一种制作灵长类动物干性年龄相关性黄斑变性疾病模型的方法
【专利摘要】本发明公开了一种在灵长类动物上制作干性年龄相关性黄斑变性疾病模型方法，将碘酸钠以颈动脉注射的方式施于灵长类动物。本发明的操作方法简单易行，造模成功率高，可重复性好，模型稳定；所需碘酸钠药物量少，避免了大剂量碘酸钠对动物的全身损伤，动物长期存活，为后续试验提供可能；可根据需要做任何一侧或双侧模型；做一侧造模时对对侧眼没任何损伤，保证了动物的正常生活视力；可在一只动物上做双侧眼的自身对照，提供了试验的可信度，减少了试验动物的需要量；本发明为干性年龄相关性黄斑变性研究提供了一个良好的工具，对这一疾病的病理生理学研究及治疗研究都具有重要意义。
【专利说明】一种制作灵长类动物干性年龄相关性黄斑变性疾病模型的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗【技术领域】，具体的说是一种制作灵长类动物干性年龄相关性黄斑变性疾病模型的方法。
【背景技术】
[0002]干性年龄相关性黄斑变性(age-relatedmacular degeneration, AMD)是发生于中老年人中的常见致盲性眼病之一。研究表明视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelium, RPE)的正常功能对感光细胞的数量和功能具有至关重要的意义，在AMD发生过程中，黄斑区视网膜色素上皮损害是疾病的原发病变，而感光细胞的丢失是继发的。随着年龄增长，AMD发病率逐渐上升，所以其危害正随着我国人口的老龄化而增加。干性老年性黄斑变性当今仍然无明确有效的治疗手段，其发病机理和治疗方法成为研究热点，但因为没有理想的动物疾病模型，极大的阻碍了其研究进展。
[0003]碘酸钠是一种抗代谢药，能够破坏视网膜色素上皮糖代谢有关的酶的活性，因而可以选择性破坏视网膜色素上皮。通过静脉注射碘酸钠，在兔中可以制作出干性年龄相关性黄斑变性模型。灵长类动物与人类结构和功能最为相似，灵长类的疾病模型对人类疾病的研究极为重要，但在灵长类动物中，相应剂量的碘酸钠静脉注射并不能取得满意的干性年龄相关性黄斑变性模型，增加剂量则增加药物的全身毒性，动物甚至因药物全身毒性而死亡。文献《年龄相关性黄斑变性(AMD)实验模型的研究进展》(江伟，邱春亿，《国际眼科杂志》2007年第3期)以及文献《 碘酸钠诱导非渗出型年龄相关性黄斑变性模型的研究》(江伟，张婉玉，邱春亿，《国际眼科杂志》2008年第8期)公开了采用舌下静脉注射的方式将剂量为30-40mg/kg碘酸钠用于非渗出型年龄相关性黄斑变性的体内造模。由于静脉注射碘酸钠造模的方法，药物先经静脉回流到心脏，后再经心脏泵出通过主动脉，颈动脉，眼动脉进入视网膜脉络膜循环，药物经过全身循环使到达眼部的药物浓度已经大幅度降低，而药物对色素上皮的作用是浓度依赖性的，为了达到破坏色素上皮的目的，要加大给药剂量，但这样会相应增加药物的全身毒性，导致动物血尿，肾衰甚至死亡，而相应的视网膜色素上皮的病变并不明显。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术不足，提供了一种满意的灵长类动物干性年龄相关性黄斑变性的疾病模型。通过经颈动脉给药，药物经颈动脉到眼动脉，进入视网膜脉络膜循环，药物没有经过全身循环的稀释，到达眼部的药物浓度高，从而使用少量的药物而达到相应目的；可进一步通过控制颈动脉的阻断时间，还可以控制药物在眼部停留的时间，延长药物对色素上皮的作用，可调控视网膜色素上皮损伤的范围和程度。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案解决的:
一种制作灵长类动物干性年龄相关性黄斑变性疾病模型的方法，将碘酸钠以颈动脉注射的方式施于灵长类动物，上述碘酸钠的剂量为15mg/kg。
