类叶升麻苷在制备保护对由谷氨酸转运体摄取抑制引起损伤的脑神经细胞的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及类叶升麻苷在制备保护脑神经的药物应用【技术领域】，是一种类叶升麻苷在制备保护对由谷氨酸转运体摄取抑制引起损伤的脑神经细胞的药物中的应用。本发明首次提出类叶升麻苷作用于谷氨酸转运体而起到保护脑神经细胞的作用，类叶升麻苷能够显著提高学习记忆能力，提高了SOD活性，提高了神经细胞的EAAT2mRNA转录水平，提高了脑神经细胞的EAAT2基因的表达水平，表明类叶升麻苷对由谷氨酸转运体摄取抑制引起的脑神经细胞损伤具有显著保护作用，其保护机制与EAAT2基因表达水平的上调有关，由此为寻找新型和有效的慢性神经退行性疾病的治疗药物具有重要意义。
【专利说明】类叶升麻苷在制备保护对由谷氨酸转运体摄取抑制引起损伤的脑神经细胞的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及类叶升麻苷在制备保护脑神经的药物应用【技术领域】，是一种类叶升麻苷在制备保护对由谷氨酸转运体摄取抑制引起损伤的脑神经细胞的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统(CNS)中最重要的兴奋性神经递质，参与突触传递，其介导的信号转导构成记忆和认知的基础，其是学习记忆有关的重要神经递质。在脑组织内含有大量的谷氨酸，正常情况下，大部分存在于细胞内，仅少数存在于细胞间隙，跨膜浓度梯度大约是几千倍。由于胞外没有谷氨酸代谢酶，因而使谷氨酸在神经系统灭活的唯一途径是通过神经细胞的吸收和再摄取，其中起主要作用的是谷氨酸转运体。谷氨酸摄取是借助谷氨酸转运体，利用跨膜电化学梯度作为驱动力进行的，其摄取速率很高。然而，一旦谷氨酸转运体的功能受损导致对谷氨酸摄取抑制，几秒之内就会引起突触间隙或胞外谷氨酸大量积聚，过度激活谷氨酸受体，导致神经细胞死亡。因而，谷氨酸转运体的功能正常与否对于维持中枢神经系统的正常生理功能具有重要意义。目前研究表明，谷氨酸摄取功能障碍与肌萎缩性侧束硬化症(ALS )、阿尔茨海默病(AD )、帕金森病(PD )等退行性疾病的发病有关。因此，研究谷氨酸神经细胞损伤的干预及其分子机制是目前国内外关注的热点之一，特别是对于寻找有效的脑损伤干预药物有着重要的理论意义和应用价值。
[0003]类叶升麻苷(Acteoside)为苯乙醇苷类化合物，目前已在100余种植物中分离获得类叶升麻苷。近年来的研究表明，类叶升麻苷具有抗氧化、抑制前列腺增生、肝损伤保护、补肾壮阳、抑制骨质增生、抗疲劳、增强免疫、DNA损伤修复以及神经保护作用等多种生理活性，尤其是其脑神经保护方面的作用最为引人关注，目前已公开文献报道的脑神经保护作用靶点如下:` I)通过对胆碱酯酶的抑制作用(朴景华，蒲小平，马建等.类叶升麻苷对东莨菪碱所致记忆获得性障碍的改善作用.中国药理学通报，2001，17(6):625-627 ; Ki Yong Lee, EunJu Jeongj Heum-Sook Lee, et al.Acteoside of Callicarpa dichotoma AttenuatesScopolamine-1nduced Memory Impairments.Biol.Pharm.Bull.2006，29 (I):71-74.)。
[0004])通过对氧自由基引起的神经细胞死亡的抑制作用(NguyenXNj Phan VKjChau VM.Phenylpropanoid glycosides from heterosmilax erythrantha and theirantioxidant activity.Arch Pharm Res，2009，32(10):1373-1377 ; Wen FCj Lie CL,Chieh FC.Acteoside protects endothelisl cells against fress radical-1nducedoxidative stress.J Pharm Pharmacol, 2004，56(6): 743-748 ;彭晓明，高莉，甘萍等.类叶升麻苷抗H202诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用，中药药理与临床，2013，29(3):35-38)0
[0005])通过对谷氨酸引起的Ca+内流，NO和活性氧过度生成的抑制作用(KyungAhKooj Seung Hyun Kimj Tae Hwan Ohj et al.Acteoside and its aglycones protectprimary cultures of rat cortical cells from glutamate-1nduced excitotoxicity.Life sciences, 2006, 79:709-716)。
