专利名称：荷叶离褶伞食用菌菌种的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种彷野生食用菌。
背景技术：
荷叶离褶伞{Lyophyllum decastes(Fr.Fr.)sing.}是一种十分珍贵的野生食用菌，它口感脆滑、味道鲜美、营养丰富、以鲜食为主但干制后营养和口感不变，市场前景广阔。近年来，由于过度的采摘，野生的荷叶离褶伞已经非常稀少。为了挽救这种频临灭绝的野生食用菌，对该菌进行驯化栽培研究是摆在科技工作者面前的一项重大课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种荷叶离褶伞食用菌菌种，并对其进行了生理、生化特性测定，进行了碳源、氮源及碳氮比对荷叶离褶伞菌丝生长、子实体分化与发育的影响的测定。
本发明的目的是通过以下措施来达到荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)食用菌菌种，它采集于祁连山野生荷叶离褶伞，通过组织分离或孢子分离，在培养基上培养而获得。
其形态特征荷叶离褶伞在PDA可以生长，菌落圆形、致密、白色、边缘整齐；子实体灰白色，幼时菌盖半球形，成熟后平展，中央略下凹，表面光滑无黏液无鳞片，菌盖边缘光滑幼时内卷；菌褶与菌肉同为白色，菌褶直生不等长，孢子无色、球形、光滑；菌柄柱形、中实、光滑白色；其生理、生化特征荷叶离褶伞菌丝生长的温度范围是5-35℃，最适温度25℃；子实体分化的温度范围13-22℃，最适温度19℃；0-3℃的温差有利于子实体的分化，温差大于9℃子实体不能形成；孢子萌发的温度范围是10-25℃，最适温度20℃；菌丝能在pH4-11范围内生长，最适pH4-5；菌丝和孢子的致死温度分别是45℃30min和50℃15min。
碳源、氮源的利用及碳氮比对荷叶离褶伞菌丝生长、子实体分化与发育的影响能利用淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、玉米粉、乳糖和甘露糖作碳源，但蔗糖和葡萄糖为碳源生长势强，果糖生长势弱；甘氨酸、蛋白胨、硫酸铵、黄豆粉、硝酸铵、谷氨酸和麦麸均可作为氮源，在麦麸上生长速度快，长势旺盛；硫酸铵、硝酸铵和谷氨酸虽能作为氮源，但长势很弱；能在C/N15/1-50/1的范围内生长，C/N为50/1时生长速度最快。在完全黑暗的条件下不能形成子实体，连续光照和12h光暗交替两种处理都可形成子实体，且两种处理间差异不显著。
该菌种已2005年10月31日于保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号CGMCC No1518，本发明的优点和产生的有益效果是菌丝
图1是温度对荷叶离褶伞菌丝生长和孢子萌发的影响图2是温度对荷叶离褶伞子实体分化的影响图3是温差对荷叶离褶伞子实体分化的影响图4pH值对荷叶离褶伞菌丝生长和孢子萌发的影响具体实施方式
实验例1温度对荷叶离褶伞菌丝生长和孢子萌发的影响按李彩萍等(2004白雷蘑菌丝生物学特性的初步研究.食用菌学报，11(3)24-29.)和杨新美(1988中国食用菌栽培学.北京农业出版社.1-584)的方法进行。
先将荷叶离褶伞菌种用PDA平板在22℃条件下连续培养20d，使其形成可供试验的菌落，用无菌的打孔器取直径5mm的菌落块，置于PDA平板的中央，每四皿一组，分别置于0、5、10、15、20、25、30、35、40℃的恒温培养箱中，连续培养15d，用十字交叉法测量菌落直径，并观察菌落形态，菌丝长势和菌丝生长速度，菌丝生长速度用(mm/d)表示，菌丝长势浓密健壮用“+++”表示，生长较浓密用“++”表示，生长稀疏用“+”表示，不生长用“-”表示。
孢子萌发试验选取成熟度达到90％的子实体，剥下菌褶，投入10ml无菌水管中，每管投菌褶10片，振荡摇匀制成孢子悬液。然后将孢子悬液滴加在载玻片上，置于0、5、10、15、20、25、30、35℃下保湿、黑暗培养24h，在显微镜下观察记载孢子萌发数，计算孢子萌发率。孢子萌发率＝已萌发孢子数/已查孢子总数×100％实验结果(图1)表明，荷叶离褶伞菌丝体在0℃和35℃下不能生长，菌丝可以生长的温度范围是5-35℃，最适温度25℃；孢子萌发的温度范围是10-25℃，最适温度20℃。
实验例2温度与温差刺激对荷叶离褶伞子实体分化与发育的影响在150ml三角瓶中加入30ml PDA培养基，121℃40min灭菌，冷凝之后每瓶接入直径5mm的菌落一块，在22℃、黑暗条件下培养30d，当菌落长满三角瓶后，分五瓶一组，分别给予0、3、6、9、12℃的温差刺激，每天持续10h连续刺激6d，结束刺激后把经过不同温差刺激的菌丝体置于相同的条件(温度20℃、空气相对湿度80％、弱光照)下培养15d，观察记载子实体分化数量，即菇蕾数，求出不同温差处理下的平均菇蕾数。另将35瓶长满菌丝的三角瓶分为7组，每组5瓶，分别置于10、13、16、19、22、25、28℃等7个不同温度但散射光照和空气相对湿度完全相同的条件下，培养15d观察记载不同温度下的菇蕾数量。
