本申请要求2014年6月2日提交的美国临时申请第62/006,693号的优先权，该申请的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及通过施用苯氧基烷基羧酸(诸如MN-001和MN-002)抑制、减少或治疗纤维化、导致它的疾患或者由它引起的疾患、和/或其各自的副作用的方法。
背景技术：
纤维化通常可以被定义为通过器官纤维母细胞过度沉积细胞外基质(ECM)组分，诸如纤连蛋白(FN)和I型胶原(Col1α1)。器官纤维化是导致终末期器官衰竭的许多疾病的最终的共同途径。然而，无法获得用于器官纤维化的有效疗法。不可控的伤口愈合响应，包括急性和慢性炎症、血管生成、驻留细胞的激活以及ECM重塑，被认为参与了纤维化的发病机制。TGF-β是一种原型纤维化细胞因子，其在纤维化器官中增加并通过刺激ECM分子的合成、将纤维母细胞活化为表达α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的肌成纤维细胞、以及下调基质金属蛋白酶(MMPs)，促进纤维化的进展。然而，在纤维化患者(诸如具有早期继发性硬化症(SSc)的那些患者)中的单克隆抗TGF-β抗体的临床试验未显示任何功效(Varga and Pasche，Nature Reviews Rheumatology 2009；5：200-6)。
技术实现要素：
本申请提供抑制、减少或治疗纤维化、导致它的疾患或者由它引起的疾患、和/或其各自的副作用的方法。所述方法包括施用苯氧基烷基羧酸(其非限制性实例包括MN-001和MN-002)、或其代谢物、或其各自的酯、或上述各自的药学上可接受的盐。
一方面，提供了一种抑制或治疗患有纤维化的患者的纤维化的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的式(I)化合物、式(I)化合物的代谢物、式(I)化合物的酯、或式(I)化合物的酯的代谢物、或上述各自的药学上可接受的盐：
其中，m是2至5的整数(包括2和5)，且n是3至8的整数(包括3和8)，X1和X2各自独立地表示硫、氧、亚硫酰基(-S(O)-)或磺酰基(-S(O)2-)，条件是X1和X2不同时为氧。
另一方面，提供了一种减少和/或抑制患有纤维化的患者的纤维化中升高的羟脯氨酸水平和/或胶原蛋白水平的方法。所述方法包括向患者施用有效量的式(I)化合物、或式(I)化合物的代谢物、或式(I)化合物的酯或式(I)化合物的酯的代谢物、或其各自的药学上可接受的盐。
在一个实施方式中，纤维化排除肺纤维化，诸如特发性和非特发性肺纤维化。在一个实施方式中，纤维化排除肝纤维化，条件是排除的肝纤维化不是病毒性肝炎诱导的纤维化或酒精性肝损伤诱导的肝纤维化。因此，在一个实施方式中，被治疗、减少或抑制的纤维化，是病毒性肝炎诱导的纤维化或酒精性肝损伤诱导的肝纤维化。
在一些实施方式中，被抑制或治疗的纤维化是以下的一种或多种：异常伤口愈合、酒精性肝损伤诱导的肝纤维化、桥接纤维化、克罗恩病(肠的纤维化)、胰腺和肺的囊性纤维化、注射纤维化(其能够作为肌内注射的并发症发生，特别是在儿童中)、心内膜心肌纤维化或心脏纤维化(心脏的纤维化)、由移植物抗宿主病(GVHD)引起的纤维化、脾的纤维化、眼的纤维化(包括视网膜下纤维化)、手术或注射纤维化的纤维化并发症、肾小球肾炎、间质纤维化、瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕(皮肤的纤维化)、黄斑变性、纵隔纤维化(纵隔软组织的纤维化)、硬斑病(morphea)、多灶性纤维硬化症、骨髓纤维化(骨髓的纤维化)、肾源性系统性纤维化(皮肤的纤维化)、结节性表皮下纤维化(例如良性纤维组织细胞瘤)、胸膜纤维化、作为手术结果的纤维化(例如外科植入物)、增殖性纤维化、管干型纤维化(pipestem fibrosis)、纤维蛋白形成后纤维化、进行性大块纤维化(肺的纤维化的一种，煤工尘肺的一种并发症)、陈旧心肌梗死(心脏的纤维化)、胰腺纤维化、进行性大块纤维化、放射性纤维化、肾纤维化、慢性肾病相关的或由慢性肾病引起的肾纤维化、腹膜后纤维化(腹膜后软组织的纤维化)、术后瘢痕、硬皮病/系统性硬化(皮肤的纤维化)、上皮下纤维化、子宫纤维化、和病毒性肝炎诱导的纤维化。
在一个实施方式中，式(I)化合物是式(IA)化合物(或MN-001)：
在另一个实施方式中，式(I)和式(IA)化合物的代谢物是式(IB)化合物(或MN-002)：
