血液剪切力应答蛋白1在治疗动脉粥样硬化中的功能和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种血液剪切力应答蛋白1（RECS1）在治疗动脉粥样硬化中的功能和应用，属于基因的功能与应用领域。本发明以ApoE-/-小鼠及RECS1-/-ApoE-/-小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导获得动脉粥样硬化模型，结果表明与ApoE-/-小鼠对比，RECS1基因缺陷显著减少了主动脉的斑块面积，增强主动脉窦斑块的稳定性，显著减轻了炎症反应。这表明RECS1在动脉粥样硬化中的功能主要体现为促进主动脉斑块形成，特别促进动脉粥样硬化。针对RECS1的功能，RECS1可作为药物靶标用于筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物，RECS1的抑制剂可用于制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物。
【专利说明】血液剪切力应答蛋白1在治疗动脉粥样硬化中的功能和应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于基因的功能与应用领域，具体涉及一种血液剪切力应答蛋白I(RECSl)在治疗动脉粥样硬化中的功能和应用，具体是RECSl在制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中应用。
【背景技术】
[0003]心脑血管疾病在许多发达国家中是主要致死性病因，在我国的发病率和致死率也逐年升高。心脑血管疾病的基础是动脉粥样硬化(Atheosclersisis, AS),动脉粥样硬化可使动脉管壁增厚、变硬、管腔狭窄，导致很多心脑血管事件发生。而动脉粥样硬化不稳定斑块的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成的冠状动脉急性狭窄和闭塞是导致急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)的重要原因。
[0004]动脉粥样硬化是多种遗传基因、危险因素及免疫机制共同参与的一种慢性炎症性疾病，局部和全身的炎症免疫反应在动脉粥样硬化发生发展过程中起着重要作用，固有免疫和适应性免疫共同参与调节动脉粥样硬化病变，病理上表现为大、中动脉多处斑块形成，好发于血液分流、动脉弯曲及动脉分支等区域，其病变特征是血中脂质在动脉内膜沉积，弓丨起内膜灶性纤维性增厚，病灶深部为由坏死组织和细胞外脂质池形成的粥样物质。动脉粥样硬化斑块中存在着多种免疫细胞，其中以巨噬细胞和T细胞最为常见，此外还有少量的树突状细胞(Dentritic cell,DC)、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)和肥大细胞(mast cell)等,偶有B淋巴细胞。
[0005]动脉粥样硬化最早期肉眼可见的损伤是脂质条纹，主要由摄取了大量胆固醇的巨噬细胞源性泡沫细胞构成。血液循环中的单核细胞在动脉易损部位黏附到活性内皮细胞，启动了脂质条纹的形成，黏附的单核细胞随后受局部产生的化学趋附分子的吸引迁移到内膜下，并进一步分化为巨噬细胞。大量胆固醇脂在巨噬细胞内积聚，形成泡沫细胞，这是动脉粥样硬化形成早期的特征性病理生理过程。动脉粥样硬化的发生是多因素共同作用的结果，目前已发现的动脉粥样硬化危险性因素很多，但相关针对治疗及控制效果均不理想，降脂和抗炎治疗是目前最主要的治疗措施。
[0006]炎症反应贯穿于动脉粥样硬化发生发展的整个过程，炎症反应也是导致动脉粥样硬化斑块破裂主要因素之一。NF-κ B是最初在鼠成熟B细胞和粒细胞瘤中发现并命名为细胞核Kappa轻链基因表达的调节子。研究发现，动脉粥样硬化病灶的巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等多种细胞中均存在活化的NF-K B。用高脂饮食喂养低密度脂蛋白受体基因缺陷(LDLR+)的小鼠，早期即可在小鼠主动脉根部的内皮细胞中发现核因子-K B的活化，并且发现该部位逐渐发展成为动脉粥样斑块【I】。抑制NF- K B通路活化则有助于缓解动脉粥样硬化。姜黄素通过抑制AS过程中NF-κ B的表达，抑制炎症因子的产生，减轻AS炎症反应【2】。
