一种适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型及其建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型及其建立方法，即对大鼠腹腔注射氨甲喋呤（MTX）10mg/kg，分别于第0天和第6天进行两次注射。该模型可以更好的模拟化疗造成的肠黏膜损伤实际情况，适用于中长期营养支持的整体效果评价，也可以应用于化疗造成的肠黏膜损伤机体的生理病理变化研究。
【专利说明】一种适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型及其建立方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物实验模型【技术领域】，尤其是涉及一种适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型及其建立方法。
【背景技术】
[0002]“肠黏膜炎”，也称“肠黏膜屏障损伤”，是肿瘤患者化疗过程中常见的并发症。化疗药物尤其是大剂量化疗药物可对胃肠道造成损伤，引起恶心、呕吐、腹泻、食欲减退、水电解质及酸碱平衡失调等一系列胃肠道症状，严重影响患者进食，延长住院时间，甚至影响化疗进程以及疾病预后。为了评价机体在化疗过程中由于肠黏膜损伤引起的代谢、营养、免疫等多方面的生理病理改变，为合理的营养膳食和药物治疗提供指导，建立合适的化疗型肠黏膜炎动物模型显得尤为重要。
[0003]化疗造成的肠黏膜炎动物模型的建立以前已有报道，其方法为一次性腹腔注射大剂量(20 mg/kg)氨甲喋呤(MTX)造成大鼠肠黏膜损伤。该方法造成的肠黏膜损伤为急性损伤，持续时间一般为4-5天，之后逐渐恢复。也有部分大鼠在该过程中因损伤严重造成死亡。该模型展现了化疗造成的肠黏膜炎的典型发病特征，主要用于评价短期内作用显著的化学药物或单一营养素的治疗效果，但不适合中长期营养支持的整体效果评价。
[0004]化疗是间歇性用药的周期过程。在化疗期间给予患者全面的肠内营养支持不仅可以恢复肠道功能、维护肠黏膜屏障功能，对于加强机体免疫调控能力，促进康复也有积极作用。为了更好的模拟化疗进程，评估中长期营养支持对化疗造成的肠黏膜炎康复促进作用，本申请以SD大鼠(Sprague - Dawley rats)为实验动物,建立了一种大鼠持续性肠黏膜炎模型。该模型与化疗造成的肠黏膜损伤实际情况接近，具有损伤持续周期长，损伤程度呈曲线变化的特点。此外该方法造模简单，并且不会因用药剂量过大造成动物死亡。该模型适用于中长期营养支持的整体效果评价，也可以用于更好的研究化疗造成的肠黏膜损伤对机体的生理病理影响。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供一种适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型，从而可以更好的模拟化疗造成的肠黏膜损伤实际情况，适用于中长期营养支持的整体效果评价，也可以应用于化疗造成的肠黏膜损伤机体的生理病理变化研究。
[0006]本发明的目的之二是提供由上述方法建立的大鼠持续性肠黏膜炎模型建立方法。
[0007]本发明第一个目解决其技术问题采用的技术方案:一种适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型，有以下方法建立:对大鼠腹腔注射氨甲喋呤(MTX) 10mg/kg，分别于第O天和第6天进行两次注射。
[0008] 所述大鼠为SD雄性大鼠，即Sprague-Dawley大鼠，SPF级，雄性，体重200± 10 g,每日光照12 h，室温22~25 °C，整个过程自由饮水及摄食。
[0009]本发明所述氨甲喋呤(MTX)为注射用氨甲喋呤，粉末状，用时以生理盐水配置成10
mg/kgο
[0010]本发明所述大鼠持续性肠黏膜炎全过程从第一次注射MTX开始计算为第O天，第11天结束，全过程一共12天。第11天时该模型仍然维持肠黏膜损伤状态，第12天开始基本恢复至正常。
[0011]本发明第二个目解决其技术问题采用的技术方案:一种适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型的建立方法，对大鼠腹腔注射氨甲喋呤(MTX) 10mg/kg，分别于第O天和第6天进行两次注射。
[0012]所述大鼠为SD雄性大鼠，即Sprague-Dawley大鼠，SPF级,雄性,体重200± 10 g,每日光照12 h，室温22~25 °C，整个过程自由饮水及摄食。
[0013]本发明所述氨甲喋呤(MTX)为注射用氨甲喋呤，粉末状，用时以生理盐水配置成10
mg/kg.