[0006] 申请人:发现，在本发明所述灵长类动物干性年龄相关性黄斑变性疾病模型的制作过程中，模型效果以及病变的程度不仅与碘酸钠的剂量有直接关系，还与碘酸钠药物浓度以及推注速度有关，优选碘酸钠的浓度为10mg/ml，推注速度为0.lml/s。
[0007]上述方法中，颈动脉注射可采用颈动脉穿刺的方式给药。在进行注射时，一般采用平卧位，将动物颈部垫高，头向后仰，尽量暴露颈部，头偏向于穿刺部位的对侧，进行常规的皮肤消毒后，用左手食指或食指、中指固定其搏动明显处的血管，右手食指和拇指固定准针柄部位，进针点为甲状软骨下缘以下，进针时要注意进针方向，其垂直角度以与颈动脉垂直方向为准，刺入后，有搏动性鲜血喷入针管内，即可注入药物。药物注射完毕压迫止血，可通过进一步按压阻断颈总动脉一定时间，从而进一步延长碘酸钠在眼部聚集的时间，优选阻断时间为I分钟。
[0008]或者，可以采用暴露颈动脉的方式进行注射:1)将动物麻醉，固定,暴露颈部,去毛，消毒；2)喉部正中线皮肤切口，暴露颈总动脉；3)阻断颈外动脉和颈总动脉血流；4)将碘酸钠经颈总动脉注入，继续保持颈总动脉血流阻断一定时间，优选I分钟。5)拔针后压迫止血，缝合切口。
[0009]本发明相比现有技术有如下优点:
1)造模成功率高，可重复性好，模型稳定；
2)所需碘酸钠药物量少，避免了大剂量碘酸钠对动物的全身损伤，动物长期存活，为后续试验提供可能；
3)可根据需要做任何一侧或双侧模型；
4)做一侧造模时对对侧眼没任何损伤，动物有正常生活视力，保证了动物福利；
5)可在一只动物上做双侧眼的自身对照，提供了试验的可信度，减少了试验动物的需要量。
[0010]本发明为干性年龄相关性黄斑变性提供了一个良好的工具，对这一疾病的病理生理学研究及治疗研究都具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为食蟹猴15mg/kg组碘酸钠造模后六周双眼暗适应3.0视网膜电图(视杆细胞视锥细胞最大混合反应，反应了视杆和视锥细胞的功能，左眼为造模眼)。
[0012]图2为食蟹猴15mg/kg组碘酸钠造模后六周双眼明适应3.0视网膜电图(视锥细胞反应，反应了黄斑区视锥细胞的功能，左眼为造模眼)。
[0013]图3为食蟹猴不同剂量碘酸钠造模前后双眼暗适应3.0视网膜电图(视杆细胞视锥细胞最大混合反应)a波振幅变化曲线图。
`[0014]图4为食蟹猴不同剂量碘酸钠造模前后双眼明适应3.0视网膜电图(视杆细胞反应)a波振幅变化曲线图。
[0015]图5为食蟹猴15mg/kg碘酸钠造模后六周双眼眼底照片，左眼为造模眼。
[0016]图6为食蟹猴15mg/kg碘酸钠造模后六周双眼自发荧光照片，左眼为造模眼。
[0017]图7为食蟹猴15mg/kg碘酸钠造模后六周双眼OCT结果，左眼为造模眼。【具体实施方式】
[0018]以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
[0019]在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0020]下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0021 ] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0022]实施例1颈动脉注射碘酸钠建立食蟹猴干性年龄相关性黄斑变性模型。
[0023]目的:通过颈动脉注射碘酸钠建立食蟹猴干性年龄相关性黄斑变性模型，筛选出造模的合适剂量。
[0024]实验材料:主要试剂:
麻醉药品:50mg/ml盐酸氯胺酮,3%戍巴比妥钠 消毒药品:5.0g/L聚维酮碘
造模药品:碘 酸钠(Sigma公司，批号:S4007)，在暗室环境下，用0.9%灭菌生理盐水将碘酸钠粉末融至10mg/ml的浓度，并用0.22 μ m滤片过滤。
