Vinexinβ在治疗血管损伤后再狭窄中的功能和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种Vinexinβ在治疗血管损伤后再狭窄中的功能和应用，属于基因的功能与应用领域。本发明以Vinexinβ基因敲除小鼠和野生型小鼠为实验对象，通过血管损伤模型，进行了小鼠内膜新生、血管壁细胞增殖水平和平滑肌细胞表型转换的检测。结果表明，Vinexinβ基因敲除可以明显促进内膜新生和细胞增殖，促进平滑肌细胞由收缩型向合成型转换。这表明Vinexinβ在血管损伤后再狭窄中的功能，主要体现在Vinexinβ具有抑制内膜新生和细胞增殖以及抑制平滑肌细胞表型转换的功能。针对Vinexinβ的上述功能，Vinexinβ可用于制备预防、缓解和/治疗血管损伤后再狭窄的药物和动脉支架。
【专利说明】Vinexin^在治疗血管损伤后再狭窄中的功能和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因的功能与应用领域，具体涉及一种VinexinP在治疗血管损伤后再狭窄中的功能和应用，具体是Vinexin β在制备预防、缓解和/或治疗血管损伤后再狭窄的药物中应用。
【背景技术】
[0002]随着人类社会经济的飞速发展、人民生活水平的提高以及人口老龄化进程的加快，心血管疾病的发病率逐年升高，已成为严重危害全球性公众健康的重大疾病之一。新生内膜形成是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、肺动脉高压、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous transluminal coronary intervent1n,PCI)术后再狭窄等血管增生性血管疾病共有的病理过程。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)表型转化在新生内膜形成过程中扮演着重要的角色。VSMCs由收缩型表型向合成型表型转化时，其增殖、迁移能力增强并分泌、合成大量的细胞外基质，从而导致新生内膜，进而发生严重的血管增生性疾病。对这类疾病的治疗目前仍是难题，血管外科的主要治疗手段是闭塞段血管重建，包括球囊扩张、支架置入以及动脉旁路手术等，虽然可以实现血管重建，有效的疏通阻塞的动脉，改善血供，然而，手术过程中出现的不同程度的机械损伤引起新生内膜的形成，导致支架术后再狭窄而使得疗效往往不尽如人意，迄今为止血管重建后再狭窄依然是一个临床难题。因此，寻找新的血管再狭窄的干预靶点具有重要的理论意义。
[0003]Vinexin 属于粘着斑蛋白(vinculin)家族，Vinexin 包括 3 个亚型，Vinexin- α、β和Y，这3种亚型的蛋白都在其N端有一个SoHo (sorbinhomology)结构域和C端的三个SH3 (srchomology 3)结构域,分子结构都高度保守【1，2】。Vinexin和vinculin是组成细胞粘附的蛋白质网络的重要组成成分，Vinexin可以通过其SH3结构域与vinculin的头尾连接区结合直接影响粘着斑的形成，并调控细胞-细胞、细胞-胞外基质的粘附，并最终影响细胞的迁移、分化、分裂和凋亡等一系列重要细胞行为。粘着斑激酶(FAK)在VSMC的增殖和迁移过程中发挥重要的作用【3】。Vinexin在细胞增殖的定着依赖性中发挥重要作用，研究表明VinexinP可调控细胞表面表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化水平和由EGF刺激的ERK2活化的细胞定着依赖性【4，5】。最新研究发现，VinexinP在高负荷引起的心肌重构和衰竭反应中是一个很重要的调节蛋白，可通过抑制AKT信号通路的激活，抑制高负荷所引起的心肌重构和衰竭【6】。血管术后再狭窄发生过程中的一个重要环节就是VSMC在多种细胞因子的刺激下产生粘附迁移和增殖，由此推测VinexinP可能在血管再狭窄中发挥功能作用。
[0004]【参考文献】