[0014]本发明所述大鼠持续性肠黏膜炎全过程从第一次注射MTX开始计算为第O天，第11天结束，全过程一共12天。第11天时该模型仍然维持肠黏膜损伤状态，第12天开始基本恢复至正常。
[0015]本发明有益的效果是:
1.本发明的建立方法采用小剂量多次注射，可以造成大鼠的肠黏膜组织和功能损伤，通透性增加，引发机体的炎症反应和氧化反应，但不会造成动物死亡。
[0016]2.本发明的建立方法操作简单。并且在该模型基础上，通过对MTX注射剂量的进一步探索，可以继续延长大鼠的肠黏膜炎病程。
[0017]3.本发明提供的模型能够模拟临床实践，具有损伤周期长，损伤程度呈曲线变化，与化疗造成的肠黏膜炎实际情况相似。
[0018]4.本发明提供的模型可以为中长期营养治疗的整体评价提供一个科学合理的研究平台。
[0019]附图表说明
图1A是MTX I组、MTX II组和对照组的大鼠实验期间进食量变化对比。
[0020]图1B是MTX I组、MTX II组和对照组的大鼠实验期间体重变化对比。
[0021]图2 A是注射MTX4天后的对照组的大鼠小肠HE染色切片。
[0022]图2B是注射MTX4天后的MTX II组的大鼠小肠HE染色切片。
[0023]图2C是注射MTX4天后的MTX I组的大鼠小肠HE染色切片。
[0024]图2D是注射MTX5天后的MTX I组的大鼠小肠HE染色切片。
[0025]图2E是注射MTX6天后的MTX I组的大鼠小肠HE染色切片。
[0026]图2F是注射MTXlO天后的MTX I组的大鼠小肠HE染色切片。
[0027]图2G是注射MTXlO天后的MTX II组的大鼠小肠HE染色切片。
[0028]图2H是注射MTXll天后的MTX I组的大鼠小肠HE染色切片。
[0029]图21是注射MTXll天后的MTX II组的大鼠小肠HE染色切片。
[0030]图2J是注射MTX12天后的MTX I组的大鼠小肠HE染色切片。
[0031]图2K是注射MTX12天后的MTX II组的大鼠小肠HE染色切片。
[0032]图3是MTX I组、MTX II组和对照组的大鼠血浆D-乳酸含量对比。
[0033]图4是MTX I组、MTX II组和对照组的大鼠血浆DAO活力对比。
[0034]图5是MTX I组、MTX II组和对照组的大鼠肠黏膜匀浆组织MPO活力对比。
[0035]图6是MTX I组、MTX II组和对照组的大鼠肠黏膜匀浆组织MDA含量对比。
图7是MTX I组、MTX II组和对照组的注射及取样流程图。
【具体实施方式】
[0036]本处所描述的举例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0037]SD大鼠，雄性，体重(200±10)g，每日光照12 h，室温维持在22~25°C。整个适应性喂养及造模过程中均自由饮水及摄食。注射用MTX，用前以生理盐水配置成10 mg/kg。在第O天,SD大鼠腹腔注射MTX 10 mg/kg ο第6天再次腹腔注射MTX 10 mg/kg。第12天肠黏膜损伤基本恢复至正常。
[0038]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面对比了本发明的造模方法与传统的一次性大剂量(20 mg/kg)注射MTX造模方法及其它随机选择的小剂量多次注射MTX (第一次注射MTX 10 mg/kg，第二次注射MTX 5 mg/kg)造模方法。
[0039]1、分组及注射方法
MTX 20 组:一次性注射 MTX 20 mg/kg。
[0040]MTX I组:第O天注射MTX 10 mg/kg,第6天注射MTX 10 mg/kg,为本发明建立的方法。
[0041]MTX II 组:第 O 天注射 MTX 10 mg/kg,第 6 天注射 MTX 5 mg/kg。