[0006])通过对神经元凋亡的抑制作用(GuoQS, Jin RZ, Xiao PP, et al.Protective effect of verbascoside on 1-methyl-4-phenylpyridinium ion-1nducedneurotoxicity in PC12 cells.Eur J of Pharmacol, 2002, 451 (2): 119-124 ;杨芳艳，蒲小平.类叶升麻苷对鱼藤酮致SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用，中国药理学通报，2006,22(2): 159-164)。
[0007]以上研究表明，类叶升麻苷主要通过抑制胆碱酯酶活性、抗氧化、抑制谷氨酸以及抗凋亡等作用以保护脑神经，但是迄今为止，尚未见有其通过作用于谷氨酸转运体从而保护脑神经细胞的研究报道。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种类叶升麻苷在制备保护对由谷氨酸转运体摄取抑制引起损伤的脑神经细胞的药物中的应用，本发明首次提出类叶升麻苷作用于谷氨酸转运体而起到保护脑神经细胞的作用。
[0009]本发明的技术方案是通过以下措施来实现的:一种类叶升麻苷在制备保护对由谷氨酸转运体摄取抑制引起损伤的脑神经细胞的药物中的应用。
[0010]下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进:
上述类叶升麻苷可以干品重量计，类叶升麻苷的含量为90%至99.9%。
[0011]上述类叶升麻苷可为从植物中提取的类叶升麻苷或者通过合成得到的类叶升麻苷。
[0012]本发明首次提出类叶升麻苷作用于谷氨酸转运体而起到保护脑神经细胞的作用，类叶升麻苷能够显著改善L-trans`-PDC诱导的神经细胞的细胞形态，提高了细胞存活率，抑制了 Glu、LDH、MDA和ROS的生成，能够显著提高学习记忆能力，提高了 SOD活性，提高了神经细胞的EAAT2 mRNA转录水平，提高了脑神经细胞的EAAT2基因的表达水平，表明类叶升麻苷对由谷氨酸转运体摄取抑制引起的脑神经细胞损伤具有显著保护作用，其保护机制与EAAT2基因表达水平的上调有关，由此为寻找新型和有效的慢性神经退行性疾病的治疗药物具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]附图1为正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的PC12细胞形态的显微镜图。
[0014]附图2为正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的PC12细胞凋亡图。
[0015]附图3为正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的PC12细胞EAAT2基因转录水平的电泳图。
[0016]附图4为正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的SD大鼠的轨迹路线图。
[0017]附图5为正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的SD大鼠的EAAT2基因表达的蛋白杂交图。
[0018]附图6为类叶升麻苷的结构式。【具体实施方式】
[0019]本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
[0020]下面结合实施例对本发明作进一步描述:
实施例1:类叶升麻苷在制备保护对由谷氨酸转运体摄取抑制引起损伤的脑神经细胞的药物中的应用。类叶升麻苷的结构式如图6所示。
[0021]实施例2:与上述实施例的不同之处在于，类叶升麻苷以干品重量计，类叶升麻苷的含量为90%至99.9%、
实施例3:与上述实施例的不同之处在于，类叶升麻苷为从植物中提取的类叶升麻苷或者通过合成得到的类叶升麻苷。
[0022]下面为根据本发明中上述实施例的类叶升麻苷在制备保护对由谷氨酸转运体摄取抑制引起损伤的脑神经细胞的药物中的应用的具体药理试验:
一.类叶升麻苷对L-trans-PDC所致PC12细胞损伤的保护作用 I试验材料