1、K1kaN，Sakata S，Kawauchi Tj Amachi Tj Akiyama SKj Okazaki K，YaenC， Yamada KMj Aota S (1999) Vinexin: a novel vinculin-binding protein withmultiple SH3 domains enhances actin cytoskeletal.2、MatsuyamaM，Mizusaki H，Shimono A，Mukai T，Okumura K，Abe K，ShimadaK， Morohashi K (2005) A novel isoform of Vinexinj Vinexin gamma, regulates Sox9gene express1n through activat1n of MAPK cascade in mouse fetal gonad.GenesCells 10:421-434.3、YinHj Wang L， Huo Y， et al.Activated focal adhes1n kinase involved inadhes1n and migrat1n of vascular smooth muscle cells stimulatedby fibronectin.Chin Med J.2002 Apr; 115(4):494-7.4、MitsushimaM， Ueda K， K1ka N.Vinexin beta regulates the phosphorylat1nof epidermal growth factor receptor on the cell surface.Genes Cells.2006;11 (9):971-82.5λSuwa A, Mitsushima M，Ito T，et al.Vinexin beta regulates the anchoragedependence of ERK2 activat1n stimulated by epidermal growth factor.J B1lChem.2002 Apr 12:277(15):13053-8.6、Ke Chen, Lu Gaoj Yu Liuj et al.Vinexin- β protects against cardiachypertrophy by blocking the Akt—dependent signalling pathway.Basic ResCard1l, 2013， 108:338。
【发明内容】
[0005]为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定Vinexin β的表达和血管损伤后再狭窄的相互关系，提供一个用于预防、缓解和/或治疗血管损伤后再狭窄的革巴基因VinexinP的新用途。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:
本发明以野生型C57BL/6小鼠与VinexinP基因敲除小鼠(Vinexin β-KO小鼠)为实验对象，通过颈动脉导丝损伤模型诱导获得小鼠血管损伤模型(vascular injury, VI),进行了血管损伤模型(VI)小鼠内膜新生测定、血管壁细胞增殖水平的检测和平滑肌细胞表型的检测的研究，结果表明:与野生型C57BL/6小鼠对比，VinexinP基因敲除小鼠表现出内膜新生及细胞增殖明显大于WT小鼠；Vinexini3基因敲除可以促进细胞增殖核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)和细胞周期蛋白(Cyclin Dl)的表达,可促进平滑肌细胞的增殖和内膜增生；Vinexini3基因敲除可以抑制平滑肌肌动蛋白(SmoothMuscle Actin, SMA)和平滑肌 22 α (smooth muscle 22 alpha, SM22 α )的表达,可促进平滑肌细胞由收缩型向合成型的表型转换，从而促进内膜增生。上述结果表明VinexinP基因敲除会促进血管损伤后再狭窄的发生，VinexinP能够抑制血管损伤后再狭窄的形成，为研究预防、缓解和/或治疗血管损伤后再狭窄的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。
[0007]本发明的研究证明了:在血管损伤后再狭窄模型中，VinexinP可以抑制内膜新生和细胞增殖，抑制平滑肌细胞由收缩型向合成型转换，特别是改善血管损伤后再狭窄的作用。
[0008]针对VinexinP的上述功能，提供一种VinexinP的应用，主要体现为Vinexin β在制备预防、缓解和/或治疗血管损伤后再狭窄的药物中应用。
[0009]一种预防、缓解和/治疗血管损伤后再狭的药物，包含Vinexin^。
[0010]一种预防、缓解和/或治疗血管损伤后再狭窄的动脉支架，其包被有Vinexin^。[0011 ] 在本发明中，所述血管损伤主要是指动脉血管损伤。
[0012]在本发明中，所述血管损伤是指动脉粥样硬化引起的血管损伤，或者在治疗动脉粥样硬化时引起的血管损伤，例如通过球囊扩张或放入支架引起的血管损伤，或者移植后动脉病或肺动脉高压引起的血管损伤。
