同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种同种异体组织工程骨移植物，它包括：生物可降解材料及骨髓间充质干细胞，所述的骨髓间充质干细胞为体外培养的同种异体骨髓间充质干细胞。本发明由同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨可修复骨缺损，其效果与传统的由自体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨无明显差异。本发明还提供了该组织工程骨的制备方法和用途。
【专利说明】同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织工程领域，特别涉及一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨及其应用。
【背景技术】
[0002]因创伤、感染、肿瘤、先天性畸形等原因造成的骨缺损临床常见，目前的治疗方法主要包括自体骨移植、异体骨移植、人工骨替代品填充等，但都存在一些不足之处，如自体骨移植存在着供骨区损伤、来源及数量有限等问题；异体骨移植其骨愈合过程缓慢且多存在不同程度的排斥反应，同时还存在较高的传染性疾病传播的可能；人工骨替代品由于缺乏骨诱导能力而骨缺损修复能力欠佳。而组织工程骨技术没有供骨区损伤，不受形状、来源及数量限制，是真正意义上的活骨移植，骨愈合速度快且免疫反应低，同时还可以按临床需要预制不同形状，为骨缺损这一临床医学难题的解决开辟了新的途径。目前自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)是组织工程骨构建过程中理想的种子细胞，然而自体骨髓中骨髓间充质干细胞的数量随着年龄的增长而逐渐减少；临床上骨缺损患者又大都处于不同的疾病状态，以及射线、药物等治疗措施的应用，可能会不同程度的影响骨髓间充质干细胞的增殖能力和多向分化潜能；患者自体骨髓间充质干细胞经历体外分离培养和组织工程骨构建等过程，也可能会延误疾病的最佳治疗时间，从而限制了组织工程骨的临床应用。近年来研究发现，同种异体骨髓间充质干细胞具有低免疫原性特性，而且在体内具有免疫调节功能，使得同种异体骨髓间充质干细胞能够成为骨组织工程的种子细胞，解决自体骨髓间充质干细胞在临床应用过程中存在的问题，有望成为将来组织工程领域发展的趋势，具有广阔的发展前景和临床应用价值。
【发明内容】
[0003]针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，构建一种由同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨，本发明的另一目的就是提供该组织工程骨修复哺乳类动物的骨缺损的用法。
[0004]本发明的一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨，包括生物可降解材料和同种异体骨髓间充质干细胞。
[0005]所述同种异体骨髓间充质干细胞来源于同种异体健康青壮年人或动物骨髓血，其来源部位没有特殊限制，可取自髂骨、胸骨等部位。
[0006]所述同种异体骨髓间充质干细胞为体外培养原代至第6代的成体骨髓间充质干细胞。这一阶段骨髓间充质干细胞具有较强的增殖能力和分化能力。
[0007]所述同种异体骨髓间充质干细胞为液态细胞混悬物，细胞含量为I X IO6个/ml~IX IO8个/ml。优选浓度为20X IO6个/ml，接种体积没有特别限制，根据所采用的不同类别可降解材料及其体积而不同，以该固体材料能够吸附细胞混悬液的饱和体积为准。
[0008]所述同种异体骨髓间充质干细胞向成脂、成骨、成软骨方向诱导。经全血培养法或密度梯度离心法获得的供体骨髓间充质干细胞经成脂、成骨、成软骨诱导鉴定，其中成骨诱导后表达I型胶原、OCN (骨钙素)、ALP (碱性磷酸酶)。
[0009]所述的生物可降解材料包括天然无机材料、天然有机材料、天然骨衍生材料、人工合成无机材料、人工合成有机材料。
[0010]所述天然无机材料包括珊瑚、珊瑚羟基磷灰石、煅烧骨；天然有机材料包括胶原、壳聚糖；天然骨衍生材料包括冻干骨、脱钙骨、脱蛋白骨、脱细胞骨、冷冻干燥骨、深低温骨、冷冻脱钙骨；人工合成无机材料包括羟基磷灰石、β-磷酸三钙、生物活性玻璃陶瓷、纳米生物陶瓷；人工合成有机材料包括人工珊瑚、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙酸内酯。