类叶升麻苷(AS)，纯度≥90%,RPMI1640培养基为GIBCO的产品，胎牛血清为Hyclone的产品，L-反式-吡咯烷-2，4- 二羧酸(L-trans-PDC)、氨苄青霉素钠和硫酸链霉素均购自sigma公司，Rat ROS Elisa Kit购自R&D公司，谷氨酸(Glu)测试盒、乳酸脱氢酶(LDH)测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、BCA蛋白含量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，其余在试验过程中使用到的试剂均为分析纯。GAPDH引物:上游 5’- GAC CAC AGT CCA TGC CAT CAC _3’，下游 5’- TGA GGT CCA CCA CCC TGTTGC -3，;EAAT2 引物:上游 5’- GGG TCA TCC TGG ATG GAG GTC-3’，下游 5’- CGT GTC GTCATA AAC GGA CTG-3’ ；以上引物由上海生工生物工程有限公司合成。细胞株:PC12细胞购自于中国科学院细胞库。
[0023]细胞的培养方法
将PC12细胞以5X IO5个/ml接种于含有10%胎牛血清、0.llg/L丙酮酸钠、2.5g/L葡萄糖、1.5g/L的NaHCO3、100U/ml的氨苄青霉素钠和100U/ml的硫酸链霉素的RPMI1640培养基中，并将RPMI1640培养基放置于温度为37°C和体积分数为5%的CO2培养箱中进行培养，每隔3天换一次液。
[0024]细胞损伤模型(模型对照组)的建立以及正常组、类叶升麻苷给药组(AS组)的建立 当培养瓶中PC12细胞的融合率达到80%左右时，用0.25%胰酶消化PC12细胞，调节
RPMI1640培养基中细胞密度至5X IO4个/ml，以100 μ I/孔铺至96孔培养板，培养48h后将PC12细胞分为三组，第一组为正常组，第二组用100 μ M/L的L-trans-PDC进行诱导，将经过24h的L-trans-PDC诱导并吸弃培养液后建立模型对照组，第三组用100 μ M/L的L-trans-PDC进行诱导，经过24h的诱导后，吸弃培养液，接着以类叶升麻苷为药物进行给药并建立类叶升麻苷给药组，类叶升麻苷给药组的3个给药浓度分别为:0.1 μ M/L、10 μ M/L、1000 μ M/L,给药作用48h后，在显微镜下观察细胞形态并拍照，将正常组和模型对照组加入至无血清RPMI1640培养基中，在显微镜下观察细胞形态并拍照，正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的PC12细胞形态的显微镜图(局部200X)如图1所示，在图1中，A为正常组的显微镜图，B为模型对照组的显微镜图，C为给药浓度为0.1 μ M/L的AS组的显微镜图，D为给药浓度为10 μ M/L的AS组的显微镜图，E为给药浓度为1000 μ M/L的AS组的
显微镜图。
[0025]噻唑蓝(MTT)法测定PC12细胞的存活率
向培养正常组和模型对照组P C12细胞的无血清RPM116 4 O培养基中均加入MT T，培养4h，吸弃培养液，然后，加入DMSO震荡溶解后，接着于Multiskan Go 1510酶标仪测定490nm处吸光度值，并计算正常组和模型对照组的细胞存活率，向中经过48h后的类叶升麻苷给药组的培养基中加入MTT，培养4h，吸弃培养液，然后，加入DMSO震荡溶解后，接着于Multiskan Go 1510酶标仪测定490nm处吸光度值,并计算类叶升麻苷给药组的细胞存活率。细胞存活率=A /A正常组X 100%，其中A为吸光度值，正常组的细胞存活率记作100%。正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的细胞存活率如表1所示。
[0026]细胞上清液中Glu含量、LDH活性、MDA含量和SOD活性的测定
细胞外Glu的含量水平是反映细胞毒性及谷氨酸转运体受损程度的重要指标，LDH的测定客观的衡量细胞的受损程度，SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标，通过测定MDA含量、SOD活性不仅可反映神经细胞损伤的原因，而且还可以判断细胞损伤的程度。
[0027]分别收集正常组、经过L-trans-PDC诱导一定时间后的模型对照组和经过类叶升麻苷作用一定时间后的类叶升麻苷给药组的PC12细胞培养上清液40 μ 1，根据Glu、LDH、MDA,SOD试剂盒说明书测定正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组的培养液中Glu含量、LDH活性、MDA含量和SOD活性。正常组、模型对照组(模型组)、类叶升麻苷给药组的Glu含量、LDH活性、MDA含量和SOD活性如表1所示。
[0028]细胞内活性氧簇`(ROS)的测定