[0007]RECSl (responsive to centrifugal force and shear stress gene I)是血液剪切力应答蛋白。Nojima实验室【3】最早报道血液剪应力诱导RECSl的转录表达，并克隆得到RECSl的cDNA和氨基酸序列。人RECSl是I个有311个氨基酸的7次跨膜蛋白，与Lifeguard和谷氨酸结合蛋白具有很高的同源性。RECSl基因敲除的小鼠年老时易患主动脉囊性中层坏死并表现有大动脉扩张症，表明RECSl可能参与调控血管的发育重塑【4】。RECSl 是肿瘤坏死因子受体 2 (tumor neucrosisfactor receptor 2, TNFR2)的结合蛋白质，有报道表明稳定表达RECSl的小鼠成纤维细胞对TNFR2特异的激动性抗体表现出一定的耐受性，表明RECSl可能参与TNF-α信号的调控【5】。近期的研究结果显示，RECSl结合TNFR1，并抑制过量表达TNFRl诱导的核转录因子-κ B (NF- κ B)活化，从而负调控TNF- a信号【6】。基于上述研究基础，我们认为RECSl在动脉粥样硬化形成的特征性病理生理过程中可能扮演着重要角色，但其在动脉粥样硬化形成的特征性病理生理过程中的生物学功能和可能的作用机制尚未阐明。
[0008]小鼠和基因工程小鼠资源是目前疾病机制研究、基因功能研究、药物创制等领域最重要的动物模型之一，也是这些领域创新研究的必须条件。利用基因工程小鼠针对动脉粥样硬化病理过程中的各个分子环节进行研究，对阐明动脉粥样硬化发生发展过程中的分子机制，寻找动脉粥样硬化治疗的分子靶点具有重要的意义。
[0009]【参考文献】
1、HajraL, Evans Al, Chen M, et al.The NF-kappa B signal transduct1npathway in aorticendothelial cells is primed for activat1n in reg1nspredisposed to atherosclerotic les1n format1n.Proc Natl Acad Sci USA,2000， 97(16):9052-9057.2、王春彬，高大中，殷跃辉，等.姜黄素对高脂血症兔主动脉NF-κB、VCAM-1、VEGF表达的影响.中成药，2007，29(8): 1127-1129.3、H.Yoshisue, K.Suzuki, A.Kawabatal, Atherosclerosis 162,323(Jun, 2002).4>Zhao HI, Ito A, Sakai N, Matsuzawa Y, et al.RECSl is a negative regulatorof matrix metalloproteinase-9 product1n and aged RECSl knockout mice are proneto aortic dilat1n.Circ J.2006 May; 70(5): 615-24.5、蔡慈峰，吴明江，廖志勇.RECSl负调控肿瘤坏死因子受体2介导的NF-κB激活。中国生物化学与分子生物学报，2010.6、廖志勇.离心力和剪应力应答蛋白I是肿瘤坏死因子受体I的新调控因子。中国生物化学与分子生物学报，2011。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于确定RECSl的表达和动脉粥样硬化的相互关系，提供一个用于预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的靶基因RECSl的新用途。
[0011]本发明的目的通过下述技术方案实现:
本发明确定的RECSl的表达和动脉粥样硬化的关系如下:
1.RECSl基因敲除显著减少了动脉粥样硬化的斑块面积本发明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠与RECSl/ApoE双基因敲除(RECSl+ApoE+)小鼠为实验对象，分别通过低脂饲料和高脂饲料饮食诱导获得动脉粥样硬化小鼠模型(AS)。结果表明ApoE+和RECSl+ApoE+小鼠通过低脂饲料饮食，主动脉树有少量斑块形成；通过高脂饲料饮食后，斑块面积显著增加，RECSl+ApoE+小鼠的主动脉树、主动脉窦的斑块面积均显著小于ApoE+小鼠(图1-2)。
[0012]2.RECSl基因敲除显著增强主动脉窦斑块的稳定性
本发明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠与RECSl/ApoE双基因敲除(RECSl+ApoE+)小鼠为实验对象，通过高脂饲料饮食诱导获得动脉粥样硬化小鼠模型(AS)，对主动脉窦斑块的稳定性进行研究。结果表明RECSl基因敲除显著减少主动脉窦斑块内巨噬细胞的含量和坏死中心的面积，增加斑块内平滑肌细胞的含量和胶原成分含量，增强了主动脉窦斑块的稳定性(图3)。
[0013]3.RECSl基因敲除显著减轻了炎症反应
