，苏木精衬染，脱水透明，中性树胶封固。
本发明的技术效果是1)构建了重组人Tum-5的原核融合表达载体pQE-T，DNA序列测定证实完全正确(参见图1)。将表达载体转化感受态细胞，经IPTG诱导，其表达产物可占总蛋白的40％以上(参见图3)。
2)通过分步克隆法，将人工合成的编码NGR的寡核苷酸片段与重组人Tum-5的3’端连接，构建了Tum-5-NGR融合基因的原核融合表达载体pQE-TN，DNA序列测定证实完全正确(参见图2)。将表达载体转化感受态细胞，经IPTG诱导后，其表达产物可占总蛋白的40％以上(参见图3)。
3)纯化了Tum-5和Tum-5-NGR融合蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳和HPLC检测均证实，两种蛋白的纯度均大于90％(参见图4和图5)。
4)体外EVC304细胞杀伤实验证实Tum-5和Tum-NGR-C均能抑制内皮细胞的增殖，并呈剂量依赖性；而且，各剂量组的Tum-5抑制效果优于Tum-5-NGR。(参见图6)。
5)小管形成抑制实验中，不同浓度的Tum-5和Tum-5-NGR均能明显地抑制EVC304细胞在Matrigel上形成三维的管状结构(参见图7)。
6)对移植瘤治疗作用研究的结果表明，在昆明种小鼠体内接种瘤细胞S180，建立肿瘤模型，当药物剂量为1mg/kg时，Tum-5-NGR的抑瘤效果优于Tum-5，抑瘤率分别为37.78％和26.83％，与对照组相比，均有明显差异(P＜0.01＝(参见表1和图8)。
7)对荷瘤小鼠肿瘤血管靶向性研究的结果中，免疫组化结果显示，注射药物30min后，与阴性对照组相比，Tum-5除了脾脏外，在肝、肾和肿瘤组织中有少量分布；而Tum-5-NGR在肿瘤组织中大量富集，阳性免疫产物主要聚集在血管及其周围组织(参见图9)。
表1Tum-5和Tum-5-NGR对小鼠移植瘤S180的抑制作用
*代表P＜0.05，**代表P＜0.01注T为Tum-5，N为Tum-5-NGR。
Tum-5融合蛋白核苷酸序列和它对应的氨基酸序列ggt ttt tct ttt ctg ttt gta caa ggt aac cag cgt gct cac ggt cag 48Gly Phe Ser Phe Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln1 5 10 15gac ctg ggt act ctg ggc agc tgc ctg cag cgt ttt acc act atg ccg 96Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro20 25 30ttc ctg ttc tgc aac gtt aac gat gta tgc aac ttt gca tct cgt aac 144Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn35 40 45gat tac tct tac tgg ctg tct act ccg gct ctg atg ccg atg aac atg 192Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met50 55 60gct ccg att act ggc aga gct ctg gag ccg tac atc agc aga tgc act 240Ala Pro Ile Thr Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr65 70 75 80gtt tgc gaa ggt ccg gcg atc gct 264Val Cys Glu Gly Pro Ala Ile Ala85
Tum-5-NGR融合蛋白核苷酸序列和它对应的氨基酸序列ggt ttt tct ttt ctg ttt gta caa ggt aac cag cgt gct cac ggt cag 48Gly Phe Ser Phe Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln1 5 10 15gac ctg ggt act ctg ggc agc tgc ctg cag cgt ttt acc act atg ccg 96Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro20 25 30ttc ctg ttc tgc aac gtt aac gat gta tgc aac ttt gca tct cgt aac 144Phe Leu Phe Cys Ash Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn35 40 45gat tac tct tac tgg ctg tct act ccg gct ctg atg ccg atg aac atg 192Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn Met50 55 60gct ccg att act ggc aga gct ctg gag ccg tac atc agc aga tgc act 240Ala Pro Ile Thr Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr Ile Ser Arg Cys Thr65 70 75 80gtt tgc gaa ggt ccg gcg atc gct gga tcc tgc aac ggt cgt tgc gtg 288Val Cys Glu Gly Pro Ala Ile Ala Gly Ser Cys Asn Gly Arg Cys Val85 90 95agc ggt tgc gcg ggt cgt tgc 309Ser Gly Cys Ala Gly Arg Cys100
权利要求
1.一种Tum-5融合蛋白，其特征在于，依照GenBank中公布的人Tum-5基因序列，将编码Tum-5氨基酸的密码子替换为大肠杆菌惯用的密码子，并在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到Tum-5融合蛋白。