[0011]优选的医学上可接受的生物可降解材料为人工珊瑚、珊瑚羟基磷灰石、β -磷酸三钙。
[0012]一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨的制备方法，包括以下步骤:
[0013]1)根据受体骨缺损大小及形状，利用生物可降解材料做成支架材料，支架材料具有与需修复的骨缺损部位相匹配的形状；
[0014]2)将同种异体骨髓间充质干细胞混悬物均匀浸满整个支架材料，反复交替吸取支架材料上的细胞混悬物，以确保接种均匀，然后成骨诱导液中培养I~4周，使骨髓间充质干细胞诱导分化成成骨细胞，形成含成骨细胞的细胞-支架材料复合物，植入体内便为由同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨。
[0015]所述成骨诱导液包括低糖DMEM，10%胎牛血清，100mg/ml链霉素，100U/ml青霉素，β _甘油磷酸钠10mmol/L，地塞米松10nmol/L，维生素C50mg/L。
[0016]本发明的一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨用于修复人或动物骨组织缺损或畸形。
[0017]本发明的同种异体组织工程骨由于采用同种异体骨髓间充质干细胞为种子细胞复合生物可降解支架材料构建组织工程骨修复受者骨缺损，具有如下有益效果:1、由于本发明采用的骨髓间充质干细胞来源于同种异体健康青壮年人或哺乳动物骨髓血，提取出的干细胞具有良好的增殖和分化能力，分离成功率高，成骨能力强，避免了采用年老或处于各种疾病状态及治疗措施受者的自体骨髓血，提高了组织工程骨制备成功率及产品质量，骨缺损修复效果更佳。2、由于本发明采用的骨髓间充质干细胞来源于同种异体供者骨髓血，可以提前建立同种异体干细胞库(cell bank)或组织工程骨组织库，满足临床“随用随取”的治疗要求，受者不需等待自体骨髓间充质干细胞体外分离培养和/或组织工程骨构建等过程，避免了延误疾病的最佳治疗时间，从而可以实现对骨缺损的一期修复，为移植细胞提供良好的营养供应及新陈代谢环境，促进组织工程骨移植后的成骨活性，有效提高疗效，是一种快速简便、安全有效的骨缺损修复方法。3、由于本发明采用的骨髓间充质干细胞来源于同种异体供者骨髓血，可以提前建立同种异体干细胞库(cell bank)或组织工程骨组织库，可极大地扩宽干细胞的供体来源，根本上解决供体来源问题，应用中更具有可行性。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明:
[0019]图1是本发明的同种异体骨髓间充质干细胞三向诱导分化鉴定及细胞-支架复合物体外生长情况；[0020]图2是Micro-CT检测显示本发明的同种异体骨髓间充质干细胞_人工珊瑚支架组织工程骨修复比格犬下颌骨骨缺损修复效果示意图；
[0021]图3是本发明的同种异体骨髓间充质干细胞-人工珊瑚支架组织工程骨修复比格犬下颌骨骨缺损Micro-CT检测结果示意图；
[0022]图4是本发明的同种异体骨髓间充质干细胞-人工珊瑚支架组织工程骨修复比格犬下颌骨骨缺损修复后生物力学检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0023]实施例:
[0024]1、比格犬骨髓间充质干细胞分离培养
[0025]比格犬，12月龄，以0.12ml/kg的剂量肌注氯胺酮/速眠新(两者以体积比2:1混合)进行麻醉。常规备皮、消毒、铺巾，用肝素化的16号骨穿针于髂后上嵴穿入骨髓腔，然后用含有Iml肝素(50U/ml)的20_ml的注射器负压抽取骨髓液4_ml,加入4ml Hank’s液混匀，然后沿管壁小心加入到含有4-ml Ficoll淋巴细胞分离液的15_ml离心管中，2000_r/min离心20分钟。吸取中间白色云雾状的有核细胞层，用低糖DMEM培养基重悬，1000-r/min离心5分钟，弃上清液，重复2次。离心后用含有体积比为10%FBS的低糖DMEM培养基(完全培养基)重悬细胞，台盼蓝对倍稀释100-μ I细胞悬液，常规计数有核细胞数量。将细胞悬液浓度调整为1.0X IO6-个有核细胞/ml，接种到直径为IOcm的培养皿中，置于37°C、体积分数为5%的CO2-培养箱内培养。48-小时后首次换液，清除未贴壁的细胞，7天后倒置相差显微镜多个细胞克隆形成。用0.25%-胰蛋白酶-0.02%EDTA消化贴壁细胞，按5.0X IO4/ml的密度传代。每隔3天换液I次，倒置相差显微镜下连续观察体外培养过程中BMSCs的贴壁生长、增殖、细胞形态以及细胞外基质的分泌。