分别吸取正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组的PC12细胞培养上清液，向正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组的PC12细胞培养上清液中均加入50 μ I PBS (pH为7.2-7.4)，然后，以上加入50 μ I PBS的三组PC12细胞培养上清液在温度为-80°C的冰箱中反复冻融，以使细胞裂解，接着，在转速为2000rpm的条件下离心15min，收集正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组的PC12细胞的上清液用于测定蛋白浓度及ROS含量，ROS的测定依据下述方法进行:参照ROS试剂盒说明书，稀释标准品并在酶标包被板上设定标准孔15孔，空白孔3个，在Elisa板的空白孔和测定孔中分别加入40 μ I样品稀释液，然后吸取测定样品10 μ I加入到待测孔，封膜板封板置于37°C温育30min，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干，然后，每孔加入50 μ I酶标试剂(空白孔除外)，37°C温育30min、洗涤液洗涤5次，拍干，每孔加入50 μ I显色剂A和50 u I显色剂B，轻轻震荡混匀，37°C避光显色15min，每孔加终止液50 μ I后，450nm测定吸光度值，以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线并计算线性回归方程，由线性回归方程得出各组测定样品中的ROS浓度C，然后计算各组样品中实际ROS浓度。实际ROS浓度=C (IU/ml)X稀释倍数/待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)。正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的ROS含量如表2所示。
[0029]细胞的早期凋亡比率的检测
将正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组中的PC12细胞依序经过0.25%胰酶消化和弃去消化液后，向各组中加如Hank’ s液，用吸管将PC12细胞自瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中，在转速为800-1000rpm的条件下离心5min,弃上清液,用IX结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度为I X IO6个/ml。取100μ I细胞悬液，加入5μ I FITC标记的AnnexinV和10 μ I PI溶液。轻轻混匀，室温避光染色20min。加入I X结合缓冲液400 μ 1，混匀，于BD FACS Aria II流式细胞仪测定各组的细胞早期凋亡比率，正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的PC12细胞的早期凋亡比率如表2所示，正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的PC12细胞凋亡图如图2所示，在图2中的五个小图中，从左至右，依序排列:正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组(0.1 μ M/L)、类叶升麻苷给药组(10 μ M/L)、类叶升麻苷给药组(ΙΟΟΟμΜ/L)。
[0030]细胞的ΕΑΑΤ2基因转录水平的测定
ΕΑΑΤ2是人脑内兴奋性氨基酸转运体中最重要的转运蛋白，其功能紊乱或表达降低能够显著影响谷氨酸的再摄取，导致谷氨酸在胞外积聚及神经死亡。
[0031]将正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组的PC12细胞根据TRIpure LS Reagent总RNA抽提试剂说明书，提取PC12细胞总RNA，测定RNA浓度，并将各组RNA浓度调节一致，按TIANScript RT Kit TIANScript cDNA第一链合成试剂盒说明书进行RT-PCR，PCR反应条件为:94°C 5min,94°C 30s, 55°C 45 s, 72°C 45s, 30 个循环后 72°C延伸 10 min，然后冷却至4°C，吸取IOml PCR产物于1%的琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外透射仪下观察结果并拍照，并计算EAAT2/GAPDH比值，并计算各个组的EEAT2 mRNA转录水平，均以EAAT2^SS/GAPDH|SS比值表示，正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的EEAT2 mRNA转录水平转录水平如表3所示，正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的PC12细胞EAAT2基因转录水平的电泳图如图3所示，在图3中，1-2代表正常组，3-4代表模型对照组，5-6代表类叶升麻苷给药组(0.1 μ M/L), 7-8代表类叶升麻苷给药组(10 μ M/L), 9-10代表类叶升麻苷给药组(1000 μM/L)。