[0013]在本发明中，所述动脉粥样硬化既包括动脉粥样硬化较早期阶段的血管狭窄期，也包括动脉粥样硬化严重时的血管梗塞期。
[0014]在本发明中，所述经皮冠状动脉介入治疗是指经导管通过各种方法扩张狭窄的冠状动脉，从而达到解除狭窄，改善心肌血供的治疗方法。
[0015]在本发明中，所述动脉支架是指用于支撑人体内因病变而狭窄、闭塞的血管，恢复血液流通的管状器件，采用金属或高分子材料加工制成，可长期或暂时留于人体血管内。在管腔球囊扩张成形的基础上，在病变段置入支架以达到支撑狭窄闭塞段血管、减少血管弹性回缩及再塑形、保持管腔血流通畅的目的，既包括外周动脉支架，也包括冠状动脉支架。
[0016]在本发明中，所述再狭窄是指在局部血管发生损伤时，所作出的导致血管管腔再狭窄的普遍性生物学反应。这里主要指医源性损伤引起的血管再狭窄，损伤过程主要由动脉重塑和内皮增生组成。
[0017]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(I)本发明发现了 VinexinP基因的新功能，即Vinexin β能够抑制血管损伤后再狭窄的作用。
[0018](2)基于Vinexin β在抑制血管损伤后再狭窄的功能，为研制血管损伤后再狭窄的药物提供基础，可用于制备预防、缓解和/或治疗血管损伤后再窄中的药物。
[0019](3) VinexinP可用于制备预防、缓解和/或治疗血管损伤后再狭窄的动脉支架。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是WT和VinexinP-KO小鼠术后28天的HE染色及内膜面积结果统计柱状图；其中，A:ΗΕ染色图，B:内膜面积统计柱状图(*:ρ < 0.05 vs WT VI组)。
[0021]图2是WT和VinexinP-KO小鼠术后28天血管壁细胞增殖水平标志物PCNA、CyclinDl表达的免疫荧光染色及结果统计柱状图；其中，A:免疫荧光染色，B:结果统计柱状图(*:ρ < 0.05 vs WT VI 组)。
[0022]图3是WT和Vinexin β -KO小鼠术后28天平滑肌细胞表型转换标志物SMA、SM22 α表达的免疫荧光染色及结果统计柱状图；其中，A:免疫荧光染色，B:柱状图(*:p<0.05 vsWT VI 组)。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步详细的描述。应理解，下面的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0024]实验用动物及饲养
实验动物:选用8-10周龄、体重在24-27g，雄性，C57BL/6小鼠(WT小鼠，购自北京华阜康生物科技有限公司)和VinexinP基因敲除小鼠(Vinexin β-K0，购自日本RIKEN公司，货号:RBRC01732)。
[0025]饲养环境:所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。SPF级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司，饲养条件:室温在22-24°C之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。
[0026]实施例1小鼠血管损伤模型(VI)获得
1.实验动物分组:使用8-10周龄，体重24-27g的WT和Vinexir^-KO小鼠，共分为2组:WT血管损伤组，VinexinP -KO血管损伤组，每组各20只小鼠。分别在手术后28天处死小鼠，取损伤节段血管进行分析。
[0027]2.小鼠血管损伤模型操作流程:
I)用电子天平于动态模式下准确称取小鼠体重(g)，用双蒸水准确配置3%戊巴比妥钠溶液，轻轻摇动使其充分溶解，采用80mg/kg体重剂量，计算所需戊巴比妥钠溶液体积后用ImL注射器准确抽取相应体积溶液，行腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠充分麻醉倒(约3min)后，8%硫化钠颈部脱毛。
[0028]2)分离颈内和颈外动脉。
[0029]3)在颈内动脉和颈外动脉分叉处用8-0线结扎颈外动脉，同时用血管夹(WPI，501784-G)暂时性阻断颈内动脉及颈总动脉供血。
[0030]4)用显微剪(WPI，501839)在颈外动脉结扎线的上方横向剪一个小口。经此血管切口插入直径 0.015 英寸的导丝(N0.C-SF-15-15, Cook, Bloomington, Indiana),旋转导丝进退5-6次。