[0026]2、比格犬骨`髓间充质干细胞的鉴定
[0027]BMSCs的三向诱导分化
[0028](I)成骨诱导:第二代细胞接种到6孔板，板底预先放入无菌的细胞爬片，细胞贴壁后更换成骨诱导培养基(10_8M地塞米松、0.01M- β -磷酸甘油钠、0.05-g/L维生素C、10% -胎牛血清、1%-双抗)，每隔3天换液一次，持续诱导21天，倒置相差显微镜下连续观察细胞形态变化。4%-多聚甲醛固定，碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒染色；体积分数为95%的乙醇固定1-h，2%-茜素红染色；4%_多聚甲醛固定，加入抗骨桥蛋白一抗和二抗，免疫荧光检测。
[0029](2)成软骨诱导:BMSCs接种内含细胞爬片的6孔板，贴壁后更换成软骨诱导培养基(10-ng/ml TGF-β l、40_ng/ml 地塞米松、50ng/ml 维生素 C、10% -胎牛血清、1%-双抗)。持续诱导培养14天，倒置相差显微镜下连续观察细胞形态变化。4%-多聚甲醛固定，甲苯胺蓝、番红O染色；4%多聚甲醛固定，加入抗II型胶原一抗和二抗，免疫细胞化学检测。
[0030](3)成脂诱导:细胞接种贴壁后更换成脂诱导培养基(0.5_mMIBMX、l(T5M胰岛素、0.2-mM吲哚美辛、10_6M地塞米松、10% -胎牛血清、1%-双抗)，诱导培养14天，倒置相差显微镜下连续观察细胞形态变化。4%-多聚甲醛固定，60%-异丙醇处理，油红O染色。
[0031]如图2所示，三向诱导分化检测显示BMSCs能够分别向骨、软骨和脂肪细胞方向分化。[0032]3、骨髓间充质干细胞-生物可降解支架复合物的制备
[0033]选取人工珊瑚,根据受体骨缺损大小及形状加工成3cmX 1.5cmX0.9cm长方体。支架边缘用打磨机修整平滑，并在支架内部小心打出一 3mm的偏心中空通道，模拟正常下颌骨的骨髓腔，以利于体外培养过程中营养物质进入细胞-支架复合物内部。用5%-次氯酸钠溶液浸泡2周，3天换液一次，然后用三蒸水冲洗，煮沸10分钟，重复3次，超声清洗(重复5次，每次10分钟)后放入电热恒温干燥箱，80°C -烘烤24小时，高温高压灭菌后备用。选用第2代BMSCs，PBS冲洗后加入Iml-胰酶消化，收集细胞于15ml离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清，用完全培养基重悬细胞团，台盼蓝染色后细胞计数。重新调整细胞浓度为2.0X 107/ml，接种到制备好的的珊瑚支架上(每块支架吸收液体约10-μ 1)，使细胞悬液均匀浸满整个支架材料，轻轻反复交替吸取材料上的细胞悬液，以确保接种均匀。接种完毕，转移细胞-材料复合物到培养皿中，放置到37°C、5%C02条件下的恒温CO2培养箱中培养4小时，待细胞完全黏附支架材料后，加入成骨诱导培养基，使液面高于细胞-材料复合物。成骨诱导培养7天，每隔3天换液I次。倒置相差显微镜下连续观察细胞在支架材料上的黏附生长和细胞外基质(ECM)的分泌。 [0034]4、同种异体骨髓间充质干细胞组织工程骨复合物的植入及骨缺损的修复
[0035]根据实验计划于下颌骨截骨修复前2个月，拔除比格犬截骨侧(右侧)上下全部前磨牙及第一磨牙，比格犬，术前12小时禁食，并肌肉注射青霉素以预防感染(剂量为80万单位)。氯胺酮/速眠新(两者以体积比2:1混合)以0.12ml/kg的剂量肌肉注射进行诱导麻醉，注意观察动物呼吸及角膜反射的变化，估计麻醉的深浅程度。动物左侧卧位放置并固定到手术台上，完全暴露右侧下颌骨。后肢隐静脉穿刺打开静脉通道，持续静滴含青霉素的生理盐水。打开口腔，3%过氧化氢溶液冲洗。右侧下颌骨部位常规备皮、消毒、铺无菌巾，暴露手术视野。头过伸位，下颌骨垫高，估计截骨范围后在下颌骨下方约Icm处，平行下颌骨体沿其下缘做一长约IOcm的横行切口，前方达颏孔，后方达下颌角咬肌附着处，依次切开皮肤、皮下筋膜、肌肉、骨膜，暴露下颌骨体。电凝完全止血后小心分离截骨部位骨膜并切除，注意保护下颌骨咬合面处粘膜的完整性。确定截骨位置后用美兰标记(截骨长度3cm)，根据下颌骨体外形对固定钛板进行塑形后，植入钛板，攻丝打孔，骨体远近各3枚钛钉固定。用线锯沿标记线完全离断骨体形成3cm节段性缺损(注意保护口腔颊部粘膜)，迅速用骨蜡填塞离断后骨髓腔内的活动性出血，并去除线锯截骨后残留的骨刺，修平两个骨断端截面。细胞-珊瑚支架复合物植入前12小时更换胎牛血清的培养基，以减少外源性胎牛蛋白植入后对受体造成的影响，术中根据缺损部位的外形对其进行细微调整，并保证对应下颌骨咬合面低于正常下颌骨，避免术后犬因进食等原因磨损口腔黏膜和下方的复合物造成黏膜破溃和口腔内感染，无菌生理盐水冲洗后植入骨缺损处，使两断端和材料紧密接触。无菌生理盐水(含庆大霉素)冲洗，观察无活动性出血后逐层关创缝合，碘伏消毒伤口。术后肌肉注射青霉素(每次80万单位，每天2次，连续5天)以预防感染。术后20周拆除内固定钛板，以给予下颌骨缺损修复部位适当的力学刺激，避免内固定钛板产生的应力遮挡。