实验结果(图2)表明荷叶离褶伞子实体分化的温度范围13-25℃，最适温度19℃，在10℃以下25℃以上不能形成子实体。说明该菌子实体分化需要较低的温度，应属于低温型菌类实验结果(图3)表明，0-3℃的温差有利于荷叶离褶伞子实体的分化，温差大于9℃子实体不能形成。说明荷叶离褶伞具有恒温结实的特点。
实验例3pH对菌丝生长和孢子萌发的影响用10％NaoH和10％HCL将PDA培养基的pH值调节为4、5、6、7、8、9、10、11、12共9种。倒在90mm的培养皿中，制成固体平板，用无菌打孔器取直径5mm的菌落一块，放在PDA平板中央。同一pH值作4次重复，置于22℃恒温箱中连续培养15d。用十字交叉法测定菌落直径，观察记载菌丝生长势和菌丝生长速度。
在pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的无菌水管中，投入成熟度90％的菌褶5片，振荡摇匀制作成孢子悬液，之后将孢子悬液滴加在载玻片上，置于20℃恒温培养箱中培养24h，观察记载孢子萌发率。
实验结果(图4)表明，在pH4-11范围内荷叶离褶伞菌丝能够生长、孢子能够萌发，菌丝生长的最适pH4-5，孢子萌发的最适pH4-6。由于琼脂在pH＜4的环境中不能凝固，本实验未测得菌丝在pH4以下培养基上的生长状况。
实验例4碳源对荷叶离褶伞菌丝生长的影响供试碳源可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露糖、果糖。
测定碳源的基本培养基(NH4)2SO43g，NaCl 1g，KH2PO42g、琼脂20g、水1000ml。装入250ml三角瓶中，每瓶装入150ml。121℃ 40min灭菌后，分别加入1g碳素的不同碳源(依碳源分子量换算成碳源的量分别加入)，再经1.0kg/cm210min灭菌后倒平板。在每一平板的中央接入直径5mm的菌落一块，每一碳源设四皿重复，置于22℃恒温培养箱中，连续培养10d、测菌落直径。
表1碳源对荷叶离褶伞菌丝生长的影响
注表中数字为3次重复的平均数；表中不同英文字母，大写表示1％显著水平，小写表示5％显著水平。下表同。
从表1看出，荷叶离褶伞在供试的7种碳源上都可生长，但在以乳糖为碳源的培养基上的生长量显著小于分别以甘露糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、玉米粉等6种碳源上的生长量，且菌丝稀疏，生长势明显较弱；乳糖之外的6种碳源之间生长量差异不显著；菌丝在果糖上生长势最弱；而在蔗糖和葡萄糖上菌丝浓密健壮，生长势旺盛。
实验例5氮源对荷叶离褶伞菌丝生长的影响供试氮源硝酸铵、硫酸铵、黄豆粉、麸皮、甘氨酸、蛋白胨、谷氨酸。
测定氮源利用的基本培养基是酵母膏1g、KH2PO42g、琼脂20g、水1000ml。其它做法同碳源测定。
表2氮源对荷叶离褶伞菌丝生长的影响
实验结果(表2)表明，在参试的7种氮源中，荷叶离褶伞的菌丝在麦麸为氮源的培养基上生长速度最快，菌丝浓密，长势最旺盛，与其他6种氮源之间存在极显著差异；甘氨酸与蛋白胨之间差异不显著，但与硫酸铵、黄豆粉、硝酸铵、谷氨酸之间差异显著；硝酸铵与谷氨酸之间差异不显著；菌丝在硫酸铵、硝酸铵、谷氨酸为氮源时虽能生长，但长势很弱。
实验例6碳氮比对荷叶离褶伞菌丝生长的影响按杨新美(1988白雷蘑菌丝生物学特性的初步研究.食用菌学报，11(3)24-29.)，常明昌(2003.12.食用菌栽培学.北京中国农业出版社.1-173和陈士瑜(1998.食用菌生产大全.北京中国农业出版社.)的方法进行测定。
以葡萄糖为碳源以谷氨酸作为氮源，以KH2PO42g、酵母膏2g、琼脂20g、水1000ml作基础培养基，配制成碳氮比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1、55∶1、60∶1共13种配方，121℃30min灭菌后倒平板。在平板中央接入直径5mm的菌落一块。同一碳氮比处理设四皿重复，置于22℃恒温培养箱中连续培养10d，测量菌落直径观察菌丝生长势。同时将不同碳氮比的培养基分别加入150ml的三角瓶中，每瓶30ml。接菌后在20℃及黑暗条件下培养，菌丝长满三角瓶后，把温度控制在18℃，同时给予散射光刺激，15d、20d观察记载子实体分化数量。
表3碳氮比对荷叶离褶伞菌丝生长的影响