本发明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠与RECSl/ApoE双基因敲除(RECSl+ApoE+)小鼠为实验对象，通过高脂饲料饮食诱导获得动脉粥样硬化小鼠模型(AS)，对主动脉窦斑块的炎症因子的表达进行研究。结果表明RECSl基因敲除显著降低了主动脉窦斑块的ICAM-1和IL-6等促炎因子，升高了 IL-1O等抗炎因子的表达水平(图4)。
[0014]由以上结果可知发生动脉粥样硬化时，RECSl基因缺陷减少了斑块面积，增强主动脉窦斑块的稳定性，显著减轻了炎症反应。因此RECSl具有促进动脉粥样硬化发生发展的作用，为研究防治动脉粥样硬化的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。
[0015]因此，RECSl基因可作为药物靶点，构建RECSl基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物；RECS1基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的目的。例如以RECSl为靶基因，设计可干扰RECSl表达的双链siRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA干扰的方法使RECSl基因沉默来治疗动脉粥样硬化；还可以设计并构建RECSl的突变体，注射后进入细胞，竞争RECSl原形的作用底物，从而抑制RECSl的功能，起到治疗目的；此外，还可以以RECSl为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用RECSl基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制RECSl的分子，从而为动脉粥样硬化的治疗提供新的治疗性分子。
[0016]针对RECSl的上述功能，提供RECSl作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
[0017]针对RECSl的上述功能，提供RECSl的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
[0018]一种预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物，包含RECSl的抑制剂。
[0019]所述的RECSl的抑制剂优选为RECSl基因的siRNA、RECSl基因的RNA干扰载体，RECSl的抗体及其他能够抑制RECSl表达的抑制剂中的一种。
[0020]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
1.本发明发现RECSl基因的新功能，即RECSl能够促进动脉粥样硬化的作用。
[0021]2.基于RECSl促进动脉粥样硬化的功能，为研制动脉粥样硬化的药物提供靶标。
[0022]3.RECSl的抑制剂可用于制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是ApoE+和RECSl+ApoE+小鼠的主动脉树油红O染色及斑块面积统计图，结果表明RECSl基因敲除显著减少了主动脉树的斑块面积(NS:无显著性差异)。
[0024]图2是ApoE+和RECSl+ApoE+小鼠主动脉窦HE染色及斑块面积统计柱状图，结果表明RECSl基因敲除显著减少了主动脉窦的斑块面积(*:p < 0.05 vs HFD ApoE+组)。
[0025]图3是ApoE+和RECSl+ApoE+小鼠的主动脉窦斑块内坏死中心、胶原成分、巨噬细胞及平滑肌细胞含量染色及结果统计柱状图，结果表明RECSl基因敲除显著减少主动脉窦斑块内巨噬细胞的含量和坏死中心的面积，增加斑块内平滑肌细胞的含量和胶原成分含量(*:p < 0.05 vs HFD ApoE+ 组)。
[0026]图4是ApoE+和RECSl+ApoE+小鼠的主动脉窦斑块内ICAM-1、IL-6、IL-1O等炎症因子的表达水平免疫荧光染色及结果统计柱状图，结果表明RECSl基因敲除显著降低了主动脉窦斑块的促炎因子ICAM-1和IL-6的表达水平，升高了抗炎因子IL-1O的表达水平(*:p < 0.05 vs HFD ApoE+ 组)。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0028]实验用动物及饲养
实验动物种属，性别，周龄及来源=ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠与RECSl/ApoE双基因敲除(RECSl+ApoE+)小鼠，雄性，8周龄，体重19_25g。ApoE基因敲除小鼠(ApoE+，购自Jackson Laboratory,货号002052) ；RECSI , ApoE ,小鼠由RECSl基因敲除小鼠(购自日本RIKEN公司，货号:RBRC01772)和ApoE基因敲除小鼠杂交得到。
