一种锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体及其在制备磁共振成像对比材料中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体及其在制备磁共振成像对比材料中的应用。本发明设计、合成并评价了由锰元素和微量钆组成的杂化“双金属”磁共振成像纳米粒子胶体。研究表明：本发明纳米粒子胶体的高弛豫率来源于纳米粒子核心悬浮的高浓度的油酸锰分子，这些小分子可以渗透过磷脂膜层，接触到水和纳米粒子的临界面。在纳米粒子表面整合微量钆螯合物可以提供额外的弛豫率，从而影响周围质子弛豫效应。本发明的一种锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体能够最大限度减少钆剂负荷，降低钆螯合剂的副作用，改善生物安全性，达到提高纳米粒子r1顺磁性磁共振对比效应的目的。
【专利说明】一种锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体及其在制备磁共振成像对比材料中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种顺磁性纳米粒子胶体(Nanocolloid, NC)的制备及其作为磁共振成像对比剂的应用，特别涉及一种锰钆杂合双金属顺磁性NC制备及其作为磁共振成像对比材料的应用。本发明属于医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]顺磁性和超顺磁性金属一直以来被用做磁共振成像(magnetic resonanceimaging,MRI)的对比材料。其中，镧系金属礼(Gd)是被最广泛研究的,而且礼螯合剂一直作为临床和科研领域最主要的顺磁性血池对比剂。最近钆螯合剂在体内发生金属离子置换及礼离子游离被证实是引发肾源性系统性纤维化(nephrogenic systemic fibrosis, NSF)最主要的原因，这是一种在患有严重肾脏或泌尿系统疾病或肝移植的患者中出现的、罕见的但具有非常严重的副作用的疾病。引起了人们对注射磁共振对比剂进行增强扫描患者的安全性的广泛关注，这直接促使美国食品药品监督管理局(FDA)发布了对钆对比剂的应用警告。从机理上看，与化学性质稳定的大环形礼螯合物(例如，I, 4，7，10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid, I, 4, 7, 10-四氮杂环十二烧-1, 4, 7, 10-四乙酸，简称 D0TA)相比，线性非环状礼螯合物(^Pdiethylenetriamine pentaacetic acid, 二乙烯三胺五乙酸，简称DTPA)更容易促使钆离子发生金属置换。
[0003]以往的研究已经证实，表面负荷高浓度钆螯合剂的全氟化碳NC(30摩尔％，即等同于100000金属离子/纳米粒子)可以用于MRI来敏感的检测新生血管。急性补体系统激活，是自体免疫反应的一个重要分支，有诱发高血压甚至猝死的可能。最近的研究结果表明在脂质NC表面修饰某些功能基团(如螯合钆剂等)可以引起补体系统激活，主要是通过IgM抗体引发的经典通路实现的(R.Virmani, F.D.Kolodgie, A.P.Burke, A.V.Finn, H.K.Gold, T.N.Tulenko, S.P.ffrenn, J.Narula Arter1scler Thromb VascB1l.2005, 25，2054-2061.)(见图1)。在这个事件中，反应强度不仅仅取决于表面电荷，更主要是取决于偶联在脂质膜上的螯合物的化学结构。为了实现Tl加权MRI，本研究在NC表面偶联的钆螯合剂量约为临床批准用于患者钆螯合剂浓度的1/8(100,000金属离子/NC)。虽然环状钆螯合物结构稳定，明显减少了 NSF的风险性，但这类环状螯合物仍然有引起急性补体激活的可能。因此，目前迫切的需要开发一种实现低NSF、低急性补体激活风险、高Tl弛豫对比效应的新型顺磁性NC的化学合成策略。
[0004]以往的研究报道了使用非镧系金属元素(如二价锰和二价铜)的敏感性进行MRI。金属锰(Mn)由于其高效的正性对比增强效果成为最早应用于人体的MRI顺磁性对比材料之一。依据类似“软物质’^NC的概念,本发明探索了油酸猛纳米粒子胶体(manganese oleatenanocolloid, MnOL-NC)在MRI中的应用。NC是由磷脂膜包裹(鸡蛋卵磷脂氯化二棕榈酸磷脂酰胆碱)，设计用于血管内靶向显像(直径>120纳米)(图1e)。二价锰完全浓聚在由浓缩剂(聚山梨酯、失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、杏仁油、菜籽油、甘油或红花油)构成的NC的核心基质中，NC表面具有多重生物靶点特异性靶向配体，用以实现高亲和力和高敏感性的靶向MRI (良好的“粘附和滞留”性质)。
【发明内容】
[0005]针对现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是通过使用非镧系金属作为对比效应金属来明显减少镧系金属的用量达95%以上，从而开发一种可作为MRI对比剂的高Tl弛豫率的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体。
[0006]本发明的目的之二是提供一种制备所述锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体的方法。
[0007]本发明的目的之三是提供所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体在作为MRI对比材料方面的应用。
[0008]为了达到上述目的，本发明所采用的技术手段为:
[0009]本发明设计、合成并评价了由锰元素和微量钆组成的杂化“双金属”MRI纳米粒子胶体(MnOL-Gd NC)。研究表明，该纳米粒子胶体的高弛豫率来源于纳米粒子核心悬浮在浓缩剂(聚山梨酯、失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、杏仁油、菜籽油、甘油或红花油)中的高浓度的MnOL分子，这些小分子可以渗透过磷脂膜层，接触到水和纳米粒子的临界面。在纳米粒子表面整合微量钆螯合剂可以提供额外的弛豫率，从而影响质子弛豫效应，通过这种双顺磁性金属排列来实现协同增强MnOL-NC内在磁偶极子的效应。本发明最终在磷脂膜偶联钆螯合剂浓度为临床批准浓度的1/300，体外和活体动物实验研究结果证实，使用本发明的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(MnOL-Gd NC)能够消除急性补体激活，同时明显改善TlwMRI的能力。
[0010]本发明的一种锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(MnOL-Gd NC)，其特征在于所述的纳米粒子胶体中含有复数个锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子，所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子由内核层和外壳层组成，其中内核层包括二价油酸锰MnOL分子以及作为悬浮介质的浓缩剂，外核层由钆螯合物以及磷脂酰胆碱组成，所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(MnOL-Gd NC)是通过以下方法制备得到的:
[0011](I)在氮气氛围下，将二价油酸锰MnOL悬浮在浓缩剂中，在100-300兆帕和0-25°C条件下加入磷脂表面活性剂，充分混合，其中，所述的磷脂表面活性剂中含有钆螯合物和磷脂酰胆碱；
[0012](2)步骤(I)得到的混合液在25°C?55°C超声浴的条件下反应0.5h?24h，反应过程中始终保持氮气氛围，反应后的溶液在氮气吹扫下封装，即得锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体。
[0013]在本发明中，优选的，所述的二价油酸锰(MnOL)是通过以下方法制备得到的:二价锰化合物同油酸钠(TCI chemical)在乙醇-水-正己烷混合物中先在75_85°C下反应12-16小时，然后在24-26 °C下反应3-5小时，除去溶剂后，制备得到二价MnOL，所述的乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的体积比为3-5:4-6:8-10，更优选的，在乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的体积比为4:5:9。
[0014]在本发明中，优选的，所述的二价锰化合物选自氧化锰(MnO)、氯化锰(MnCl2)、二亚乙基三胺五乙酸锰(Mn-DTPA)和二磷酸双吡哆醛锰(Mn-DTOP)中的一种或多种。
[0015]在本发明中，优选的，所述的浓缩剂为聚山梨酯、失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、杏仁油、菜籽油、甘油或红花油中的一种或几种的组合。
[0016]在本发明中，优选的，所述的聚山梨酯为聚山梨酯80。
[0017]在本发明中，优选的，二价油酸锰MnOL的质量(g)与浓缩剂的体积(ml)比为1:1.5-2.5，优选 1:2。
[0018]在本发明中，优选的，所加入的磷脂表面活性剂的终浓度为0.015-0.025g/ml，优选 0.02g/mlo
[0019]在本发明中，优选的，所述的磷脂表面活性剂中含有0.l-50mol %的钆螯合物以及5OmoI % -99.9mol %的磷脂酰胆碱。
[0020]在本发明中，优选的，所述的钆螯合物包括钆-轮环藤宁四乙酸四乙酸磷脂酰乙醇胺(Gd-DOTA-ΡΕ)、钆-二乙撑三胺五乙酸油酸双酯(Gd-DTPA-BOA)、钆双胺(gadodiamide)、马根维显(gadopentetate dimeglumine)及礼弗塞胺(gadoversetamide)中的一种或多种。
[0021]其中，Gd-DOTA-ΡΕ以及 Gd-DTPA-BOA 的制备方法可参见文献:Schmieder, A.H.，P.M.Winter,et al.(2013)."Molecular MR Imaging of Neovascular Progress1n inthe Vx2Tumor with alphavbeta3_Targeted Paramagnetic Nanoparticles."Rad1logy268(2):470-480.