实验结果(表3)表明，荷叶离褶伞能够在C/N15/1-50/1的范围内生长，最适C/N为50/1，菌丝生长速度快，菌丝浓密健壮，长势旺盛。C/N＞50/1的生长状况还需进一步研究。
实验例7不同光照对荷叶离褶伞子实体分化与发育的影响在150ml三角瓶中加入30mlPDA培养基制成平板，用无菌打孔器取直径5mm的菌落一块接入三角瓶中央，置于恒温、22℃及黑暗的条件下培养30d。当菌丝完全长满平板后，取4瓶一组，分别置于完全黑暗、12h光(3000lx日光灯)暗交替、连续光照(3000lx日光灯)条件下连续培养15d，观察记载现蕾数目(原基数量)，求出不同光照条件下的平均数。
表4不同光照对荷叶离褶伞子实体分化的影响
实验结果(表4)说明，在完全黑暗的条件下荷叶离褶伞不能形成子实体，在连续光照和12h光暗交替条件下荷叶离褶伞都可形成子实体，且两种处理间差异不显著。说明该菌子实体分化需要光照刺激。
实验例8荷叶离褶伞菌丝与孢子致死温度测定用无菌的打孔器取直径5mm在PDA培养基上生长形成的菌落75块，平均分装在25支10ml无菌水管中。另取25支10ml无菌水管，每管中加入5片菌褶搅动，振荡制成孢子悬液。然后将孢子悬液和含有菌落块的试管置于30、35、40、45、50℃恒温水浴锅中分别处理5、10、15、20、30min，迅速冷却，将孢子悬液分别均匀涂布于PDA平板上。将菌落块接入菌的PDA培养基上，连续培养10d，观察菌丝和孢子生长情况，生长浓密用“++”表示，生长稀疏用“+”表示，不生长用“-”表示。
表5荷叶离褶伞致死温度测定
从表5数据看出，荷叶离褶伞菌丝的致死温度是45℃30min，孢子的致死温度是50℃15min。
权利要求
1.荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)食用菌菌种，该菌种已于2005年10月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号CGMCC No1518，它是采集祁连山野生荷叶离褶伞，通过组织分离或孢子分离，在培养基上培养而获得，其特征在于(a)形态特征荷叶离褶伞在PDA培养培养基上可以生长，菌落圆形、致密、白色、边缘整齐；子实体灰白色，幼时菌盖半球形，成熟后平展，中央略下凹，表面光滑无黏液无鳞片，菌盖边缘光滑幼时内卷；菌褶与菌肉同为白色，菌褶直生不等长，孢子无色、球形、光滑；菌柄柱形、中实、光滑白色；(b)生理、生化特征荷叶离褶伞菌丝生长的温度范围是5-35℃，最适温度25℃；子实体分化的温度范围13-22℃，最适温度19℃；0-3℃的温差有利于子实体的分化，温差大于9℃子实体不能形成；孢子萌发的温度范围是10-25℃，最适温度20℃；菌丝能在pH4-11范围内生长，最适pH4-5；菌丝和孢子的致死温度分别是45℃30min和50℃15min。(c)碳源、氮源的利用及碳氮比对荷叶离褶伞菌丝生长、子实体分化与发育的影响能利用淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、玉米粉、乳糖和甘露糖作碳源，但蔗糖和葡萄糖为碳源生长势强，果糖生长势弱；甘氨酸、蛋白胨、硫酸铵、黄豆粉、硝酸铵、谷氨酸和麦麸均可作为氮源，在麦麸上生长速度快，长势旺盛；硫酸铵、硝酸铵和谷氨酸虽能作为氮源，但长势很弱；能在C/N15/1-50/1的范围内生长，C/N为50/1时生长速度最快。在完全黑暗的条件下不能形成子实体，连续光照和12h光暗交替两种处理都可形成子实体，且两种处理间差异不显著。
全文摘要
荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)食用菌菌种，它采集于祁连山野生荷叶离褶伞，通过组织分离或孢子分离，在培养基上培养而获得。荷叶离褶伞在PDA培养基上可以生长，形态特征是菌落圆形、致密、白色、边缘整齐；子实体灰白色，幼时菌盖半球形，成熟后平展，中央略下凹，表面光滑无黏液无鳞片，菌盖边缘光滑幼时内卷；菌褶与菌肉同为白色，菌褶直生不等长，孢子无色、球形、光滑；菌柄柱形、中实、光滑白色；荷叶离褶伞菌丝生长的温度范围是5－35℃，最适温度25℃；子实体分化的温度范围13－22℃，最适温度19℃；0－3℃的温差有利于子实体的分化，温差大于9℃子实体不能形成；孢子萌发的温度范围是10－25℃，最适温度20℃；菌丝能在pH4－11范围内生长，最适pH4－5；菌丝和孢子的致死温度分别是45℃30min和50℃15min。
文档编号C12N1/14GK1923997SQ20051009640
公开日2007年3月7日 申请日期2005年11月17日 优先权日2005年11月17日
发明者魏生龙 申请人:魏生龙