[0032]结果讨论与分析` (I)对PC12细胞的细胞形态学变化的影响
由图1可以看出，正常组中的PC12细胞的轮廓层次较分明，细胞立体感及折光性较强，细胞突触明显且较多，细胞数量也较多，而模型对照组的PC12细胞的细胞轮廓层次较差，神经元胞体表面粗糙，且细胞突触减少，相对于模型对照组而言，类叶升麻苷给药组中各个不同给药剂量小组的PC12细胞的立体感、折光性增强，细胞突起增多并交织成网状，胞浆内颗粒物减少，退化死亡的PC12细胞明显减少，不同浓度的类叶升麻苷对PC12细胞都有一定程度保护作用，且保护强度呈现一定的浓度依赖性。
[0033](2)对PC12细胞的细胞存活率、Glu含量、LDH活性、MDA含量和SOD活性的影响 如表1所示，利用100 μ M/L的L-trans-PDC诱导PC12细胞24h后的模型对照组的细胞
存活率和SOD活性相对于正常组的细胞存活率和SOD活性明显降低，模型对照组的LDH活性、谷氨酸含量和MDA含量显著升高，表明L-trans-PDC致PC12细胞损伤模型诱导成功，而经过浓度为0.1 μ M/L、10 μ M/L和1000 μ M/L的类叶升麻苷作用48h后的类叶升麻苷给药组，相对于模型对照组而言，类叶升麻苷给药组能显著提高PC12细胞的细胞存活率和SOD活性，抑制LDH活性、谷氨酸和MDA的生成，并且随着类叶升麻苷给药浓度的增大，PC12细胞的细胞存活率和SOD活性随之提高，LDH活性降低，谷氨酸含量和MDA含量随之下降。
[0034](3)对PC12细胞的ROS含量和早期凋亡比率的影响由表2中的数据以及图2可以看出，模型对照组相对于正常组而言，模型对照组的ROS含量大于正常组的ROS含量，说明模型对照组中的PC12细胞在L-trans-PDC影响下，PC12细胞受到高浓度的谷氨酸攻击，胞内ROS大量聚集，类叶升麻苷给药组相对于模型对照组而言，类叶升麻苷给药组的ROS含量低于模型对照组的ROS含量，并且可以看出，类叶升麻苷给药组的ROS含量随着类叶升麻苷的给药浓度的增加而降低，说明类叶升麻苷对ROS含量具有抑制的作用，通过早期凋亡细胞比率数据可以看出，模型对照组的早期凋亡细胞比率大于正常组的早期凋亡细胞比率，类叶升麻苷给药组的早期凋亡细胞比率小于模型对照组的早期凋亡细胞比率，并且类叶升麻苷给药组的早期凋亡细胞比率随着类叶升麻苷给药浓度的增加而降低，说明类叶升麻苷能够降低损伤的PC12细胞的早期凋亡细胞比率，类叶升麻苷作用48h后，早期凋亡细胞比率下降至20.83%、18.97%和15.75%，并具有显著差异。
[0035](4)对PC12细胞EAAT2转录水平的影响
从表3可以看出，与正常组比较，模型对照组的EAAT2 mRNA转录水平下降，类叶升麻苷给药组相对于模型对照组而言，类叶升麻苷给药组的EAAT2 mRNA转录水平得到提高，并且随着类叶升麻苷给药组的给药浓度的增加，EAAT2 mRNA转录水平出现上调趋势，说明类叶升麻苷能够提高受损神经细胞的EAAT2 mRNA转录水平。
[0036]小结
类叶升麻苷能够显著改善L-trans-PDC诱导的PC12细胞的细胞形态，提高了 PC12细胞的细胞存活率，抑制了 PC12细胞中的Glu、LDH、MDA和ROS的生成，提高了 SOD活性和EAAT2 mRNA转录水平，表明类叶升麻苷对由谷氨酸转运体摄取抑制引起的神经细胞损伤具有显著的保护作用，其保护机制与EAAT2 mRNA转录水平的上调有关。
[0037]二、类叶升麻苷对L-trans-PDC所致大鼠神经细胞损伤的保护作用 1.试验材料
类叶升麻苷(AS)，纯度> 90% ;实验动物为SPF清洁级SD大鼠50只，雌性，体重为250±20g，由新疆维吾尔自治区实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK (新)2003-0002 ；EAAT2 (一抗)、β -Tubulin (一抗)、二抗均为Millipore公司的产品；L-反式-批咯烧-2, 4- 二羧酸(L-trans-PDC)购自 sigma 公司；western Breeze chromogenicimmunodetection system购自Invitrogen公司；超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、BCA蛋白含量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