[0042]85只SD雄性大鼠适应I周后随机分为对照组(30只)，MTX 20组(10只)，MTX I组和MTX II组(45只)。第O天，MTX 20组大鼠腹腔注射MTX (20 mg/kg)；MTX I组和MTXII组大鼠腹腔注射MTX (10mg/kg)。在第6天将MTX I组和MTX II组随机分为MTX I组(15只)与MTX II组(15只)；MTX I组腹腔注射MTX 10 mg/kg ；MTX II组腹腔注射MTX 5mg/kg。对照组在第O天和第6天均注射等量的生理盐水。MTX 20组在第4天全部处死；其余每组于造模后第4、5、6、10、11、12天各处死5只大鼠，进行指标分析。注射及取样流程如图7所示。
[0043]2、标本收集
乙醚麻醉大鼠，将其仰卧固定于手术台，沿腹部正中切口，首先心脏取血5 ml，置于装有肝素钠的离心管，离心分离血浆后-80°C保存待测。然后分离小肠组织，沿肠系膜纵轴剪开，用冰生理盐水冲洗净，肉眼观察大体形态，同时取距回盲瓣5cm处的3cm回肠组织置于10%中性甲醛溶液中固定，HE染色，光镜下观察组织学改变并评分，1cm处取5 cm小肠称重，-80°C保存待测。
[0044]3、检测指标 (O大鼠体征变化
实验期间观察大鼠进食、体重变化，活动状态，腹泻情况等。
[0045](2)小肠组织形态学观察及损伤评分
小肠组织采用苏木素一伊红(HE)染色、在光镜下观察组织形态学改变。肠粘膜损伤按Chiu氏六级评分法进行组织病理评分。
[0046](3)生化指标D-乳酸、DAO、MP0、MDA含量测定。
[0047]4、数据分析
所有结果均使用SPSS17.0统计软件分析。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Duncan法；两组间比较采用两独立样本的t检验。结果以均数土标准差表示，P〈0.05为差异有显著性意义。
[0048]5、试验结果 (O大鼠体征
造模后注射MTX的各剂量组大鼠进食量、活动量均下降，精神萎靡，嗜睡，躯体蜷缩，毛发粗糙，对刺激反应迟钝。第3天，MTX 20组有7只大鼠腹泻，伴随体重明显下降；MTX I组和MTX II组有31只大鼠腹泻。第4天MTX 20组有3只大鼠死亡，解剖时肉眼观察小肠组织，小肠变苍白，并伴有高度充血水肿现象，肠管扩张，弹性差，易断，严重者有溃疡现象；MTX I组和MTX II组腹泻程度加重。第5天MTX I组和MTX II组腹泻情况和大鼠精神活动状态均开始好转。MTX I组和MTX II组在第4天解剖大鼠后肉眼观察大鼠小肠组织，发现小肠组织呈现苍白色，伴有充血水肿，严重者有溃疡现象，弹性差等，第5天解剖时发现大鼠小肠组织呈现苍白色。而第6天解剖时大鼠小肠组织与对照组无差异。第2次注射MTX后，模型组大鼠症状与第1次注射MTX相似，第10天MTX I组大鼠有5只大鼠腹泻，MTX II组有3只大鼠腹泻，第11天两组大鼠均开始好转，在第10天解剖大鼠后肉眼观察两组大鼠小肠组织均呈现苍白色，肠管扩张，弹性差，易断等，第11、12天解剖时发现大鼠小肠组织与对照组基本无差异，整个实验期间对照组大鼠一切正常。体重、进食量变化如图1中A和B0
[0049](2)大鼠小肠组织HE染色切片观察及小肠组织损伤程度评分
显微镜下观察大鼠HE染色切片，发现对照组大鼠小肠肠壁层次清晰，结构完整，小肠绒毛排列紧密，如图2A ;而1^( 20组大鼠小肠黏膜和黏膜下层间质水肿严重，毛细血管充血；小肠绒毛排列紊乱，高矮不一，大量倒伏、融合，绒毛尖端大量脱落，与固有层分离；隐窝形态消失，杯状细胞缺失，炎症细胞浸润(图2 B)。MTX I组和MTX II组大鼠第4天(图2C)小肠黏膜与MTX 20组形态相似，但损伤程度稍轻；第5天绒毛排列比较整齐，部分绒毛脱落，与固有层分离，如图2D ;第6天大鼠小肠上皮结构比较完整，只有部分绒毛高矮不一，基本恢复正常如图2E。第10天MTX I组大鼠小肠黏膜形态出现小肠绒毛融合、肿大，固有层水肿等(图2 F)，第11、12天大鼠开始慢慢好转，小肠上皮结构也较第10天完整(图2 H,
I,J, KXMTXII组大鼠小肠黏膜损伤程度小于MTX I组，第10天部分绒毛脱落，间质水肿(图2 G)，第11天已经基本恢复正常(图2 I)。
[0050]MTX 20组和MTX I组，MTX II组Chiu评分第4天达到最大，与对照组有显著性区另O，之后慢慢降低。到第6天，MTX I组，MTX II组和对照组Chiu评分仍有显著性；第2次注射氨甲喋呤后，MTX I组和MTX II组Chiu评分在第10天最大，两组与对照组均有显著性差另O，模型组两组之间也有显著性区别，第11天开始两模型组Chiu评分逐渐减小，到12天，三组无显著性差别，如表1所示。