[0031]5)在切口近心端结扎颈外动脉，松开颈内及颈总动脉置留的血管夹，剪断线头，清理术野，缝合颈部切口。
[0032]实施例2血管损伤模型(VI)小鼠内膜新生测定
1.小鼠取材
I)麻醉小鼠，剪破心脏放血。
[0033]2)从颈动脉近分叉处剪下颈动脉，取0.5-0.6cm长，保留颈外动脉线结。
[0034]3)将颈动脉放入PBS中，用显微镊轻柔排干管腔内的残血。
[0035]4)将血管放入装有ImL 4%多聚甲醛的1.5mL EP管中固定。
[0036]2.病理学检测
2.1制备石腊标本切片
由实验室专业病理工作人员制备石蜡标本切片，主要操作程序包括:4%多聚甲醛中隔夜固定后，将血管用滤纸小心包好，放入包埋框一流水冲洗一脱水一透明一浸蜡一包埋一切片(3μπι)—摊片一晾干或烘烤后备用。
[0037]2.2苏木精-伊红(HE)染色
主要步骤为:55 °C烘烤30min — 二甲苯5min，3次一100%酒精Imin — 95%酒精Imin — 70%酒精Imin —双蒸水Imin —苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021) 5min —水洗Imin — 1%盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70%酒精充分混合均匀)l_3s —水洗Imin — Scott液(碳酸氢钠0.35g,硫酸镁2g,蒸懼水100mL)lmin —水洗Imin —伊红溶液(珠海贝索，BA-4024)3-5min —蒸馏水洗去浮色一70%酒精Is — 95%酒精Is — 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通风橱内吹干，显微镜拍照。
[0038]以血管内弹力纤维和外弹力纤维为界，内弹力板以内为血管内膜，外弹力板以外为血管外膜，内外弹力板之间为血管中膜。用Image-Pro Plus 6.0软件分别圈各血管管腔面积。
[0039]内膜面积大小的计算参照公式如下:
新生内膜面积=内弹力板面积-管腔面积；
中膜面积=外弹力板面积_内弹力板面积。
[0040]小鼠HE染色后的血管内膜新生的结果如图1。正常的血管壁结构完整，排列整齐，血管内膜为单层内皮细胞，结构完整，中膜平滑肌细胞排列整齐。通过HE染色观察到，血管损伤组(VI组)血管壁结构不完整，血管内皮细胞缺失，新生内膜增生明显，并伴有大量炎细胞浸润；Vinexini3-K0组在术后28天新生内膜面积明显比WT小鼠要增大。同样，内膜面积/中膜面积的比值在VI术后VinexinP-KO组要高于WT组。这说明VinexinP基因的缺失可以促进血管损伤后引起的内膜新生。
[0041]实施例3血管壁细胞增殖水平的检测
免疫突光染色检测细胞增殖核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin Dl)的表达。所需一抗信息:PCNA (#2586; 1:100; mouse;Cell Signaling Technology), cyclin Dl (#2978; 1:25; rabbit; Cell SignalingTechnology);所需二抗信息:Alexa Fluor 568-conjugated goat ant1-rabbit IgG(A11011; Invitrogen, Carlsbad, CA), Alexa Fluor 568-conjugated goat ant1-mouseIgG (A11004; Invitrogen, Carlsbad, 150 d, CA)。
[0042]主要步骤为:
I)烤片:将石蜡切片置于55°C烤箱中30min以上。
[0043]2)脱蜡:二甲苯 5minX3。
[0044]3)水合:100% 乙醇 5minX2 ；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ；ddH20 浸洗 5minX2。
[0045]4)柠檬酸盐组织抗原修复(高压修复):取一定量的pH6.0柠檬酸盐抗原修复工作液(购自福州迈新生物科技有限公司，货号MVS-0100)于修复盒中，修复工作液的量必须能足够浸没整张切片，将修复盒放入已加入适量自来水的高压锅中，大火加热至沸腾，将脱蜡水合后的组织切片置于耐高温染色架上，再将染色架缓慢放入修复盒中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时5min后，压力锅断开电源，去阀开盖，取出修复盒；室温放置20min自然冷却后取出切片。