[0022]在本发明中，优选的，混合液在37°C?40°C超声浴的条件下反应0.5h?24h。
[0023]进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(MnOL-Gd NC)在制备MRI对比粒子中的应用。
[0024]相较于现有技术，本发明的一种锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(MnOL-GdNC)能够实现最大限度减少钆剂的负荷，降低钆螯合剂的副作用(如肾源性系统性纤维化和急性补体激活的发生)，改善的生物安全性，提高rl顺磁性MRI对比效应的目的，并且可以在磷脂膜表面偶联新生血管特异性生物靶点的靶向配体，通过MRI方法检测表达含量低的新生血管整合素(如ανβ3)，从而用于肿瘤新生血管靶向分子成像。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为线性DTPA(图a，c)和环状DOTA(图b, d)钆对比剂的结构示意图及其相应副作用；图(e)为第一代单金属油酸猛(manganese (II) oleate nanoparticles, MnOL)纳米粒子:二价MnOL纳米粒子的示意图；图c、d显示出Gd-DTPA-BOA具有短链化学结构，Gd-DOTA-ΡΕ有长链的化学结构；
[0026]图2为本发明的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子的示意图；
[0027]图2a说明表面整合Gd的MnOL纳米粒子胶体(右)较等浓度MnOL纳米粒子(左)有增强的rl弛豫率；图2b说明锰核心和钆放置在磷脂膜表面的两种方案:钆可以通过不同长度的偶联配体(或称短连接物或长连接物)连接到粒子表面；
[0028]图3为锰-钆纳米粒子(MnOL-Gd NC)的物理化学性质表征；
[0029]图3a为1.25mol % MnOL-Gd纳米粒子的透射电镜图像；图3b为透射电镜测量粒子尺寸分布；图3c为原子力显微镜测得纳米粒子高度；图3d为固定内核层油酸锰的含量，分别改变表面螯合的Gd-DOTA-ΡΕ和Gd-DTPA-BOA的含量所得到的纳米粒子粒径、多分散系数及表面电荷；图3e为相同锰浓度，表面不同钆浓度的MnOL-Gd纳米粒子rl弛豫率柱形图比较，磷脂膜包裹的MnOL浓度为10% v/v,粒子表面物质中整合不同浓度Gd-DTPA-BOA或Gd-DOTA-ΡΕ ;金属含量用摩尔％表示，弛豫率通过回归直线的斜率土标准误表示；动态光散射法测得胶体粒径值，用纳米(nm)表示；zeta电位用毫伏(mV)表示；
[0030]图4a_b虚线箭头所指曲线代表MnOL-Gd-NC浓度_ /[目号曲线，而空心箭头所指曲线代表MnOL-NC浓度-信号曲线，图4c表格列出不同样本中的金属离子和NC的弛豫率，单位为(s.mmol)；
[0031 ] 图5A为体外补体激活CH50法检测，显示相对于正常人血清或对照组NC，MnOL-Gd-NC没有引起补体激活；而阳性对照样本(例如30mol % Gd-DOTA-ΡΕ或50mol %DOTAP -PE的PFC-NC)明显激活补体系统；图5B为C3a酶联免疫吸附试验显示了相似的结果；相对于阴性对照组小鼠，MnOL-Gd NC几乎不引起补体激活，虽然在表面整合1.25mol%和2.5mol % Gd-DOTA-ΡΕ的MnOL-Gd NC检测组出现了小的改变，但改变具有统计学意义；这些改变相对于阳性对照组(α νβ3-靶向性20mol%Gd DOTA-PE NC和50mol % DOTAP-PENC)很微小；
[0032]图6A为1.25mol% Gd-DOTA-ΡΕ MnOL NC的示意图，说明NC核心是由悬浮在聚山梨酯80中的高浓度MnOL小分子组成，表面由磷脂膜包裹，并偶联亲脂性螯合剂；通过高度特异性靶向内皮细胞表达的整合素α νβ 3的喹诺酮类结构的多肽类似物偶联到PEG2000上，通过一种修饰后的磷脂锚定在NC表面活性物质上，从而实现NC靶向整合素α ν β 3的功能化；图68为测定水合粒径为138 ±10 (Dav)/nm，多分散性系数为0.06 ;图6(:为NC的扫描电镜图像，图6D为原子力显微镜(atomic force microscopy, AFM)图像,粒径测量结果与电镜结果一致；
[0033]图7A到E为典型的高脂饮食饲养的兔经静脉注射α ν β 3-Mn0L-Gd NC对比剂120分钟后，胸部降主动脉管壁信号强化随时间逐渐增强(采用3D Tlw脂肪抑制、黑血、自旋回波的扫描序列)；由于扫描序列的黑血功能，从基线图像到增强后的图像，胸部降主动脉管腔中始终没有血池信号的干扰，因此血管壁的信号强化特异性更强；从基线到注射对比剂2小时后过程中，新生血管的强化信号的空间分布在血管壁中逐渐范围增大，且强化信号强度逐渐增强；图7F显示在120分钟时间段内该层面横截段所有像素平均信号增强程度随时间呈单指数增加，与胸主动脉Tlw信号增强映像图相一致；
[0034]图8为高脂饮食饲养兔注射靶向性或非靶向性MnOL-Gd NC,对比正常饮食饲养兔注射靶向性MnOL-Gd NC ；
[0035]上排图表显示新生血管系数，下排图表显示动脉壁强化百分比的各组对比情况；定量化数据分析结构显示比较三组新生血管系数(强化像素数X信号强化百分比)和强化像素百分比，注射整合素α νβ 3靶向性MnOL-Gd NC的高脂饮食兔主动脉新生血管强化明显高于高脂饮食的非靶向组和正常饮食的靶向组；主要对比强化出现在主动脉壁内半部分(主要是斑块区域)；
[0036]图9Α为注射α νβ 3-整合素靶向性MnOL-Gd NC后的图主动脉的苏木素伊红(HE)染色结果，而图9D图显示相邻层面组织切片的荧光成像(ανβ 3-整合素靶向性MnOL-GdNC上标记有Alexafluor 594荧光染料)，纳米粒子出现在外膜、基质及增厚的内膜区；图9Β和E图显示高脂饮食饲养的兔动脉粥样硬化斑块模型注射非靶向性MnOL-Gd NC后的主动脉的HE染色及荧光成像结果；纳米粒子的荧光分布与图9D图相似，但每层主动脉切片上分布的含量远远低于高脂饮食的靶向成像组；图9C和图9F显示正常饮食饲养兔的主动脉及其外膜的HE染色及荧光成像结果，在外膜中可以观察到非常稀疏的AlexaFluor 594标记的ανβ 3-整合素靶向性MnOL-Gd NC，基质和内膜层更少(——200 μ m，——200 μ m)；
[0037]图10为注射整合素α ν β 3靶向性MnOL-Gd NC 6小时后各种组织内Mn2+和Gd3+的含量。
【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0039]实施例1锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(MnOL- (1.25mol % ) Gd-DOTA-PENC)的制备。
[0040]用两步法合成猛礼杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(MnOL-Gd NC)。