[0025]眼底荧光造影剂:荧光素钠注射液(立摄得)500毫克/5毫升/支 主要仪器:
YZ5F裂隙灯显微镜(杭州六六)
Espion视觉电生理仪(美国Diagnosys公司)
SPECTRALIS OCT仪(德国海德堡公司)
海德堡荧光造影机，眼底照相机 实验动物:
动物饲养与管理按照SOP执行，同时遵循实验动物饲养和使用指南第8版(Instituteof Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National ResearchCouncil; National Academy Press, Washington, D.C., 2010)和美国农业部(USDA)动物福利管理条例(Public Law99-198)0实验动物的使用获得了江苏省科技厅的批准，实验动物使用许可证号=SYXK (苏)2011-0029。
[0026]食蟹猴为动物实验用常规动物，生理特点与人相似，饲养方便，便于试验操作。
[0027]从储备动物中挑选一般体检、血生化及眼科系统性检查正常的食蟹猴6只，给药开始时2-5岁，体重2-5kg。动物项圈上标记动物ID号，同时标记实验动物号作为动物的标识。记录ID号与动物号的对应关系。
[0028]碘酸钠注射造模后一周内采取单笼饲养，其余时间采取群养笼饲养方式。动物房设定温度为18~26°C，湿度为40~70%，光照12小时明暗交替。
[0029]1.实验方法:
6只食蟹猴，分为10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg三组,每组各两只，分别对各组食蟹猴左侧颈总动脉注射进行相应剂量的碘酸钠给药，以左眼造模，自体右眼为未造模对照，给药后每周对各剂量组进行眼视网膜电图(ElectiOretinogram，ERG)、眼底照相、眼底自发荧光、OCT检查。
[0030]上述方法中，动脉注射采用颈动脉穿刺的方式给药:在进行注射时，采用平卧位，将动物颈部垫高，头向后仰，尽量暴露颈部，头偏向于穿刺部位的对侧，进行常规的皮肤消毒后，用左手食指或食指、中指固定其搏动明显处的血管，右手食指和拇指固定准针柄部位，进针点为甲状软骨下缘以下，进针时要注意进针方向，其垂直角度以与颈动脉垂直方向为准，刺入后，有搏动性鲜血喷入针管内，即可注入药物(注射速度为0.lml/s)。药物注射完毕压迫止血，按压阻断颈总动脉I分钟，从而进一步延长碘酸钠在眼部聚集的时间。
[0031]或者也可选用暴露颈动脉的方式进行注射:1)将动物用氯胺酮(0.2ml/kg)肌注，并戊巴比妥钠(20mg/kg)后肢静脉注射麻醉，仰面固定在手术台上，暴露颈部，去毛，局部用碘伏溶液消毒；2)喉部正中线皮肤切口，暴露颈总动脉；3)阻断颈外动脉和颈总动脉血流；4)将碘酸钠经颈总动脉分叉处注入(注射速度为0.lml/s)，继续保持颈总动脉血流阻断I分钟；5)拔针后压迫止血，缝合切口。
[0032]上述两种方法均可制得食蟹猴干性年龄相关性黄斑变性模型，无明显差异。
[0033]实验结果:
(I)眼视网膜电图(Electroretinogram, ERG)检查结果
ERG检查结果见图1-4，图1为食蟹猴15mg/kg组碘酸钠造模后六周双眼暗适应
3.0ERG，左眼为造模眼，右眼为自体未造模对照眼(图a和图b为暗适应3.0ERG,图c和图d为暗适应3.0震荡电位ERG，其中图a和图c为右眼，图b和图d为左眼)，结果显示左眼a波振幅较右侧稍下降；图2为食蟹猴15mg/kg组碘酸钠造模后六周双眼明适应3.0ERG，左眼为造模眼，右眼为自体未造模对照眼(左图为右眼，右图为左眼)，结果显示左眼a波振幅约为右侧的三分之一；图3为食蟹猴不同剂量碘酸钠造模前后双眼暗适应3.0ERG a波振幅变化曲线图；图4为食蟹猴不同剂量碘酸钠造模前后双眼明适应3.0ERG a波振幅变化曲线图。结果显示各剂量组，暗适应3.0，震荡电位，明适应3.0ERG其a波振幅都有所下降，在造模后6周内都缓慢回升，但程度明`显不同。