具体实施方式
定义
如本文和随附权利要求中所用，除非上下文清楚地指出，否则单数形式“一”(a、an)和“所述”包括复数的指代物。
将药物“施用(Administering)”或“施用(Administration)”于患者(以及该短语的语法等同物)包括直接施用(包括自行施用)以及间接施用(包括开处方药物的行为)。例如，如本文所用，指导患者自行施用药物和/或为患者提供药物处方的医师正在将药物施用于患者。
“Cx”当置于基团之前时指在该基团中的碳原子数目为X。
“烷基”是指具有1个至12个碳原子的一价非环状烃基。烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
“芳基”是指具有多达10个碳原子的一价芳族烃基。芳基的非限制性实例包括苯基和萘基。
“杂芳基”是指在芳族环内具有1个至10个碳原子以及1个至4个选自氧、氮、硫的杂原子的芳族基团，其中杂芳基的氮原子和/或硫原子可选地被氧化(例如，N-氧化物、-S(O)-或-S(O)2-)。此类杂芳基可具有单环(例如，吡啶基或呋喃基)或多个稠环(例如，吲哚嗪基或苯并噻吩基)，其中稠环可以是或可以不是芳族的和/或可以含有或可以不含有杂原子，条件是连接点通过芳族杂芳基的原子。杂芳基的非限制性实例包括吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基和呋喃基。
“环烷基”是指具有3个至12个碳原子的一价非芳族环状烃基。环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
“杂环基”是指在环内具有1个至10个碳原子以及1个至4个选自氧、氮、硫的杂原子的一价非芳族环状基团，其中杂芳基的氮原子和/或硫原子可选地被氧化(例如，N-氧化物、-S(O)-或-S(O)2-)。此类杂芳基可具有单环(例如，哌啶基或四氢呋喃基)或多个稠环，其中稠环可以是或可以不是芳族的和/或可以含有或可以不含有杂原子，条件是连接点通过非芳族杂环基的原子。杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基等。
“氨基”是指-NH2。
“烷基氨基”是指-NHRB，其中RB是任选地用1个至3个芳基、杂芳基、环烷基或杂环基基团取代的C1-C6烷基。
“二烷基氨基”是指-N(RB)2，其中RB如上所定义。
“包括/包含”应意指方法和组合物包括列举的要素，但不排除其它要素。“基本上由……组成”，当用于定义方法和组合物时，应意指为了陈述的目的，排除对组合具有任何重要意义的其它要素。因此，例如，基本上由本文所定义的要素组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的微量污染物及药学上可接受的载体、诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由……组成”应意指排除多于微量的其它成分要素及用于施用本发明的组合物的实质性方法步骤或者产生组合物或获得预期结果的方法步骤。由这些过渡术语和短语中的每一者定义的实施方式在本发明的范围内。
本文所用的化合物的“有效量”是当向如本文所治疗的患者施用时将具有预期疗效(如患者的医学病况的一种或多种表现的减轻、改善、缓解或消除)的量。完全疗效不一定通过施用一剂(或剂量)发生，并且可仅在施用连续剂量后发生。因此，有效量可以以一次或多次施用被施用。
“纤维化”或“纤维发生”是指器官或组织中过量纤维结缔组织的形成，例如在修复或反应过程中。这与作为器官或组织的正常成分的纤维组织的形成相反。在本发明中，术语“纤维化”用于区分异常愈合过程和正常愈合过程。纤维发生或纤维化是通常通过退变(例如，髓(pulp)的纤维化)和成纤维细胞的增殖形成纤维组织的过程。瘢痕是消除了下面的器官或组织的结构的融合性纤维化。