[0041]1、将360ml乙醇-水-正己烷混合物加入500ml圆底烧瓶中，向圆底烧瓶中加入1g四水氯化锰(MnCl2.4H20)以及40g油酸钠(TCI chemical)，80°C下反应14小时，随后在25V反应4小时，经水洗、盐洗、Na2SO4干燥以及旋转蒸干除去溶剂后，制备得到二价MnOL，其中，乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的体积比为4:5:9 ;
[0042]2、在氮气氛围下，将1g 二价MnOL悬浮在20mL作为内在基质的失水山梨醇倍半油酸酯(sorbitan sesqu1leate)中，在141兆帕和4°C条件下,加入磷脂表面活性剂,充分混合，其中所加入的磷脂表面活性剂的终浓度为0.02g/ml，所述的磷脂表面活性剂中含有
1.25mol %的钆螯合物Gd-DOTA-ΡΕ以及98.75mol %的磷脂酰胆碱；
[0043]3、混合液在37°C超声浴的条件下反应10h，反应过程中始终保持氮气氛围，反应后的溶液在氮气吹扫下封装，即制成杂化MnOL-(1.25mol% ) Gd-DOTA-ΡΕ NC。
[0044]实施例2锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(MnOL- (1.25mol % ) Gd-DTPA-BOANC)的制备
[0045]用两步法合成猛礼杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(MnOL-Gd NC)。
[0046]1、将360ml乙醇-水-正己烷混合物加入500ml圆底烧瓶中，向圆底烧瓶中加入1g四水氯化锰(MnCl2.4H20)以及40g油酸钠(TCI chemical)，80°C下反应14小时，随后在25 V反应4小时，旋转蒸发除去溶剂后，制备得到二价MnOL，其中，乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的体积比为4:5:9 ;
[0047]2、在氮气氛围下，将1g 二价MnOL悬浮在20mL作为内在基质的聚山梨酯80中，在141兆帕和4°C条件下，加入磷脂表面活性剂，充分混合，其中所加入的磷脂表面活性剂的终浓度为0.02g/ml，所述的磷脂表面活性剂含有1.25mol%的钆螯合物Gd-DTPA-BOA以及98.75m0l%的磷脂酰胆碱；
[0048]3、混合液在40°C超声浴的条件下反应0.5h，反应过程中始终保持氮气氛围，反应后的溶液在氮气吹扫下封装，即得杂化MnOL-(1.25mol% ) Gd-DTPA-BOA NC。
[0049]实施例3锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(MnOL-(2.5mol % )Gd-DOTA-PENC)的制备
[0050]用两步法合成猛礼杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体MnOL-Gd NC。
[0051]1、将360ml乙醇-水-正己烷混合物加入500ml圆底烧瓶中，向圆底烧瓶中加入1g四水氯化锰(MnCl2.4H20)以及40g油酸钠(TCI chemical)，75°C下反应16小时，随后在24V反应5小时，旋转蒸发除去溶剂后，制备得到二价MnOL，其中，乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的体积比为5:5:8 ;
[0052]2、在氮气氛围下，将1g 二价MnOL悬浮在25mL作为内在基质的聚山梨酯80中，在150兆帕和20°C条件下，加入磷脂表面活性剂，充分混合，其中所加入的磷脂表面活性剂的终浓度为0.025g/ml，所述的磷脂表面活性剂含有2.5mol %的钆螯合物Gd-DOTA-ΡΕ以及97.5m0l%的磷脂酰胆碱；
[0053]3、混合液在37°C超声浴的条件下反应5h，反应过程中始终保持氮气氛围，反应后的溶液在氮气吹扫下封装，即得即得杂化MnOL-(2.5mol% ) Gd-DOTA-ΡΕ纳米粒子胶体。
[0054]实施例4锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体(MnOL-Gd NC)在MRI中的应用
[0055]1、磁共振成像参数的优化:
[0056]所有MRI均在飞利浦临床用3.0T磁共振扫描仪上完成，体外实验应用标准鸟笼式线圈。按照本发明的方法制备表面偶联不同浓度及类型钆剂(Gd-DOTA-ΡΕ或Gd-DTPA-BOA)的MnOL-Gd NC，如图2(a-b)显示了两种合成方案。Gd-DTPA-BOA通过配对酰基插入脂质膜表面，将钆原子放置在水和粒子界面附近。而Gd-DOTA-ΡΕ中的Gd原子则超越粒子表面，进一步伸入到周围介质中。
[0057]实验选择和优化了顺磁性脂质螯合物，磷脂膜表面活化剂混合滴定浓度为0，0.6，
1.25，2.5，5.0,10.0 和 30 摩尔 % 的 Gd-DOTA-ΡΕ 或 Gd-DTPA-BOA0 在 MnOL 制备程序中，二价MnOL是由四水氯化锰(MnCl2.4H20)同油酸钠在乙醇-水-正己烷混合物(乙醇、水以及正己烷的体积比为4:5:9)中反应80°C 14小时和常温下4小时制备而成的。MnOL悬浮在作为内在基质的聚山梨酯80或去水山梨糖醇二油酸酯中，在141兆帕和4°C条件下与磷脂表面活性剂充分混合。磷脂表面活性剂内含有上述不同浓度及类型的钆螯合物和不同浓度的磷脂酰胆碱(PC)，钆螯合物和磷脂酰胆碱的摩尔百分数之和为100% (图3a)。同时也制备表面含有相同浓度钆，核心由杏仁油为粒子核心的NC作为对照试剂。
[0058]NC弛豫时间测量采用Look-Locker翻转恢复序列(回波时间/重复时间/角度:
1.48ms/3000ms/10° ;采集矩阵:272像素X 270像素；层厚:6mm ;信号平均数:4 ;分辨率:0.4mmX 0.4mm)。180°预脉冲后，采集21个梯度回波图像，相位间距53ms ;所有的测量均重复3次。横向弛豫时间的测定采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)序列(润流自旋回波参数TSE factor:30 ;回波时间/重复时间/角度:40ms/132ms/90° ;采集矩阵:204像素X 204像素；层厚:6mm ;信号平均数:4 ;分辨率:0.8mmX 0.8mm)。金属离子浓度和NC浓度rl和r2弛豫率均通过线性最小二乘法弛豫率回归线与锰离子、钆粒子浓度或NC浓度对应函数求得。
[0059]为进行光学成像，示踪纳米粒子胶体(NC)在组织中的位置，在上述制备得到的纳米粒子表面的磷脂膜上分别整合0.5m0l%偶联AlexaFluor 594的己酰基磷脂酰乙醇胺(Life Technologies ；Avanti Polar Lipids),具体方法如下:
[0060]将偶联AlexaFluor 594的己酰基磷脂酰乙醇胺溶于DMF中，加入溶于氯仿中的磷脂分子羧基化的上述制备得到MnOL-Gd NC，在氩气气氛下反应5小时，通过TLC板检测反应进行程度，所得溶液加入氯仿溶剂进行减压蒸馏浓缩，获得的粗产物通过凝胶过滤色谱纯化，纯化后的产物真空干燥，得到在粒子表面的磷脂膜上整合0.5mol % AlexaFluor 594的复合NC。
[0061]在上述NC中，经电感偶合等离子体发射光谱仪(ICP-0ES，PerkinElmer, Waltham, MA)测定核心的猛和表面礼浓度。原子力显微镜(NanotechnologyResearch Facility, Washington University)测定额定粒子尺寸。Zeta Plus 仪(Brookhaven Instrument Corp., Holtsville, NY)测量粒子 ζ 电位。
[0062]测量结果:
[0063]图3e显示MnOL-Gd NC在整合很低浓度Gd-DOTA-PE的情况下即可达到很高的弛豫率。Gd-DTPA-BOA可以达到相似的rl弛豫率，但需要更高的钆螯合剂负荷。整合Gd-DTPA-BOA的NC可以观察到T2*效应，在表面浓度为30mol %也可以观察到。Gd-DOTA-PENC在5m0l%浓度时测量rl也早期的预示了 T2*效应引起的弛豫率的下降。超低表面浓度的Gd-DOTA-ΡΕ从0.6至5mol%产生的rl弛豫率相似，均接近峰值。
[0064]因此，作为一种典型代表，选用杂化MnOL-(1.25mol% ) Gd-DOTA-PENC进行进一步研究，其动态光散射测得流体粒子直径138±10nm，(多分散性指数:0.06)，负性ζ电位(-27±2mV)(图3)。在这种NC中，经电感偶合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测得核心的锰浓度为20.2±0.02mM Mn/ml，相对应为每个NC中约含124，000个锰原子。表面钆负荷为0.36±0.02mM Gd/ml，相对应为每个NC中约含1700个钆原子。原子力显微镜观察NC的无水形态证实锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子为球形。
[0065]2、弛豫率的测定
[0066]用反转恢复序列(如Look - Locker 法:D.C.Look, D.R.Locker, Rev SciInstrum.1970, 41，250-251.)在25°C条件下对样本进行3.0T MR单层扫描，计算系列浓度稀释样本的离子浓度(单位浓度金属离子)和粒子浓度(单位浓度NC)对应的rl弛豫率；同样，用多回波自旋回波法测量r2弛豫率(图4)。离子浓度和NC浓度弛豫率(rl和r2)通过线性最小二乘法测锰和钆离子浓度或NC浓度对应弛豫率的斜率测得。比较rl和r2弛豫率来确定能实现最优化rl和rl/r2比率的最小钆浓度。3.0T磁场25°C条件下MnOL-GdNC的MR弛豫率，包括锰原子核和钆原子成分对NC弛豫率的各自贡献，均通过相应金属等摩尔浓度和相同NC浓度条件下进行测量。杂化MnOL-Gd NC的MR弛豫率比起不含钆的MnOL、只表面含钆(核心不含锰)以及将MnOL NC和只含Gd不含锰的NC按MnOL-Gd NC内Mn与Gd相应浓度比例混合的这三种NC进行比较。(图4c)。
[0067]MnOL NC与表面仅含钆核心不含锰的NC混合样本的粒子浓度弛豫率是607，504± 13，578 (s.mmol [MnOL+Gd-only NC])-1),非常接近测得的 MnOL NC 弛豫率同表面仅含钆核心不含锰的NC的弛豫率二者之和，而杂化MnOL-Gd NC的弛豫率为748，199 ±30，464 (s.mmol [ManOL-Gd NC])-1，较上述两种NC混合后的弛豫率提高25%以上，这表明在杂化MnOL-Gd NC表面偶联的三价钆离子和核心的二价锰离子之间存在着磁性协同作用，而这种协同作用明显的受到钆粒子的位置相对于NC表面距离的影响。将三价钆离子的位置向外伸出、略远离NC表面将在两种顺磁性金属之间产生增强的磁性相互作用，而将三价钆离子的紧贴近NC与周围水分子接触表面时，两种顺磁性金属之间的磁性相互作用明显减弱。MnOL-Gd粒子、MnOL粒子和MnOL与仅含Gd的粒子混合样本的金属离子浓度和NC浓度下的r2弛豫率相近似。正是基于这个优化实验，我们选择表面带有1.25mole%Gd (Gd-DOTA-ΡΕ)的 MnOL-Gd NC 进行进一步研究。
[0068]3、MnOL-Gd NC的补体激活实验
[0069]3.1准备抗体敏感的绵羊红细胞(sheep erythrocytes, EA,方法参照2000年Morgan等人的研究)
[0070]将5ml 阿尔塞弗溶液中的绵羊红细胞(Colorado Serum Company, catalog#31112)清洗三遍，并悬浮在50ml达尔贝科PBS溶液(DPBS ；Sigma, St.Louis, MO)中，然后等分在两个离心管中。同时将 100μ1 溶血素(Haemolysin, Cedar Lane Labs, catalog#CL9000)加入50ml DPBS中制备敏感抗体。细胞与抗体分别在37°C孵箱中预先孵育10分钟，然后将25ml敏感抗体分别加入到每管细胞中，轻轻震荡。将细胞-抗体混合物放入孵箱中的摇床上在37°C孵育30分钟，然后将离心细胞在50ml浓度为1mM EDTA缓冲液中洗涤两次，在含有0.1M鹿糖的明胶佛罗那缓冲液(gelatin veronal buffer, GVB2+)中洗漆两次。细胞在含有0.1M蔗糖的40ml GVB2+中悬浮，在4°C条件下储存2周。在正式检测之前，将敏感细胞洗涤2次，用4°C 3-4倍体积的GVB2+中悬浮。
[0071]3.2补体激活-纳米粒子胶体依赖性C活化/50%补体溶血活性(50% complementhemolytic activity, CH50)分析
[0072]用表面偶联0.6、1.25 和 2.5mol % Gd-DOTA-ΡΕ 的 MnOL-Gd NC 进行 CH50 溶血试验，以检测NC对补体激活的影响。为了定量化NC激活人体补体的能力，我们比较了 NC处理过的血清和未处理的对照组血清溶解抗体敏感性绵羊红细胞的能力。最终NC(10% ν/ν)与加入到含有Mg2+和Ca2+明胶佛罗那缓冲液(GVB2+)中，其内有含量为10%混合人血清(CompTech:Tyler, TX)，总体积为150 μ 1，在37°C条件下孵育30分钟。然后将反应混合物放入4°C冰箱中冷却，用GVB2+溶液稀释至800 μ I。通过一系列反应绘制滴定曲线，每个反应包含150 μ I不同比例稀释的上清液，其内加入体积为100 μ I的5Χ 17抗体敏感的绵羊红细胞(sheep erythrocytes, EA)。反应在37°C孵箱中震荡一小时，再用667 μ I的GVB2+溶液稀释后进行离心(1000g，5min)。细胞裂解程度通过测量A414来确定。由EA混合水的对照反应测得完全细胞溶解的值。NC处理后血清的残余活性与仅用缓冲液处理的血清的残余补体活性进行比较。Z值是每个细胞裂解位点的平均数。所用公式为Z =-1n (1-y)，其中I是细胞溶解分数。CH50等于导致50%细胞裂解的血清稀释因子(Z = 0.69)。
