红芪多糖在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了红芪多糖在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用，其中，红芪多糖具体为红芪多糖1、红芪多糖4、红芪多糖3或红芪多糖3的分离物一种或多种的组合，所述红芪多糖3的分离物为红芪多糖3-A、红芪多糖3-B、红芪多糖3-C或红芪多糖3-D中的一种或多种的混合。试验结果表明，卵巢摘除大鼠骨的钙含量和骨密度均明显下降，而HPS1，HPS4，HPS3及HPS3-A，HPS3-B，HPS3-C，HPS3-D治疗组均能有效增强骨质疏松大鼠的钙含量及骨密度，明显抑制骨矿的溶解和丢失，HPS3-D作用效果最为明显。
【专利说明】红芪多糖在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及红芪多糖的用途，属于医学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]红苗(Radix Hedysari)系豆科岩黄苗属植物多序岩黄苗(Hedysarum polybotrysHand.-Mazz)的根.为甘肃特产名贵药材，中医将其作为传统中药，在临床上其具有强心，降糖，利尿，抗病毒，抗衰老等功效。红苗多糖(Radix Hedysari polysaccharides HPS)作为其主要活性成分之一，其中HPS-1，HPS-3，HPS-4部分具有较明显的降血糖及体外抗氧化
等作用。
[0003]骨质疏松症(osteoporosis 0P)是以骨量减少，骨组织显微结构退化，骨的脆性增高及骨折危险性增加为特征的一种全身性骨病，是老年人的常见病、多发病。随着我国逐渐进入老龄化社会，骨质疏松症的发病率呈现不断上升的趋势。对其进行有效的预防和治疗，正日益成为人们关注的焦点和重点研究领域。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了红芪多糖的一种新用途一在制备预防或治疗 骨质疏松药物或保健品中的应。
[0005]红芪多糖在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用，其中，红芪多糖具体为红芪多糖1、红芪多糖4、红芪多糖3或红芪多糖3的分离物一种或多种的组合，所述红芪多糖3的分离物为红芪多糖3-A、红芪多糖3-B、红芪多糖3-C或红芪多糖3-D中的一种或多种的混合。
[0006]优选的，所述预防或治疗骨质疏松药物是通过促进成骨作用途径治疗骨质疏松的药物。
[0007]进一步优选的，所述预防或治疗骨质疏松药物是防治绝经后妇女骨质疏松的药物，其用量在8.3mg/Kg既有效。
[0008]更优的，所述红芪多糖为红芪多糖3-D，试验表明，红芪多糖3-D预防和治疗骨质疏松的效果更加明显。其用量在用量为口服8.3mg/Kg、注射1.67mg/Kg，即有明显的效果(大鼠与人的换算剂量是6:1)。
[0009]上述红芪多糖制剂的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制剂。
[0010]一种可预防和治疗骨质疏松的药物，其主要成分为红芪多糖1、红芪多糖4、红芪多糖3或红芪多糖3的分离物一种或多种的组合，所述红芪多糖3的分离物为红芪多糖3-A、红芪多糖3-B、红芪多糖3-C或红芪多糖3-D中的一种或多种的混合。优选红芪多糖3-D。
[0011]优选的，所述预防或治疗骨质疏松药物是通过促进成骨作用途径治疗骨质疏松的药物。
[0012]进一步优选的，所述预防或治疗骨质疏松药物是针对防治绝经后妇女骨质疏松的药物
[0013]本发明首次探讨了 HPS-1，HPS-3，HPS-3及其分离物促进成骨细胞分化，对卵巢摘除引起的大鼠骨质疏松的防治作用，上述研究对促进红芪药材资源的有效利用和产地经济的发展具有重大意义。
[0014]为了进一步的说明本发明的进步性和实质， 申请人:进行了充分的试验。
[0015]一、红芪多糖促进成骨细胞分化的研究
[0016]1.试验材料
[0017]1.1细胞株:小鼠MC3T3-E1成骨细胞株购自中国医学科学院细胞库。
[0018]1.2主要试剂:低糖DMEM培养基(Hyclone, USA)，胎牛血清(GIBCO, USA)，青霉素-链霉素双抗(武汉博士德)，碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成，中国)，β -actin (中山金桥)、Runx-2 (Santa Cruze, USA)、Osterix (Santa Cruze, USA) 一抗，辣根过氧化物酶二抗(中山金桥)，总RNA提取液(TaKaRa, Japan), PCR反转录试剂盒(TaKaRa, Japan),β -actin、OPN> OCN> BSP、Runx-2> Osterix 引物(TaKaRa, Japan)。
[0019]1.3主要仪器:细胞培养箱(Heal force, USA)，倒置相差显微镜(Olympus，USA)，PCR仪(ABI7500 ，USA)，DYCZ-24DN型蛋白凝胶电泳仪(北京六一，中国)
[0020]2.试验步骤
[0021]2.1.成骨细胞培养:细胞在温度37°C、二氧化碳饱和度5%的孵育箱中培养传代。用含10%胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml的DMEM/F-12培养液培养，待细胞融合至90%时，用0.25%胰酶消化，接种至25cm2培养瓶中传代培养。
[0022]2.2.红芪多糖溶液配制:HPS1，HPS4，HPS3及其分离物(HPS3-A, HPS3-B, HPS3-C, HPS3-D)溶解于含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液中，分别配制成浓度为1.0g/ml的储存液。然后分别经过0.2 μ m无菌滤器过滤后无菌条件下4°C保存。