[0029]实验动物饲料配方:高脂饲料(HFD，购自北京华阜康生物科技有限公司，按AIN-76 A Western Diets配方，热量百分比:蛋白质15.8%，脂肪40%，碳水化合物44.2%);低脂饲料(NC，购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B):热量百分比:蛋白质20%，碳水化合物70%，脂肪10%。
[0030]动物饲养及环境条件:所有的实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级动物房(许可证号=SYXK (鄂):2009-0053)。每12小时交替照明，温度24±2°C，湿度40%-70%，小鼠自由饮水进食。
[0031]实施例1小鼠动脉粥样硬化模型(AS)获得
1.实验动物分组:选用8周龄，体重19-25g，雄性，ApoE+小鼠和RECSl+ApoE+小鼠，分别给予高脂饲料(Western Diets, HFD)和低脂饲料(Normal chow, NC)饲养,ApoE+ HFD组，ApoE+ NC 组，RECSl+ApoE+ HFD 组，RECSl+ApoE+ NC 组共 4 个组别，每组各 20 只。
[0032]2.动脉粥样硬化模型通过高脂饲料诱导操作流程:
采用ApoE+小鼠和RECSl+ApoE+小鼠，建立AS模型，进行表型相关分析，明确RECSl基因对动脉粥样硬化疾病发挥的作用。小鼠从8周龄开始，HFD组全程高脂饲料喂养28周处死并收集样本，NC组全程低脂饲料喂养28周处死并收集样本。
[0033]实施例2 AS模型小鼠斑块面积测定
1.小鼠终末组织取材
小鼠喂养高脂或低脂饲料直至28周时，称重，用3%戊巴比妥钠，90mg/kg麻醉小鼠，用针头固定于取材板，用纱布湿润小鼠胸腹部皮肤，用眼科剪剪开胸腔，暴露心脏，剪开右心耳，把输液器的针头刺进左心室，用50mL注射器缓慢推注10-15mL PBS缓冲液，待右心耳流出液清亮，换上4%多聚甲醛继续推注10-15mL。灌流结束后，清除胸腹腔脏器，仅保留心脏。将小鼠置于显微镜下，分离主动脉弓周围筋膜、脂肪组织，在升主动脉起始部剪下心脏，在胸主动脉中部剪断，并在颈总和锁骨下约3mm处剪断，把主动脉弓放入上述EP管中。
[0034]2.主动脉树斑块面积测定
主动脉树置于4%多聚甲醛中隔夜固定一纯水漂洗30min — 60%异丙醇处理10 min —油红O染液(公司sigma，货号00625)染色60min — 60%异丙醇漂洗IminX 3次至背景干净一解剖镜下去除残余外壁脂肪一将染色好的动脉平铺于黑色解剖蜡板上，染色后用数码相机拍照，并使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行斑块面积定量测定(油红O原液=0.5克油红0+100毫升100%异丙醇，油红O染液(工作液)=V (油红O原液)/ V (H2O)=3/2)。
[0035]主动脉树斑块面积(％)=斑块总面积/主动脉树总面积*100%。
[0036]3.病理组织处理
3.1石蜡标本制备
4%多聚甲醛中隔夜固定后，将主动脉弓用滤纸小心包好，以防从包埋框间隙中漏出。流水冲洗30min后放入脱水机，30%乙醇15min — 50%乙醇15min — 75%乙醇15min — 85%乙醇 15min — 95% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min — 二甲苯 15min —二甲苯15min —石腊30min —石腊30min。主动脉弓脱水完成后,从脱水机拿出，主动脉弓平躺于石蜡中。
[0037]3.2主动脉组织切片
使用切片机对主动脉窦石蜡标本切片(切片厚度5 μ m)。
[0038]4.主动脉窦斑块面积测定
苏木素伊红染色(HE染色):取主动脉窦石蜡白片65°C烘烤30分钟一二甲苯5分钟X 3次一100%乙醇I分钟一95%乙醇I分钟一70%乙醇I分钟一纯水漂洗(以玻片上不挂有水珠为标准)一甩尽载玻片上的水分，苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021)浸染5分钟一自来水漂洗(去除玻片上苏木素的浮色)一1%盐酸乙醇1-3秒一自来水漂洗(去除玻片上盐酸乙醇)一Scott液(碳酸氢钠0.35g,硫酸镁2g,蒸懼水10mDl分钟一自来水浸洗(去除玻片上的Scott液)一甩尽在玻片上的水分，伊红溶液(珠海贝索，BA-4024)染色10秒钟一纯水漂洗(去除玻片上伊红的浮色)一70%乙醇一下一95%乙醇一下一100%乙醇30秒，3次一二甲苯2分钟，3次一趁二甲苯未干时封片(以切片无气泡为原则)一通风橱内吹干，显微镜拍照。