[0073]3.3活体动物C补体激活_C3a酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbentassay, ELISA)。
[0074]采用小鼠尾静脉注射PBS溶液(对照组)或按体重注射5 μ 1/gMnOL-Gd NC (实验组)30分钟后采集血浆进行C3a ELISA。进行C3a ELISA的细胞培养板用抗小鼠C3a (4 μ g/mL)单克隆抗体(BD Pharmingen)覆盖后在4°C冰箱中过夜。用I %牛血清白蛋白封闭后，细胞培养板与样品(100 μ I新鲜血浆按1:100稀释)在室温下共同孵育2小时，随后加入生物素化的抗小鼠C3a(250ng/ml)单克隆抗体(BD Pharmingen)。将链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(400ng/ml ;Sigma),过氧化物-色原体溶液(R&D Systems)加入每孔中孵育,用色谱仪 SpectraMax Plus reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif)在 450nm 读数。小鼠重组C3a(BD Pharmingen)用于建立标准曲线。
[0075]4、结果
[0076]4.1新型杂化金属MnOL-Gd NC的合成、优化及特化
[0077]通过多种分析技术方法特化MnOL NC。动态光散射法检测在本实验中应用的MnOL-Gd NC 粒子水合半径为 138± 10nm(多分散性指数(polydispersity indexes, PDI)为 0.06) ο 基于 Zeta Plus 仪(Brookhaven Instrument Corp., Holtsville, NY)测量粒子ζ电位，测得的负电势U)值为(-27mV±2mV)证实粒子稳定性和磷脂膜包裹成功。纳米粒子胶体的核心是二价MnOL，浓度是2.93±0.02mM Mn/ml，等同于每个NC含有165718个Mn2+原子，NC的表面是亲脂性Gd-DOTA，浓度是0.1lmM Gd/ml，等同于每个纳米粒子胶体含有1372个Gd3+原子，体积百分比是1.25mole%0
[0078]能够反映应用1.25mol % Gd螯合物酰胺偶联的MnOL NC后，每个结合位点(即单个NC)实现的信号效果，测量及计算得出MnOL-Gd的金属离子基和NC基弛豫率如下:MnOL-Gd NC rl金属离子基和NC基弛豫率分别为7.8±0.3 (秒.毫摩尔[Mn+Gd])-1和955148.3±86971.9(秒.毫摩尔[MnOL-Gd NC]);r2金属离子基和NC基弛豫率分别为85.7±1.2 秒.毫摩尔[Mn+Gd])' 4018318.5±320493.4(秒.毫摩尔[MnOL-Gd NC])'
[0079]4.2人血清中补体激活检测实验:
[0080]在体外人血清中用表面整合有0.6、1.25和2.5mole % Gd (Gd-DOTA-ΡΕ)的MnOL-Gd NC分别进行50%补体溶血活性(CH50法)补体激活溶血实验[K.Whaley, Methodsin complement for clinical immunologists.New York:Churchill Livingstone ；1985，77-139]。在该方法中，强补体激活反应造成完整血清补体C3及其他补体成分的裂解和清除，通过测量血清裂解绵羊抗体敏感性红细胞(ery throcy te-ant ibody-complement, EA)能力，来判定与纳米材料孵育过的血清中残余补体的活性。本实验合成的ManOL-Gd NC与下述的阴性和阳性对照进行比较，未经过纳米粒子孵育过的正常人血清以及与表面未经过功能修饰的NC共同孵育的血清作为两种阴性对照，表面偶联30mOl%Gd-DOTA-ΡΕ的ανβ3靶向性全氟化碳纳米粒子胶体(PFC NC)以及表面偶联50%阳离子N-[1-(2，3- 二油酰基氧)丙基]-N，N, N-三甲氨甲基硫酸酯NC(简称DOTAP)-磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)的PFC NC作为两种阳性对照。图5A显示，在体外，分别与表面带有0.6,1.25和2.5mole% Gd (Gd-DOTA-ΡΕ)的MnOL-Gd NC共同孵育的血清中存留补体的活性与阴性对照组相比没有明显差异(p>0.05)。与之相对照的是，表面携带30mol % Gd-DOTA-ΡΕ的PFC NC孵育的血清中补体活性与阴性对照组相比明显降低(ρ〈0.05)，加入50mol % DOTAP - PE的PFC NC的阳性对照引起的补体激活程度最高(p〈0.01)，实际上血清中补体成分已经完全耗竭。
[0081 ] 4.3活体小鼠补体激活实验
[0082]为了证实和进一步延伸体外实验的结果，(共计33只小鼠，每个实验组彡5只)采用C3a酶联免疫吸附实验进一步验证表面整合有0.6,1.25和2.5mole% Gd(Gd-DOTA-PE)的MnOL-Gd NC诱导补体激活的能力，即致敏性。以往的文献已经证实这种活体动物模型非常适宜检测材料的补体激活特性。按每公斤体重5μ I的量分别向各组检测小鼠尾静脉注射 MnOL-Gd NCs、α ν β 3-靶向性 Gd-DOTA-ΡΕ (20mol% )PFC NC 或者 50 % DOTAP-PE PFC NC。这些临床前动物注射剂量是临床患者常规注射剂量(lul/kg)的5倍以上。注射对比剂30分钟后处死动物，通过测量补体C3a的产生来判断补体激活情况(见图SB^Pham C等已经报道了 20moI % Gd-DOTA-ΡΕ PFC NC和50% DOTAP-PE PFC NC可以在小鼠体内引起强烈的补体激活，而本研究中接受表面各种低浓度钆螯合剂(0.6,1.25和2.5mole% Gd-DOTA-ΡΕ)偶联的MnOL-Gd NCs注射的小鼠引起的补体激活反应与阳性对照组相比都是可以忽略的。与阴性对照组小鼠相比，注射0.6mol% Gd-DOTA-ΡΕ MnOL-Gd NCs组小鼠没有增加C3的裂解，而1.25和2.5mol% Gd-DOTA-ΡΕ MnOL-Gd NCs组小鼠出现的C3激活出现轻度增加，虽然这种与阴性对照组的差别是有统计学意义的，该结果也说明了这种活体检查方法的敏感性和准确性。
[0083]综合上述体外人血清实验和活体小鼠实验结果，均表明表面偶联低浓度Gd-DOTA-ΡΕ以增强MnOL NC弛豫率的方法对补体激活的影响与阴性对照组相比是轻微的，可以忽略不计的，与阳性对照组相比，补体激活的强度明显减低。