[0038].谷氨酸转运体摄取障碍模型(模型对照组)的建立以及正常组、类叶升麻苷给药组(AS组)的建立
50只SD大鼠随机分为正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组，类叶升麻苷给药组依据类叶升麻苷的给药量分为三个给药小组，正常组、模型对照组SD大鼠的数量均为10只，三个给药小组的的SD大鼠的数量均为10只，50只SD大鼠均用戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位以上，50只SD大鼠颅顶正中切开暴露至颅骨，根据SD大鼠卢页脑立体定位图谱，对基底右脑定位(前卤后0.8mm,右侧旁开中线1.5mm,深度3mm),用牙科钻钻开颅骨，正常组用微量进样器向大鼠右侧脑室注射5μ I的生理盐水，其余各组注射等量的采用生理盐水溶解的2mg/ml的L-trans-PDC，注射完毕后以局部软组织封闭针孔，缝合皮肤，术后给予青霉素钠 5U肌注(除正常组外)，每天I次，连续3天，然后，对正常组和模型对照组的SD大鼠灌胃生理盐水，同时，对类叶升麻苷组的三个给药小组进行给药，给药剂量分别为5mg/kg、50mg/kg、500mg/kg, I次/天,连续灌胃30天。
[0039].Morris水迷宫测试
在正常组和模型对照组灌胃生理盐水第25天开始进行Morris水迷宫实验，在类叶升麻苷给药组中各组SD大鼠给药后第25天开始进行Morris水迷宫实验，Morris水迷宫实验主要包括定位巡航实验和空间探索实验。
[0040]定位巡航实验:实验前让每只SD大鼠在安全平台上站15s，然后将其头朝下背对水池壁依次从东北、东南、西南、西北(NE、SE、SW、NW) 4个象限投入水中，游泳时间设定为120s,记录大鼠进驻平台所需时间(大鼠找到平台并滞留其上5s为成功进驻)为逃避潜伏时间(escape latency, ST)。如在120s内大鼠不能成功进驻平台，贝U实验者将其引上平台并强制其停留15s，照此方法，连续5天。正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组在定位巡航实验中的潜伏期(S)和寻求次数如表4所示。
[0041]空间探索实验:第6天，将各组的SD大鼠从一固定象限(NW)投入水池中，记录SD大鼠120s内在原平台象限的游泳时间和游泳轨迹，计算大鼠穿越原安全平台所在位置的次数(穿台次数)及各象限游泳时间占总时间百分比(原平台象限比)。正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组的穿台次数和原平台象限比如表4所示。正常组、模型对照组(模型组)、类叶升麻苷给药组的SD大鼠的轨迹路线图如图4所示，在图4中，A为正常组SD大鼠的轨迹路线，B为模型对照组SD大鼠的轨迹路线，C、D、E分别为给药量为5mg/kg、50mg/kg、500mg/kg的类叶升麻苷给药组SD大鼠的轨迹路线。
[0042].对SD大鼠海马组织中MDA含量、SOD活性的影响
在正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组的SD大鼠完成Morris水迷宫测试并且各组完成相应的灌胃生理盐水或类叶升麻苷给药后，每组取5只SD大鼠尾静脉注射1%硫喷妥钠(40mg.kg-1)麻醉,迅速`断头,冰上取脑，于前卤后2.3mm至前卤后6.3mm处剥离出海马，加入9倍的生理盐水匀浆并离心，吸取组织匀浆上清液用于MDA含量和SOD活性的测定，MDA含量和SOD活性的测定方法均参照南京建成生物研究所的MDA测定试剂盒和SOD活性测定试剂盒上的说明书进行。正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组的MDA含量和SOD活性的测定结果如表5所示。
[0043].对大鼠海马组织中EAAT2基因表达水平的影响
在正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组的SD大鼠完成Morris水迷宫测试并且各组完成相应的灌胃生理盐水或类叶升麻苷给药后，每组另取5只大鼠，分离海马组织，加入蛋白提取试剂，冰上匀浆并离心，吸取蛋白上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。然后，将各组蛋白浓度调整一致，SDS-PAGE电泳，半干式转膜。利用western Breeze chromogenicimmunodetection system进行western blot (蛋白质印迹法),然后封闭液封闭、加入一抗、洗涤、加入二抗孵育、显影，室温晾干PVDF膜后，于凝胶成像系统拍照，进行目的条带的灰度值分析，并计算各组的EEAT2基因表达水平，均以EAAT2#SS/ β -Tubulin比值表示，正常组、模型对照组和类叶升麻苷给药组的EAAT2基因表达水平如表6所示，正常组、模型对照组、类叶升麻苷给药组的SD大鼠的EAAT2基因表达的蛋白杂交图如图5所示，在图5 中，1-2 为 AS 组(5mg/kg)，3-4 为 AS 组(50mg/kg ),5-6 % AS 组(500mg/kg)，7-8 为正常组，9-10为模型模型对照组。