[0034]暗适应3.0ERG是视杆视锥细胞的最大混合反应，反应了视杆和视锥细胞的功能；本组实验中，10mg/kg组暗适应3.0ERG a波振幅6周时基本恢复至造模前水平，15mg/kg组恢复至造模前三分之二强水平，20mg/kg组恢复至造模前五分之一水平，说明10mg/kg组对视杆视锥细胞损伤较小，15mg/kg组有所损伤,而20mg/kg对其损伤较大(见图3)。明适应
3.0ERG是视锥细胞反应，反应了视锥细胞的功能，本组实验中，10mg/kg组a波振幅基本恢复至造模前水平，15mg/kg和20mg/kg组恢复至术前三分之一水平(见图4),说明15mg/kg和20mg/kg组动物视锥细胞功能都有明显下降。结合暗适应3.0ERG和明适应3.0ERG的结果，我们可以看出15mg/kg组主要损伤黄斑区视锥细胞功能，而20mg/kg组损伤的不仅仅是视锥细胞的功能，连视杆细胞的功能也受到明显损伤。
[0035](2)眼底照相检查结果
食蟹猴15mg/kg碘酸钠造模后六周双眼眼底照相检查结果如图5所示，左眼为15mg/kg碘酸钠造模组，自体右眼为未造模对照组。结果显示左眼黄斑区视网膜色素上皮萎缩，斑驳状萎缩，透见后方脉络膜血管，周边未见明显改变。20mg/kg组整个后极部色素上皮萎缩。
[0036](3)自发突光
食蟹猴15mg/kg碘酸钠造模后六周双眼自发突光结果如图6所示,左眼为15mg/kg碘酸钠造模组，自体右眼为未造模对照组。结果显示与对照相比，15mg/kg组左眼黄斑区失去均匀一致的自发突光而表现出斑驳状高突光伴局部低突光，黄斑外突光均匀，说明黄斑区色素上皮的损伤及功能下降。
[0037](4) OCT检查结果
食蟹猴15mg/kg碘酸钠造模后六周双眼OCT检查结果如图7所示,左眼为15mg/kg碘酸钠造模组，自体右眼为未造模对照组。结果显示15mg/kg组，造模前视网膜脉络膜各层结构正常，造模后黄斑区色素上皮层萎缩，视网膜外层结构紊乱，IS/0S层不可见。
[0038]讨论:ERG结果显示10-20mg/kg的碘酸钠颈动脉注射可以导致视网膜色素上皮的损伤，其中20mg/kg组暗适应3.0和明适应3.0振幅明显下降,六周后维持在较低水平,表明视杆和视锥细胞功能皆下降，损伤的是整个后极部视网膜，不符合干性老年性黄斑变性主要损伤黄斑区视锥细胞的特点；而15mg/kg组虽然暗适应3.0ERG在造模后振幅缓慢上升，但明适应3.0ERG上升不明显，说明视杆细胞功能损伤较轻而视锥细胞功能损伤严重，造成的视网膜损伤局限于黄斑区，符合年龄性相关黄斑变性的改变的特点。眼底照片显示15mg/kg组黄斑区视网膜色素上皮的损伤局限与后极部黄斑区视网膜，接近干性年龄相关性黄斑变性的临床改变；自发荧光及OCT在活体上显示了黄斑区色素上皮和视网膜外层萎缩，与年龄相关性黄斑变性改变相似。可见碘酸钠颈动脉注射可以导致视网膜色素上皮的病变，其中15mg/kg的碘酸钠注射造成的黄斑区视网膜色素上皮损伤适中，与人年龄相关性黄斑变性 的病理改变相似，对动物全身没有明显损伤，是一个合适的造模剂量。
【权利要求】
1.一种制作灵长类动物干性年龄相关性黄斑变性疾病模型的方法，其特征在于将碘酸钠以颈动脉注射的方式施于灵长类动物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于碘酸钠的剂量为15mg/kg。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于碘酸钠的浓度为10mg/ml，推注速度为0.1ml/So
【文档编号】A61K33/18GK103720524SQ201410012503
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】袁松涛, 计江东, 刘庆淮 申请人:南京医科大学第一附属医院