[0023]2.3.噻唑蓝试验(MTT)测量细胞增殖情况:将成骨细胞悬液按照每孔100 μ I (2 X 104密度)接种于96孔板，每组设置5个复孔。约24小时后，细胞处于对数生长期，每组分别加入HPS1，HPS4，HPS3及其分离物(HPS3-A，HPS3-B, HPS3-C, HPS3-D)溶解后终浓度达到8mg/ml。孵育72小时后加入20 μ I MTT(5mg/ml)继续孵育4小时，然后加入150ul 二甲基亚砜，室温摇床振荡lOmin。酶标仪检测0D490nm处各孔的吸光值。
[0024]2.4.成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性检测:取对数生长期的成骨细胞，以I X 105/孔密度接种于24孔板中贴壁培养12h，分别给予终浓度为8mg/ml的HPS1，HPS4，HPS3及HPS3-A, HPS3-B, HPS3-C, HPS3-D刺激72小时后，吸出培养液，用PBS冲洗3次后每孔加入0.5mL含体积分数0.1 %的Triton X-100，10分钟后将每孔溶液收集离心，取上清液，按照ALP试剂盒说明书进行操作，测定ALP活性。
[0025]2.5.实时荧光定量 PCR(RT-PCR)检测:使用 RNA iso TM Plus (TaKaRa)按照使用说明提取细胞总RNA，并检测RNA浓度。取约500ng总RNA配制成10 μ I反转录体系，反转录条件如下:反转录反应37°C 15min,反转录酶的失活反应85°C 5s。突光定量PCR反应:采用双标记荧光探针法，反应条件为:预变性95°C 30s，反应95°C 3s, 60°C 30s，共 40 个循环。引物设计为:OPN, 5 ' -CTCCAATCGTCCCTACAGTCG-3 '，antisense strandOPN，5' -CCAAGCTATCACCTCGGCC-3' ; sense strand OCN, 5' -ACCATCTTTCTGCTCACTCTGCT-3'，antisense strand OCN, 5' -CCTTATTGCCCTCCTGCTTG-3' ;sense strand BSP,5' -GGCTATTGATCAAGCAGCACACA-3' , antisense strand BSP, 5-CGCAGTTAGCAATAGCACAAACAC-3'；sense strandβ—actin, 5—ATGGAGCCACCGATCCACA—3' , antisense strand β -actin, 5' -CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'.。
[0026]2.6.统计学方法:所有试验数据以均数土标准差表示，用SPSS13.0统计软件包进行统计处理。采用单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较及各组均值的两两比较，以P〈0.05为差异有统计学意义。
[0027]3.结果与讨论
[0028]3.1红芪多糖对成骨细胞活性的影响
[0029]如表1示，经过72小时的刺激，浓度为lmg/ml的HPSl，HPS4，HPS3及HPS3-A, HPS3-B, HPS3-C, HPS3-D对成骨细胞活性无明显影响，表明HPS对成骨细胞无毒性作用。
[0030]表1HPS对成骨细胞活性的影响
[0031]
【权利要求】
1.红芪多糖在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用，其中，红芪多糖具体为红芪多糖1、红芪多糖4、红芪多糖3或红芪多糖3的分离物一种或多种的组合，所述红芪多糖3的分离物为红芪多糖3-A、红芪多糖3-B、红芪多糖3-C或红芪多糖3-D中的一种或多种的混合。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于:所述预防或治疗骨质疏松药物是通过促进成骨作用途径治疗骨质疏松的药物。
3.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于:所述预防或治疗骨质疏松药物是防治绝经后妇女骨质疏松的药物。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用方法，其特征在于:所述红芪多糖为红芪多糖 3-D，用量为口服 8.3mg/Kg、注射 1.67mg/Kg。
5.根据权利要求1至4任一项所述的应用方法，其特征在于:红芪多糖制剂的剂型为溶液剂、糖衆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制剂。
6.一种可预防和治疗骨质疏松的药物，其特征在于:其主要成分为红芪多糖1、红芪多糖4、红芪多糖3或红芪多糖3的分离物一种或多种的组合，所述红芪多糖3的分离物为红芪多糖3-A、红芪多糖3-B、红芪多糖3-C或红芪多糖3-D中的一种或多种的混合。
7.根据权利要求6所述的可预防和治疗骨质疏松的药物，其特征在于:其主要成分为红芪多糖3-D。
8.根据权利要求6或 7所述的可预防和治疗骨质疏松的药物，其特征在于:所述预防或治疗骨质疏松药物是通过促进成骨作用途径治疗骨质疏松的药物。
9.根据权利要求8所述的可预防和治疗骨质疏松的药物，其特征在于:所述预防或治疗骨质疏松药物是针对防治绝经后妇女骨质疏松的药物。
【文档编号】A61K31/715GK103933060SQ201410171055
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】赵良功, 封士兰, 封德梅 申请人:兰州大学