[0051](3)生理生化指标 ①血浆D-乳酸含量
如图3所示，第1次注射MTX后，第4天MTX 20组大鼠血浆中D-乳酸含量明显高于对照组，说明造模后大鼠小肠黏膜受损，通透性增加。MTX I组和MTX II组血浆中D-乳酸含量与对照组也有显著性区别，说明10 mg/kg MTX已经可以导致大鼠小肠黏膜严重损伤。第5天开始，MTX I组和MTX II组血浆中D-乳酸含量逐渐下降。第6天其含量仍显著性高于对照组。第2次注射MTX后，第10天MTX I组和MTX II组血浆中D-乳酸含量达到最大，与对照组均有显著性区别，之后差异逐渐缩小，到第12天，三组大鼠血浆中D-乳酸含量无显著区别。在第10天时两模型组血浆中D-乳酸含量也有显著性差别，MTX I组血浆中D-乳酸含量显著性高于MTX II组。
[0052]②血浆DAO活力
如图4所示，第1次注射MTX后，第4天MTX 20组大鼠血浆中DAO活力明显高于对照组，说明大鼠小肠黏膜损伤，由肠黏膜细胞释放的DAO大量入血，使血中浓度大幅上升，活力增加；MTX I组和MTX II组大鼠血浆中DAO活力与对照组也有显著性区别。第5天开始，MTX I组和MTX II组DAO活力逐渐下降，说明注射MTX后第4天大鼠小肠黏膜损伤最严重，之后逐渐恢复，第6天两组之间无显著性差别。第2次注射MTX后，第10天MTX I组和MTX II组血浆中DAO活力达到最大，与对照组均有显著性区别，之后差异逐渐减小。第12天MTX I Group血浆中DAO活力仍显著性高于对照组，而此时MTX II组和对照组之间已无显著性差别。第10、11和12天两模型组血浆中的DAO活力也有显著性差别，MTX I组血浆中DAO活力均显著性高于MTX II组。
[0053]③小肠组织MPO活力
如图5所示，第1次注射MTX后，第4天MTX 20组大鼠小肠组织中MPO活性明显高于对照组，说明MTX 20组大鼠小肠发生中性粒细胞浸润现象，出现炎症现象；MTX I组和MTXII组大鼠小肠组织MPO 活力与对照组也有显著性区别，说明注射MTX 10 mg/kg后大鼠也有炎症现象发生，且与MTX 20组无显著性差别。第5天开始，MTX I组和MTX II组MPO活力逐渐下降。第6天，两组与对照组之间仍有显著性差别。第2次注射MTX后，第10天MTX I组与MTX II组小肠组织中MPO活力达到最大，与对照组均有显著性区别，之后逐渐减小。到第11天MTX I组与对照组仍有显著性差异，而MTX II组与对照组无显著性差异。到第12天三组之间均无显著性区别。
[0054]④小肠组织MDA含量
如图6所示，第1次注射MTX后，第4天MTX 20组大鼠小肠组织中MDA含量明显高于对照组，说明造模后MTX组大鼠小肠组织内有氧化应激反应存在，小肠组织发生过氧化反应而损伤；MTX I组和MTX II组大鼠小肠组织中MDA含量与对照组也有显著性区别，并且与MTX 20组无显著性差别。第5、6天，MTX组MDA含量逐渐下降，说明注射氨甲喋呤后第4天大鼠小肠组织氧化应激反应最严重，之后逐渐好转。到第6天，MTX I组和MTX II组与对照组之间无显著差别。第2次注射MTX后，第10天，MTX I组小肠组织MDA含量达到最大，与对照组有显著性区别，之后就慢慢减小，到第12天，二者无显著性差别。第10、11天，MTX II组与对照组均无显著差别。到第12天，三组之间均无显著性区别。
[0055]本实验结果表明:
(I)一次性大剂量注射MTX 20 mg/kg可导致大鼠肠黏膜严重损伤，到第4天有30%大鼠死亡。