[0084]实施例5整合素α ν β 3靶向性MnOL-Gd NC在新生血管成像中的应用
[0085]1、方法
[0086]在选择用于活体成像的纳米粒子(L 25mol% Gd-DOTA-NH2-PE MnOL-Gd NC，简称MnOL-Gd NC)的磷脂膜表面偶联浓度为0.5mol % AlexaFluor 594标记的己酰基-磷脂酰乙醇胺(Life Technologies ；Avanti Polar Lipids),用于组织突光显微镜成像。电感率禹合等离子体光学发射光谱法(ICP 0ES, Perkin Elmer)证实Mn和Gd的浓度。
[0087]为实现靶向性，在粒子表面偶联0.1摩尔％整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺的整合素ανβ3拮抗物(美国密苏里州圣路易斯市kereos公司)和98.65摩尔％的磷脂酰胆碱(PC)，0.1摩尔％喹诺酮衍生的整合素α νβ 3多肽类似物拮抗物通过聚乙二醇2000偶联到磷脂酰乙醇胺上，见图6，具体制备方法包括如下步骤:在氮气氛围下，将1g 二价MnOL悬浮在20mL作为浓缩剂的失水山梨醇倍半油酸酯(sorbitan sesqu1leate)中，在141兆帕和4°C条件下，加入磷脂表面活性剂，充分混合，所述的磷脂表面活性剂包括0.1摩尔％甲萘醌二甲嘧啶亚硫酸盐-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPB-PEG-DSPE)、0.1摩尔％的整合素ανβ3拮抗物(美国密苏里州圣路易斯市kereos公司)、1.25摩尔％的钆螯合物Gd-DOTA-ΡΕ和98.55摩尔％的磷脂酰胆碱。混合液在37°C超声浴的条件下反应1h,反应过程中始终保持氮气氛围，反应后的溶液在用氮气吹扫下封装，即得表面偶联0.1摩尔％整合聚乙二醇2000磷脂酰乙醇胺的整合素α νβ 3拮抗物、1.25摩尔％的钆类螯合物Gd-DOTA-ΡΕ以及98.65摩尔％的磷脂酰胆碱的整合素α ν β 3靶向性锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体。
[0088]新生血管靶向结合物选用由勃列斯多.迈耶.施贵宝医学成像公司开发的ανβ3-整合素喹诺酮非肽类拮抗配体(美国专利号6，511，648和相关专利)，最初的研究曾经报道过应用铟111 (111In)-DOTA共轭RP476和靛青染料Cy5.5类似物TA145。每个靶向纳米粒子上约含有300个ανβ3-整合素拮抗配体，半抑制浓度(IC50)为50皮摩尔(Kereos, Inc., St.Louis, MO, USA)。以往的研究,利用在血管内全氟化碳纳米粒子通过活体竞争性抑制临床前动物实验、风湿性关节炎模型及应用基质胶(Matrigel?)嵌入物的RagltmlMom Tg (TIE-2-lacZ) 182-Sato 转基因鼠(Jackson Labs, Bar Harbor, ME)中，均研究了这种结合物的靶向特异性。以往的研究也报道了具有这种结合物和表面化学结构的111In-Q νβ 3-整合素靶向性纳米粒子的药代动力学和生物学分布研究结果。
[0089]1.1、高脂饮食饲养新西兰大白兔实验:
[0090]作为可用杂化QvP3-MnOL-Gd NC成像新生血管生成的活体概念佐证，采用0.25%胆固醇含量的高脂饮食饲养12个月的雄性新西兰大白兔动脉(Charles RiverLaboratories)粥样硬化模型中进行斑块新生血管生成的MR分子成像:其中高脂饮食兔模型16只，分成两组，每组8只，分别通过耳缘静脉注射整合素α νβ 3靶向性超低浓度(1.25mol % )礼剂偶联油酸猛纳米粒子胶体(α νβ 3_integrin - targetedGd-MnOL-hybrid nanocolloids, α vβ 3-Gd-MnOL_NC)和整合素 ct vβ 3 非革巴向性超低浓度(1.25mol% )礼剂偶联油酸猛纳米粒子胶体(nontargeted(NT)-Gd-MnOL NC);同月龄正常饮食对照组兔模型8只，通过耳缘静脉注射α νβ 3-Gd-Mn0L-NC。
[0091]兔经注射基础麻醉药后，用2%异氟醚进行维持麻醉。兔胸主动脉斑块新生血管生成的MR分子成像；各组模型在注射对比剂之前及之后30、60、90和120分钟用3.0T磁共振(magnetic resonance, MR)采用脂肪抑制、黑血、润旋自旋回声Tlw序列连续成像2小时。扫描参数如下:涡旋回波系数=30,重复时间/回波时间=380/1 Ims,分辨率=250 μ mX250 μ mX4mm, 20层，信号平均数(NSA) = 14，扫描时间约为15.6min。每只动物的扫描范围都是从左锁骨下动脉到膈肌水平的胸主动脉，共20层图像。流入的血液信号通过放置在成像采集带上部和下部的预饱和带屏蔽掉。通过频率选择衰减翻转恢复技术实现脂肪抑制。MR成像后，兔模型经安乐死后，切除主要脏器、主动脉及周围的外膜进行显微镜分析。
[0092]MR图像处理:采用半自动分段程序处理及平均化所有图像中胸主动脉的MRI增强信号。简要的说，采用基于MATLAB (The Mathfforks, Inc., MA)软件的种子区域生长算法，在每一幅2D图像中定义主动脉管腔。主动脉壁是由管腔阴影扩张之后通过自动阈值以获取覆盖整个主动脉壁的一致和客观的感兴趣区域(ROI)。当经MATLAB算法定义的ROI超出主动脉壁范围时，通过手动连接R0I，以修正范围。通常，每只兔采集图像组两端要舍弃2-4幅图像，主要是由于脂肪抑制不均，或由于线圈位置造成图像信号衰减。
[0093]每层图像的信号强度与放在图像视野内的体外参照物【离心管中密闭的浓度为25mol/l钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)盐水溶液】相比较后进行标准化处理。注射对比剂2小时后的信号强度和基线信号均与肌肉信号强度相除后进行标准化处理。增强像素的阈值等于基线主动脉壁信号的平均值加2倍的标准差。计算每层图像增强像素占ROI总像素的百分比面积，并将最终选定的每只动物所扫描主动脉的图像百分比进行平均化。连续增强像素组在平面内或连续平面之间定义为簇。对比强化系数定义为各簇强化像素数乘以该簇内平均强化百分比。将全胸降主动脉对比强化系数相加，作为每只动物模型的胸降主动脉强化值进行分析。凡是没有组织病理学结果证实斑块存在的高脂饮食兔都排除出成像数据统计分析。最终纳入成像数据分析的各组动物数分别为:高脂饮食靶向组7只；高脂饮食非靶向组6只；正常饮食祀向组8只。(图像定量方法可参见文献:Winter PM, Neubauer AM etal.(2006).^Endothelial alpha(v)beta3integrin-targeted fumagillin nanoparticlesinhibit ang1genesis in atherosclerosis，，.Arter1scler Thromb Vasc B1l26(9):2103-2109.)