[0039]HE染色图片统计:直接用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件圈主动脉窦斑块面积。
[0040]通过主动脉树油红O染色可大体评估整条血管上动脉粥样硬化斑块形成的多少、分布情况及斑块面积的大小。图1是小鼠AS模型后主动脉树油红O染色结果图，头臂干和主动脉窦是动脉粥样硬化斑块最明显的部位，ApoE+和RECSl+ApoE+小鼠通过低脂饲料饮食，主动脉树就有少量斑块形成，且RECSl+ApoE+小鼠的斑块面积和ApoE+小鼠无显著差异；通过高脂饮食后，斑块含量显著增加，RECSl+ApoE+小鼠的主动脉树斑块面积显著小于ApoE+小鼠。图2是小鼠AS模型后主动脉窦HE染色结果图，结果表明经高脂饮食后RECSl+ApoE+小鼠的主动脉窦的斑块面积显著小于ApoE+小鼠。以上结果表明RECSl基因敲除显著降低了动脉粥样硬化的斑块面积。
[0041]实施例3 AS模型小鼠斑块稳定性的测定 1.主动脉窦坏死中心的面积大小测定
苏木素伊红染色(HE染色)，方法同实施例2.4，选取含胆固醇结晶、无细胞核纤维结构的组织显微镜拍照。
[0042]坏死中心的面积测定:使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件圈坏死中心面积。
[0043]2.主动脉窦胶原成分含量测定:
天狼星红(PSR)染色，主要步骤为:取主动脉窦石蜡白片55°C烘烤30min—二甲苯2min, 3次一100%酒精Imin — 95%酒精Imin — 70%酒精Imin —流水冲洗1min —双蒸水Imin —质量分数0.2%磷钥酸2min — 0.1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上,湿盒中染色90min —去除残液一0.0lN盐酸4s — 70%酒精I次一90%酒精I次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。
[0044]胶原比例测定:使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件圈红色胶原面积,胶原比例(％)=胶原面积/斑块面积*100%。
[0045]3.主动脉窦巨噬细胞及平滑肌细胞标志物的表达测定
免疫荧光染色检测主动脉窦巨噬细胞标志物⑶68，平滑肌细胞标志物SMA (SmoothMuscle Actin)的表达。所需一抗信息:CD68 (MCA1957; 1:100; rat; AbD Serotec),SMA(ab5694; 1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 goat ant1-rat IgG(Al1077 ；Invitrogen), Alexa Fluor 488-conjugated goat ant1-rabbit IgG (Al1008 ；Invitrogen)。
[0046]主要步骤为:
I)烤片:将主动脉窦石蜡白片置于烤箱中30min以上。
[0047]2)脱蜡:二甲苯 5minX3 次。
[0048]3)水合:100% 乙醇 5minX2 次；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ;ddH20浸洗 5minX2次。
[0049]4)柠檬酸盐组织抗原修复(高压修复):取一定量的pH6.0柠檬酸盐抗原修复工作液于修复盒中，放入高压锅中，大火加热至沸腾，将脱蜡水合后的组织切片置于修复盒中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时5min后，取出修复盒；室温放置20min，自然冷却后取出切片。
[0050]5 ) ddH20 漂洗 5min X 2 次，PBS 漂洗 5min X 2 次。
[0051]6)组化笔划圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封闭，于湿盒中37°C封闭60mino
[0052]7)弃封闭液,滴加适当比例稀释的一抗，4°C孵育过夜,37°C复温30min,弃去一抗，PBS 洗 1minX 3 次。
[0053]8)滴加二抗，于湿盒中37°C孵育60min，弃去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0054]9) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0055]10)荧光镜下观察，拍照。