[0056](2)采用本发明建立的大鼠持续性肠黏膜炎模型建立方法，在第1次注射MTX 10mg/kg后，MTX Group大鼠的体重、进食量下降，有腹泻现象发生，到第4天最严重，D-乳酸含量、DAO活力、MPO活力及MDA含量均达到最高，说明第4天大鼠小肠黏膜损伤最严重，第5天所有指标慢慢下降，直至第6天，大鼠基本恢复正常；第2次注射MTX 10 mg/kg后，大鼠症状与第1次注射MTX后相似，第10天大鼠小肠黏膜损伤最严重，第12天基本恢复正常。两次实验可发现10 mg/kg MTX导致的大鼠小肠黏膜损伤较20 mg/kg轻，连续2次给大鼠注射MTX后无大鼠死亡，且大鼠整个损伤时间可延长到12天左右。该过程与化疗造成的肠黏膜损伤实际情况接近，适合中、长期的整体营养评价治疗。
[0057]目前，大量文献采用一次性注射MTX20 mg/kg造成急性肠黏膜损伤模型。由于MTX能够造成肠道的严重损伤，因此剂量过大容易致死；但是如果MTX剂量过小，损伤程度低，而肠道的自我修复能力较强，则会在较短时间内恢复功能。另一方面，由于机体的耐药性，在反复注射MTX后，肠道损伤情况不会是完全重现之前的状态(本发明中第二次注射MTX后肠黏膜损伤情况明显轻于第一次)，肠黏膜功能状况难以预测，因此MTX注射的时间和剂量设定需要通过大量动物实验结合理论分析，给模型的建立带来了较大难度。
[0058]本技术通过大量实验证明，通过两次间歇性注射10 mg/kg的MTX能够造成明显的大鼠肠黏膜炎，损伤肠黏膜结构和功能，引发炎症和氧化反应。该模型所模拟的肠黏膜损伤过程为持续性损伤，且损伤程度成曲线变化，与化疗造成的肠黏膜损伤实际情况接近。该模型可以为科研和临床提供一个应用平台，以便在此基础上开展对病理机制的研究和营养治疗的评价。
[0059]可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型，其特征在于，由以下方法建立:对大鼠腹腔注射氨甲喋呤10mg/kg，分别于第O天和第6天进行两次注射。
2.根据权利要求1所述的适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型，其特征在于，所述大鼠为SD雄性大鼠，即Sprague-Dawley大鼠，SPF级,雄性,体重200± 10 g,每日光照12 h，室温22~25 °C，整个过程自由饮水及摄食。
3.根据权利要求1所述的适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型，其特征在于，所述氨甲喋呤为注射用氨甲喋呤，粉末状，用时以生理盐水配置成10 mg/kg。
4.根据权利要求1所述的适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型，其特征在于，所述大鼠持续性肠黏膜炎全过程从第一次注射MTX开始计算为第O天，第11天结束，全过程一共12天。
5.一种适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型的建立方法，其特征在于，对大鼠腹腔注射氨甲喋呤10mg/kg，分别于第O天和第6天进行两次注射。
6.根据权利要求5所述的适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型的建立方法，其特征在于，所述大鼠为SD雄性大鼠，即Sprague-Dawley大鼠，SPF级，雄性，体重200±10 g，每日光照12 h，室温22~25°C，整个过程自由饮水及摄食。
7.根据权利要求5所述的适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型的建立方法，其特征在于，所述氨甲喋呤(MTX)为注射用氨甲喋呤，粉末状，用时以生理盐水配置成10 mg/kg。
8.根据权利要求5所述的适用于中长期营养评价的大鼠持续性肠黏膜炎模型的建立方法，其特征在于，所述大鼠持续性肠黏膜炎全过程从第一次注射MTX开始计算为第O天，第11天结束，全过程一共12天。
【文档编号】A61K31/519GK104069111SQ201410243322
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】邓媛元, 张名位, 张瑞芬, 魏振承, 张雁, 唐小俊, 刘磊, 遆慧慧, 马永轩 申请人:广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所