[0094]1.2统计分析
[0095]数据统计采用统计分析系统(StatisticalAnalysis System, SAS, Cary, NC)进行方差分析和一般线性模型分析。三组差别p〈0.05认为有统计学意义。定量数据以均数土标准差形式表示。
[0096]1.3通过电感偶合等离子体发射光谱仪体(Inductive Coupled Plasma OpticalEmiss1n Spectrometer, ICP-OES)外定量分析 α v β 3-Gd-MnOL_NC 的生物分布
[0097]在24只参与实验的兔模型中随机抽取9只动物(每组3只)，经过量麻醉进行安乐死，切取并称重主要脏器:肝脏、脾脏、肾脏、肺、心脏、粪便、胆汁、尿液和血液；加热，并经过1:1:1H20/HF/HN03混合物进行消化，通过ICP-OES检测各组织中Mn2+和Gd3+浓度，单位用纳克金属/每克组织。
[0098]1.4组织病理和免疫组织化学
[0099]MR成像后，切取对应与MR成像范围的20cm胸主动脉，等分为5mm每段，在最适切割温度(Optimal Cutting Temperature, OCT)复合物(Sakura Finetek)中包埋，进行冰冻切片，每层8um，来评价双模式纳米粒子(即偶联荧光染料的整合素ανβ3靶向性
1.25mol% MnOL-Gd NC)的分布情况。临近层面切片分别进行苏木素-伊红(hematoxylin/eosin, HE)染色用于病理形态学检测；用LM609 (Chemicon, Temecula, CA)抗体对经丙酮固定的切片进行整合素α νβ 3免疫组织化学染色，这里需要考虑到注射α νβ 3靶向性MnOL-GdNC的动物血管壁整合素染色会与纳米粒子出现竞争性抑制，可能会影响到免疫组织化学染色的准确性。血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet-endothelial cell adhes1nmolecule,PECAM)染色采用常规内皮细胞标记物(Clone JC70A, Dako, Carpinteria, CA)。用ABC Elite 试剂盒和 VIP底物试剂盒(Vector Laboratories, Burlingame, CA)进行染色，并用甲基绿进行对比染色。切片均用Olympus BX61显微镜(Olympus, Tokyo, Japan)进行成像，用Olympus数字图像软件进行处理。
[0100]2、结果
[0101]2.1高脂饮食饲养兔模型新生血管生成活体分子成像
[0102]作为活体概念验证，在高脂饮食饲养12个月的雄性新西兰大白兔动脉粥样硬化模型中评估QvP3-Gd-MnOL-NC检测和定量新生血管生成的效率。其中高脂肪饮食(饲料脂肪含量达0.25%)雄性新西兰大白兔模型16只，分成两组，每组8只，分别通过耳缘静脉按lml/kg注射整合素ανβ3靶向性超低浓度(1.25m0l% )钆剂偶联油酸锰纳米粒子胶体(α νβ 3-1ntegrin - targeted Gd-MnOL-hybrid nanocolloids, α vβ 3-Gd_Mn0L-NC)和整合素ανβ3非靶向性超低浓度(1.25mol % )钆剂偶联油酸锰纳米粒子胶体(nontargeted (NT)-Gd-MnOL NC)。正常饲料饲养12个月的对照组兔模型8只,通过耳缘静脉注射 a J3-Gd-MnOL-NC。
[0103]兔胸主动脉斑块新生血管生成的MR分子成像；各组模型在在注射对比剂之前及之后30、60、90和120分钟用3.0T磁共振(magnetic resonance,MR)米用脂肪抑制、黑血、涡旋自旋回声Tlw序列连续成像2小时。每只动物的扫描范围都是从左锁骨下动脉到膈肌水平的胸主动脉，共20层图像。采用以前报道过的特制的半自动分段程序处理及平均化所有图像中胸主动脉的MRI增强信号。凡是没有组织病理学结果证实斑块存在的高脂饮食兔都排除出统计分析组，最终三组实验动物的数量分别为:高脂饮食靶向组7只；高脂饮食非靶向组6只；正常饮食靶向组8只。
[0104]图7A-E显示典型的高脂饮食饲养兔在注射α ν β 3-Mn0L_Gd NC之前和注射后2小时后胸主动脉血管壁对比剂信号渐进性强化。主动脉管腔内对比信号在基线和随后的时间点都可以忽略不计，表明血管壁信号的改变不会受到循环血池中粒子的干扰。主动脉壁新生血管Tlw对比强化表现为一种异质性方式，注射后2小时内信号强度及空间分布维度都呈渐进性增加。图7F显示在120分钟时间段内该层面横截段所有像素平均信号增强程度随时间呈单指数增加，与胸主动脉Tlw信号增强映像图相一致。
[0105]在注射ανβ3-ΜηΟΙΧΜ NC的高脂饮食动物组中，各层面整体平均新生血管整体面积百分比(1.8±0.6% )较高脂饮食非靶向组(0.1±0.1% )和正常饮食对照靶向组(0.2±0.1%)相比明显增高(图8，p〈0.05)。进一步评估动脉壁内半部新生血管区(即斑块区)和外半部(即基质和外膜)区信号增强程度，注射CivP3-MnOL-Gd NC的高脂饮食动物组胸主动脉壁外半部新生血管强化程度(0.5±0.2% )较高脂饮食非靶向组(0.0±0.0% )和正常饮食对照靶向组(0.0±0.0% )相比轻度增高(图8，ρ〈0.05)。而胸主动脉壁内半部新生血管强化程度(4.3±1.9% )较高脂饮食非靶向组(0.6±0.6% )和正常饮食对照靶向组(0.0±0.0% )相比明显增高了 7倍以上(图8，ρ〈0.05)。
[0106]新生血管生成指数是信号增强的像素数与所占主动脉壁的百分比的乘积，使用新生血管生成指数作为评价指标比较实验室的三组动物，数据显示注射CivP3-MnOL-GdNC的高脂饮食动物组胸主动脉壁新生血管强化指数(4950±2172)较高脂饮食非靶向组(297±297)和正常饮食对照靶向组(396±138)相比明显增高(图9，ρ〈0.05)。主要的强化新生血管生成指数出现在动脉壁内部(a J3-MnOL-Gd NC/高脂饮食组:4248±2172 ；ρ<0.05 ；NT-MnOL-Gd NC/ 高脂饮食组:169 ±169 ； a J3-MnOL-Gd NC/ 正常饮食组:276±123，ρ〈0.05)。动脉壁外部的新生血管生成指数与内膜相比更低，分布方式与内膜相似，但差别没有统计学意义(α νβ 3-MnOL-Gd NC/高脂饮食组:527±296 ；p<0.05 ；NT-MnOL-Gd NC/ 高脂饮食组:128±128 ; α νβ 3-MnOL_Gd NC/ 正常饮食组:93±68)。高脂饮食非靶向组和正常饮食对照靶向组的血管内外部的新生血管生成指数相似。
[0107]2.2组织病理学