[0044]结果讨论与分析(I)SD大鼠在Morris水迷宫中游泳的路线轨迹
从图4可以看出，正常组的SD大鼠的轨迹路线呈趋向式，说明正常组的SD大鼠具有一定的学习记忆能力；模型对照组的SD大鼠的轨迹路线呈随机式，说明模型对照组的SD大鼠的学习记忆能力下降；类叶升麻苷给药组的SD大鼠的轨迹路线呈趋向式，说明类叶升麻苷给药组的SD大鼠的学习记忆能力相对于模型对照组的SD大鼠的学习记忆能力有所上升。
[0045](2) SD大鼠的学习记忆成绩
由表4可见，模型对照组的潜伏期相对于正常组的潜伏期变长，说明模型对照组SD大鼠的学习记忆行为能力下降，穿台次数也较低，而类叶升麻苷给药组的潜伏期随着训练天数增加而明显缩短，穿台次数显著升高(P < 0.05)，类叶升麻苷对SD大鼠的受损大脑具有一定程度的保护作用。
[0046](3)对SD大鼠海马组织中MDA含量和SOD的影响
从表5可以看出，相对于正常组而言，模型对照组的SD大鼠脑匀浆中SOD活性下降，MDA含量升高，类叶升麻苷给药组相对于模型对照组而言，类叶升麻苷给药组的SOD活性升高，MDA含量下降，同时可以看出，在类叶升麻苷给药组中，随着类叶升麻苷的给药量的增加，MDA呈下降的趋势，SOD活性呈上升的趋势，说明类叶升麻苷能够显著抑制大鼠海马组织中MDA含量的升高，提高SOD的活性。
[0047](4)对SD大鼠海马组织EAAT2基因表达的影响
由表6的数据可知，相对于正常组而言，模型对照组的EAAT2基因表达水平下降，类叶升麻苷给药组相对于模型对照 组而言，类叶升麻苷给药组的EAAT2基因表达水平上升，并且，EAAT2基因表达水平随着类叶升麻苷给药组的给药剂量的增加而呈上调的趋势，这与图5 一致。
[0048]小结
由上可知，类叶升麻苷能够显著提高L-trans-PDC所致的SD大鼠的学习记忆能力，有效地抑制了海马组织细胞中MDA的生成，提高了 SOD活性，提高了脑神经细胞的EAAT2基因表达水平，试验结果表明，类叶升麻苷对由谷氨酸转运体摄取抑制引起的神经细胞损伤具有显著保护作用，其保护机制与EAAT2基因表达水平的上调有关。
[0049]注:在以上类叶升麻苷在制备保护对由谷氨酸转运体摄取抑制引起损伤的脑神经细胞的药物中的应用的具体药理试验中，数据均采用SPSS11.5软件进行处理，所有数据均采用F 土S表示，应用t检验进行显著性检验，P <0.05代表有显著性差异，P <0.01代
表差异极显著，与正常组比较，Λ表示/表示/；与模型对照组比较，*表禾 P〈 0.05,'k 'k 衰元、P < 0.01。
[0050]综上所述，本发明首次提出类叶升麻苷作用于谷氨酸转运体而起到保护脑神经细胞的作用，类叶升麻苷能够显著改善L-trans-PDC诱导的神经细胞的细胞形态,提高了细胞存活率，抑制了 Glu、LDH、MDA和ROS的生成，能够显著提高学习记忆能力，提高了 SOD活性，提高了神经细胞的EAAT2 mRNA转录水平，提高了脑神经细胞的EAAT2基因的表达水平，表明类叶升麻苷对由谷氨酸转运体摄取抑制引起的脑神经细胞损伤具有显著保护作用，其保护机制与EAAT2基因表达水平的上调有关，由此为寻找新型和有效的慢性神经退行性疾病的治疗药物具有重要意义。
【权利要求】
1.一种类叶升麻苷在制备保护对由谷氨酸转运体摄取抑制引起损伤的脑神经细胞的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的类叶升麻苷在制备保护对由谷氨酸转运体摄取抑制引起损伤的脑神经细胞的药物中的应用，其特征在于类叶升麻苷以干品重量计，类叶升麻苷的含量为90%至99.9%。
3.根据权利要求1或2所述的类叶升麻苷在制备保护对由谷氨酸转运体摄取抑制引起损伤的脑神经细胞的药物中的应用，其特征在于类叶升麻苷为从植物中提取的类叶升麻苷或者通过合成得到的类叶升麻苷。
【文档编号】A61P25/00GK103816168SQ201410076060
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】高莉, 彭晓明, 霍仕霞, 闫明 申请人:新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所