[0046]5 ) ddH20 漂洗 5min X 2 次，PBS 漂洗 5min X 2 次。
[0047]6)组化笔划圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封闭，于湿盒中37°C封闭60mino
[0048]7)弃封闭液,滴加适当比例稀释的一抗，4°C孵育过夜,37°C复温30min,弃去一抗，PBS 洗 1minX 3 次。
[0049]8)滴加二抗，于湿盒中37°C孵育60min，弃去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0050]9) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0051]10)荧光镜下观察，拍照。若需保存，于暗湿盒中4°C保存。
[0052]荧光统计方法:PCNA免疫荧光染色统计采用IPP软件计数，PCNA阳性细胞百分比=PCNA阳性细胞个数/ (内膜+中膜)的总DAPI个数*100% ；CyclinDl免疫荧光染色统计采用IPP软件直接测阳性吸光度。
[0053]免疫荧光法观察平滑肌细胞增殖标志物PCNA、CyclinDl在WT和Vinexin β -KO小鼠血管损伤后的表达变化，结果见图2。PCNA, CyclinDl在血管组织中有表达，Vinexin β -KO小鼠在术后28天PCNA的阳性细胞个数及CyclinDl的荧光强度均要增大于同组的WT小鼠，表明VinexinP基因敲除可以促进PCNA、CyclinDl的表达，可促进平滑肌细胞的增殖和血管内膜新生。
[0054]实施例4平滑肌细胞表型的检测
免疫荧光染色检测平滑肌细胞分化标志物:平滑肌肌动蛋白(Smooth Muscle Actin,SMA)、平滑肌22 α (smooth muscle 22 alpha，SM22 α )的表达。所需一抗信息:SMA(ab5694;1:100; rabbit; Abeam) and SM22 a (abl4106 ; 1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息:Alexa Fluor 488-conjugated goat ant1-rabbit IgG(A11008; Invitrogen, Carlsbad,CA)。
[0055]主要步骤参照实施例3。
[0056]荧光统计方法:采用IPP软件直接测阳性吸光度。
[0057]在正常生理状态下，血管平滑肌细胞处于静止状态，主要表现为收缩型；血管损伤后，血管平滑肌细胞由中膜向内膜迁移，平滑肌细胞的增殖凋亡失平衡，表型由收缩型向合成型转变，血管壁不适重塑，从而引起内膜增生。免疫荧光观察SMA、SM22 α在WT和VinexinP-KO小鼠血管损伤后的表达变化，结果见图3。SMA、SM22 α在血管组织中有表达，VinexinP-KO小鼠在术后28天SMA、SM22a的荧光强度均要低于同组的WT小鼠，表明Vinexin^基因敲除可以抑制SMA、SM22 α的表达，可促进平滑肌细胞由收缩型向合成型的表型转换，从而促进内膜增生。
[0058]以上述实施例结果显不,野生型小鼠和VinexinP -KO小鼠在血管损伤模型(VI)的诱导下均发生血管损伤后再狭窄。VinexinP基因敲除小鼠的内膜新生、细胞增殖水平以及平滑肌细胞表型转换均比野生型小鼠要显著。这些结果表明，VinexinP可以改善血管损伤诱导的平滑肌细胞的增殖、表型转化和血管新生内膜形成。
[0059]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.Vinexin β在制备预防、缓解和/或治疗血管损伤后再狭窄的药物中的应用。
2.一种预防、缓解和/或治疗血管损伤后再狭窄的药物，其特征在于:包含Vinexinii。
3.一种预防、缓解和/或治疗血管损伤后再狭窄的动脉支架，其特征在于:包被有Vinexinβ 。
4.根据权利要求1所述的应用、权利要求2所述的药物或权利要求3所述的动脉支架，其特征在于:所述的血管损伤为动脉粥样硬化、动脉粥样硬化介入治疗、移植后动脉病或肺动脉高压引起的血管损伤。
【文档编号】A61L31/04GK104127867SQ201410410841
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】李红良, 关红菁, 程文林, 张书敏, 王丕晓 申请人:武汉大学