[0036]利用自体组织工程骨、同种异体组织工程骨、自体骨及空白支架进行试验，自体组织工程骨、同种异体组织工程骨、自体骨及空白支架植入下颌骨缺损24周后，通过Micro-CT扫描发现前三种治疗措施骨断端均愈合并维持了骨的连续性，骨密度及生物力学检测统计分析均显示同种异体组织工程骨和自体组织工程骨两组间无显著性差异(p＞0.05)(图2-4)
【权利要求】
1.一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨，其特征在于:包括生物可降解材料和同种异体骨髓间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨，其特征在于:所述同种异体骨髓间充质干细胞来源于同种异体健康青壮年人或动物骨髓血，为体外培养原代至第6代的成体骨髓间充质干细胞，向成脂或成骨或成软骨方向诱导。
3.根据权利要求1所述的一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨，其特征在于:所述同种异体骨髓间充质干细胞为液态细胞混悬物，细胞含量为I X IO6个/ml~I X IO8 个/ml。
4.根据权利要求3所述的一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨，其特征在于:所述同种异体骨髓间充质干细胞，细胞含量20 X IO6个/ml为优选。
5.根据权利要求1所述的一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨，其特征在于:所述的生物可降解材料包括天然无机材料、天然有机材料、天然骨衍生材料、人工合成无机材料、人工合成有机材料。
6.根据权利要求5所述的一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨，其特征在于:所述天然无机材料包括珊瑚、珊瑚羟基磷灰石、煅烧骨；天然有机材料包括胶原、壳聚糖；天然骨衍生材料包括冻干骨、脱钙骨、脱蛋白骨、脱细胞骨、冷冻干燥骨、深低温骨、冷冻脱钙骨；人工合成无机材料包括羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃陶瓷、纳米生物陶瓷；人工合成有机材料包括人工珊瑚、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙酸内酯。
7.根据权利要求6所述的一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨，其特征在于:所述人工珊瑚、珊瑚羟基磷灰石、磷酸三钙为优选的生物可降解材料。
8.—种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)根据受体骨缺损大小及形状，利用生物可降解材料做成支架材料，支架材料具有与需修复的骨缺损部位相匹配的形状； 2)将同种异体骨髓间充质干细胞混悬物均匀浸满整个支架材料，反复交替吸取支架材料上的细胞混悬物，以确保接种均匀，形成细胞-支架材料复合物，然后在成骨诱导液中培养I~4周，使骨髓间充质干细胞诱导分化成成骨细胞，形成含成骨细胞的细胞-支架材料复合物。
9.根据权利要求8所述的一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨的制备方法，其特征在于:所述成骨诱导液包括低糖DMEM，10%胎牛血清，100mg/ml链霉素，100U/ml青霉素，β -甘油磷酸钠10mmol/L，地塞米松10nmol/L，维生素C50mg/L。
10.一种同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨的用途:用于修复人或动物骨组织缺损或畸形。
【文档编号】A61L27/50GK103768656SQ201410012389
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】曹谊林, 肖苒, 王黔, 武京国 申请人:中国医学科学院整形外科医院