[0108]光学显微镜显示高脂饮食饲养的兔降主动脉血管内膜中度增厚，血管滋养管扩张；而在图9显示正常饮食饲养的对照组兔血管未见内膜增厚及血管滋养管扩张的情况。高脂饮食饲养兔的动脉外膜疏松，扩张微血管有明显的血小板-内皮细胞粘附分子染色。对照组兔动脉内膜不厚、基层结构正常、外膜仅见稀疏的血管滋养管。荧光显微镜成像显示Qv^3-MnOL-Gd NC上标记的AlexaFluor 594红色荧光染料于兔主动脉壁的外膜通过基层分布于斑块内，而NT-MnOL-Gd的AlexaFluor 594红色荧光染料在基质和斑块内累积量不明显(见图9)。注射标记AlexaFluor 594的α νβ 3-MnOL_Gd NCs的正常饮食饲养的兔模型动脉壁外膜仅见非常稀疏的荧光信号。在所有高脂饮食饲养兔的组别的主动脉样本中均可见一些AlexaFluor 594标记的MnOL-Gd纳米粒子的表面突光降解物呈涂片样浑池梯度到达内弹性膜，荧光成像结果与MR对比结果相一致。
[0109]2.3通过电感偶合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)方法体外定量分析Qv^3-Gd-MnOL-NC的生物分布
[0110]为了定量测量a J3-Gd-MnOL-NC的生物分布与清除，我们采用了电感偶合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)方法来定量测定每个器官中Mn2+和Gd3+的含量。如图10所示，注射MnOL-Gd 6小时后各种组织内Mn2+和GcT的含量。其中粪便中含【Mn2+】达78.63 ±2.28ng/mg(组织)，远比肝肾浓度含量高(分别为7.03 ± 0.68ng/mg和5.15 + 1.0lng/mg)。
[0111]综上所述，本发明报道了一种新型的表面整合超低浓度钆螯合剂的软性MnOLNC结构，可实现高A弛豫率，从而可有效用于快速活体Tlw MR成像血管内皮细胞表达的整合素ανβ3。钆螯合剂增强Γι弛豫率有效性依赖于所用脂质螯合剂的化学结构，以及金属相对于纳米粒子表面积周围液性环境的相对位置。将浓度仅为1.25mol%的Gd-DOTA-PE偶联到MnOLNC表面就可以达到远超过预期的F1弛豫率，表明MnOL NC和Gd-DOTA-PE产生的磁场之间存在协同作用。在活体动物实验中，这种改进的MR分子成像对比剂可用于在高脂饮食饲养兔动脉粥样硬化模型中检测斑块新生血管生成，信号强化主要出现在兔主动脉血管内部(即斑块区)，可以通过三维映射图像直观显示新生血管的空间分布。CiJ3-MnOL-GdNC实现活体Tlw对比时使用的钆螯合剂浓度较临床血管成像批准的浓度减少300倍。除了通过更低的钆螯合剂浓度减少NSF的安全顾虑，在细胞学实验和活体动物实验中也证实本发明的一种新型NC实质上消除了补体激活副作用的发生。结合体外细胞学实验rl高弛豫率、活体对比成像有效性和改善生物安全性表明α νβ 3-MnOL-Gd NC可以作为有效分子对比剂用于定量临床动脉粥样硬化斑块患者新生血管生成成像，特别对于早期筛查有中风风险的中度狭窄颈动脉斑块患者进行斑块稳定性预防。
【权利要求】
1.一种锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于所述纳米粒子胶体中含有复数个锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子，所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子由内核层和外壳层组成，其中内核层包括二价油酸锰分子以及作为悬浮介质的浓缩剂，外核层由钆螯合物以及磷脂酰胆碱组成，所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体是通过以下方法制备得到的: (1)在氮气氛围下，将二价油酸锰MnOL悬浮在浓缩剂中，在100-300兆帕和0_25°C条件下加入磷脂表面活性剂，充分混合，其中，所述的磷脂表面活性剂中含有钆螯合物和磷脂酰胆碱； (2)步骤(I)得到的混合液在25°C?55°C超声浴的条件下反应0.5h?24h，反应过程中始终保持氮气氛围，反应后的溶液在氮气吹扫下封装，即得锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体。
2.如权利要求1所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于二价油酸锰是通过以下方法制备得到的:二价锰化合物同油酸钠在乙醇-水-正己烷混合物中先在75-85°C下反应12-16小时，然后在24_26°C下反应3_5小时，除去溶剂后，制备得到二价油酸锰MnOL，所述的乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的体积比为3-5:4_6:8-10，优选的，在乙醇-水-正己烷混合物中，乙醇、水以及正己烷的体积比为4:5:9。
3.如权利要求2所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于所述的二价锰化合物选自氧化锰、氯化锰、二亚乙基三胺五乙酸锰(Mn-DTPA)和二磷酸双吡哆醛锰(Mn-DPDP)中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于所述的浓缩剂为聚山梨酯、失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、杏仁油、菜籽油、甘油或红花油中的一种或几种的组合。
5.如权利要求4所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于所述的聚山梨酯为聚山梨酯80。
6.如权利要求1所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于二价油酸锰MnOL的质量(g)与浓缩剂的体积(ml)比为1:1.5-2.5，优选1:2。
7.如权利要求1所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子，其特征在于所加入的磷脂表面活性剂的终浓度为0.015-0.025g/ml，优选0.02g/ml。
8.如权利要求1所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于所述的磷脂表面活性剂中含有0.l-50mol%的钆螯合物以及50mol% -99.9mol%的磷脂酰胆碱。
9.如权利要求1或8所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体，其特征在于所述的钆螯合物包括钆-轮环藤宁四乙酸四乙酸磷脂酰乙醇胺(Gd-DOTA-ΡΕ)、钆-二乙撑三胺五乙酸油酸双酯(Gd-DTPA-BOA)、礼双胺(gadodiamide)、马根维显(gadopentetatedimeglumine)及礼弗塞胺(gadoversetamide)中的一种或多种。
10.权利要求1-9任一项所述的锰钆杂合双金属顺磁性纳米粒子胶体在制备磁共振成像对比材料中的应用。
【文档编号】A61K49/18GK104127889SQ201410255471
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】申宝忠, 王可铮, 吴丽娜 申请人:哈尔滨医科大学