[0056]突光定量统计:使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对阳性细胞计数测定，CD68/SMA (%)=阳性细胞数/斑块面积*100%。
[0057]巨噬细胞是斑块内最重要的细胞成分，它主要有血液循环单核细胞进入内皮下后分化而来，单核/巨噬细胞可分泌多种粘附、趋化因子如细胞黏附分子(ICAM-1)、单核细胞趋化和激活因子(MCP-1)等，增进斑块内细胞的进入，此外巨噬细胞还可分泌多种基质金属蛋白酶(MMPs)，降低斑块内胶原面积，从而破坏斑块的稳定性；平滑肌细胞可分泌多种细胞基质，是动脉粥样硬化斑块内分泌胶原的细胞源，主要作用是修复被破坏的细胞基质成分从而起到保护作用；胶原成分是斑块内最重要的细胞外基质，也是纤维帽的主要成分，具有抗血流冲击防止斑块破裂的作用，也是维护斑块稳定性的重要评估指标。
[0058]图3是ApoE+小鼠和RECSl+ApoE+小鼠的主动脉窦斑块内含物的分析结果图。主动脉窦HE染色可见RECSl+ApoE+小鼠的坏死中心面积明显小于ApoE+小鼠；PSR染色结果表明高脂饮食后的模型，RECSl+ApoE+组小鼠的胶原比例明显高于ApoE+小鼠；免疫荧光发观察巨噬细胞标志物⑶68在RECSl+ApoE+小鼠斑块内的表达量则显著低于ApoE+小鼠；平滑肌细胞标志物SMA在RECSl+ApoE+小鼠斑块内的表达量明显高于ApoE+小鼠。以上结果表明RECSl基因敲除显著减少主动脉窦斑块内巨噬细胞的含量和坏死中心的面积，增加斑块内平滑肌细胞的含量和胶原成分含量；RECS1基因敲除可以增强主动脉窦斑块的稳定性(图3)。
[0059]实施例4 AS模型小鼠斑块内炎症因子表达的测定
免疫荧光染色检测主动脉窦ICAM-1、IL-6、IL-1O等炎症因子的表达。所需一抗信息:ICAM-1CAF796 ； 1:100 ；goat ；R&D systems)、IL-6(AF-406_NA ； 1:100 ；goat ；R&D systems)、IL-1O (AF-217-NA ； 1:100 ；goat ；R&D systems);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 donkeyant1-goat IgG (A11057 ;Invitrogen)。
[0060]主要步骤为:参见实施例3.3。
[0061]荧光定量统计:使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对阳性细胞进行吸光度(1D)测定。
[0062]炎症反应是导致动脉粥样硬化斑块破裂的主要因素之一。炎性细胞分泌大量细胞因子如白细胞介素6 (IL-6)，白细胞介素10 (IL-1O)等可导致内皮细胞的活化、平滑肌细胞的增生、凋亡及粥样病变的进展。受损的内皮细胞和单核/巨噬细胞分泌的粘附、趋化因子是介导炎症细胞向动脉粥样硬化斑块聚集的关键因子。通过免疫荧光染色观察ICAM-1、IL-6、IL-10等炎症因子的表达变化，结果表明RECSl基因敲除显著降低了主动脉窦斑块内促炎因子ICAM-1、IL-6的表达水平，升高了 IL-1O抑炎症因子的表达水平(图4)。
[0063]上述实施例结果显示，ApoE+小鼠及RECSl+ApoE+小鼠在高脂饮食的诱导下发生动脉粥样硬化，和ApoE+小鼠相比，RECSI/ApoE双基因敲除后小鼠的主动脉斑块面积显著减少，斑块稳定性也增加，炎症反应明显减轻。这些结果表明，RECSl可显著促进主动脉斑块的形成和动脉粥样硬化的发生发展。本发明证明了 RECSl在动脉粥样硬化模型中有着重要的恶化作用，其抑制剂可用于制备治疗动脉粥样硬化疾病的药物。
[0064]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.RECSl作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
2.RECSl的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
3.一种预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物，其特征在于:包含RECSl的抑制剂。
4.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的药物，其特征在于:所述的RECSl的抑制剂为RECSl基因的siRNA、RECSl基因的RNA干扰载体或RECSl的抗体及其他能够抑制RECSl表达的抑制剂中的一种。
【文档编号】A61P9/10GK104324389SQ201410512511
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】李红良, 赵光年, 王丕晓, 邓克穷 申请人:武汉大学