2.一种肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与重组人Tum-5融合蛋白，其特征在于，选择肿瘤新生血管特异性结合多肽CNGRCVSGCAGRC和人Tum-5基因，构建肿瘤新生血管特异性结合多肽CNGRCVSGCAGRC和人Tum-5基因的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到Tum-5-NGR融合蛋白。
3.一种肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与重组人Tum-5融合蛋白的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备1)Tum-5和Tum-5-NGR的His融合基因原核表达载体的构建①依照GenBank中公布的人Tum-5基因序列，将编码Tum-5氨基酸的密码子替换为大肠杆菌惯用的密码子，上游引入SphI酶切位点，下游引入HindIII酶切位点，并将目的基因克隆入载体pMD-18T中，命名为pMD-18T-Tum-5；将pMD-18T-Tum-5用SphI和HindIII双酶切后，回收小片段；将质粒pQE-30用SphI和BamH1双酶切后，回收大片段；以上两个片段用T4连接酶进行连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，应用蓝白斑筛选方法，挑取白色克隆，培养过夜，经酶切鉴定，证实获得插入片段大小正确的表达载体，经DNA序列测定证实其序列，并将测序正确的质粒命名为pQE-30-Tum-5；②依照GenBank中公布的人Tum-5基因序列，将编码Tum-5氨基酸的密码子替换为大肠杆菌惯用的密码子；同时设计编码NGR多肽的寡核苷酸序列，并将该序列连于Tum-5基因的3’端，两者之间加入BamHI的酶切位点ggatcc，进行全基因合成，并在上游引入SphI酶切位点，下游引入HindIII酶切位点，然后将目的基因克隆入载体pMD-18T中，命名为pMD-18T-Tum-5-NGR；将pMD-18T-Tum-5-NGR用SphI和HindIII双酶切后，回收小片段；将质粒pQE-30用SphI和HindIII双酶切后，回收大片段；以上两个片段用T4连接酶进行连接，连接产物转化感受态DH5α细胞，应用蓝白斑筛选方法，挑取白色克隆，培养过夜，经酶切鉴定，证实获得插入片段大小正确的表达载体，经DNA序列测定证实其序列；并将测序正确的质粒命名为pQE-30-Tum-5-NGR；2)重组蛋白的诱导表达将pQE-30-Tum-5和pQE-30-Tum-5-NGR转化感受态细胞DH5α，随机挑选单克隆菌，于LB中37℃活化振摇培养过夜，次日晨以1∶100比例接种LB培养基，其中LB培养基含Amp 100μg/ml，37℃继续培养至0D650nm＝0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养4小时，3000rpm离心15min收集菌体，行SDS-PAGE及Western Blot，对SDS-PAGE结果进行用薄层扫描以测定目的蛋白的表达量；3)重组蛋白的纯化按1克菌体加10ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌；12000rpm，离心15min，弃上清，1克沉淀加10ml A液，其配方为8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris；PH 8.0，4℃搅拌1h，12000rpm，离心15min，收集上清，将其上于用A液充分平衡的Ni柱，然后先用含25mmol咪唑的A液洗脱杂蛋白，再用含250mmol咪唑的A液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，部分纯化产物透析至B液中复性，B液为2.5M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris组成，PH值为8.0，调整复性蛋白的终浓度为1mg/ml，部分纯化产物透析至纯水中，即可得到肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与重组人Tum-5融合蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DH5α细胞含有编码肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与重组人Tum-5融合蛋白的基因的原核表达载体pQE-TN。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述原核表达载体pQE-TN中含有编码肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与重组人Tum-5融合蛋白的基因，该载体经37℃振荡培养过夜、活化后，经0.1mMIPTG诱导，可高效表达肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与重组人Tum-5融合蛋白。
全文摘要
本发明公开了肿瘤新生血管特异性结合多肽与人Tum－5的融合蛋白及制备方法，肿瘤新生血管特异性结合多肽－CNGRCVSGCAGRC－分别能与肿瘤新生血管内皮细胞表面高效表达的氨肽酶N(CD13)结合。本发明采用分步克隆，构建肿瘤新生血管特异性结合多肽与Tum－5的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。通过多肽与其新生血管处的受体结合，使Tum－5在肿瘤组织的新生血管处富集，发挥抗肿瘤和抑制肿瘤血管形成的作用。同时，本发明还公开了人Tum－5的制备方法，Tum－5是由Tumstatin接近N端的54－132位氨基酸组成的，它是Tumstatin抗血管形成的功能结构域。采用采用GenBank中公布的人Tum－5基因序列，将编码Tum－5氨基酸的密码子替换为大肠杆菌惯用的密码子，并在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到Tum－5融合蛋白。
文档编号C12N15/09GK1800218SQ200510096389
公开日2006年7月12日 申请日期2005年11月21日 优先权日2005年11月21日
发明者孟洁如, 马楠, 颜真, 张英起 申请人:中国人民解放军第四军医大学