纤维化的例子包括但不限于异常伤口愈合、酒精性肝损伤诱导的肝纤维化、桥接纤维化、克罗恩病(肠的纤维化)、胰腺和肺的囊性纤维化、注射纤维化(其能够作为肌内注射的并发症发生，特别是在儿童中)、心内膜心肌纤维化或心脏纤维化(心脏的纤维化)、由移植物抗宿主病(GVHD)引起的纤维化、脾的纤维化、眼的纤维化(包括视网膜下纤维化)，手术或注射纤维化的纤维化并发症、肾小球肾炎、间质纤维化，瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕(皮肤的纤维化)、黄斑变性、纵隔纤维化(纵隔软组织的纤维化)、硬斑病、多灶性纤维硬化症、骨髓纤维化(骨髓的纤维化)、肾源性系统性纤维化(皮肤的纤维化)、结节性表皮下纤维化(例如良性纤维组织细胞瘤)、胸膜纤维化、作为手术结果的纤维化(例如外科植入物)、增殖性纤维化、管干型纤维化、纤维蛋白形成后纤维化、进行性大块纤维化(肺纤维化的一种，煤工尘肺的一种并发症)、陈旧心肌梗死(心脏的纤维化)、胰腺纤维化、进行性大块纤维化、放射性纤维化、肾纤维化、慢性肾病相关的肾纤维化、腹膜后纤维化(腹膜后软组织的纤维化)、术后瘢痕、硬皮病/系统性硬化(皮肤的纤维化)、上皮下纤维化、子宫纤维化、和病毒性肝炎诱导的纤维化。
机械地，并且不受理论的约束地，通过器官成纤维细胞过度沉积ECM组分、诸如纤连蛋白(FN)和I型胶原(Col1α1)可以引起纤维化。器官纤维化是导致终末期器官衰竭的许多疾病的最终的共同途径。不可控的伤口愈合响应，包括急性和慢性炎症、血管生成、驻留细胞的激活以及ECM重塑，被认为参与了纤维化的发病机制。TGF-β是一种纤维化细胞因子，其在纤维化器官中增加，并通过刺激ECM分子的合成、将纤维母细胞活化为表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的肌成纤维细胞、以及下调基质金属蛋白酶(MMP)，促进纤维化的进展。
“药学上可接受的”是指无毒且适于施用给患者、包括人患者。
“药学上可接受的盐”是指无毒且适于施用给患者的盐。非限制性实例包括碱金属盐、碱土金属盐和各种伯铵盐、仲铵盐和叔铵盐。当式(I)化合物的酯包括阳离子部分时，例如当所述酯包括氨基酸酯时，其盐可包括各种羧酸盐、磺酸盐和矿物酸盐(miner acid salt)。盐的某些非限制性实例包括钠盐、钾盐和钙盐。
“保护基团”是指众所周知的官能团，当结合至官能团时其使得所得的受保护的官能团对于待在化合物的其它部分上进行的反应以及相应的反应条件是惰性的，且该官能团可在去保护条件下反应再生原始官能度。保护基团被选择成与分子的剩余部分相容。“羧酸保护基团”在苯氧基烷基羧酸的合成期间保护苯氧基烷基羧酸的羧酸官能度。羧酸保护基团的非限制性实例包括苄基、对甲氧基苄基、对硝基苄基、烯丙基、二苯甲基和三苯甲基。羧酸保护基团的另外实例见于标准参考著作中，诸如Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第2版，1991，John Wiley&Sons和McOmie Protective Groups in Organic Chemistry，1975，Plenum Press。用于保护和去保护本文公开的羧酸的方法可见于本领域中，且特别见于Greene和Wuts，同上及其引用的文献。
“治疗”医学疾患或患者是指采取步骤以获得有益的或所需的结果，包括临床结果。为了本发明的各方面和实施方式的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于减少、减轻或改善肺纤维化的一种或多种表现或副作用，改善一种或多种临床结果，减小纤维化的程度，延缓或减缓纤维化的进展，改善、缓解或稳定纤维化状态，及本文所述的其它有益结果。
本申请提供施用有效量的式(I)化合物或其代谢物、或式(I)化合物的酯或其代谢物、或上述各自的药学上可接受的盐的方法，其中，变量如本文所定义：
如本文所用，“其代谢物”是指显示与式(I)化合物基本上类似的治疗活性的代谢物。此类代谢物的非限制性实例包括化合物，其中式(I)化合物的附接至含有-O-(CH2)nCO2H部分的苯基的-COCH3基团被代谢为1-羟乙基(即-CH(OH)Me)基团。
含有1-羟乙基基团的代谢物在1-羟乙基基团的1-位上含有不对称中心。相应的对映异构体及其混合物(包括外消旋混合物)包括在如本文使用的式(I)化合物的代谢物的范围内。
如本文所用，“其酯”是指酚羟基基团的酯和/或式(I)化合物中显示的羧酸的酯，及式(I)化合物的代谢物的1-羟乙基基团(脂肪族羟基基团)的酯。酚羟基基团和/或脂肪族羟基基团的酯可包括但不限于作为相应的酸的羧酸RA-CO2H，其中RA是C1-C6烷基、芳基、杂芳基、C3-C12环烷基或C2-C8杂环基，其中烷基、芳基、杂芳基、环烷基或杂环基任选地被1个至4个C1-C3烷基、芳基、CO2H、氨基、烷基氨基或二烷基氨基基团取代。也考虑了其它酸，诸如单磷酸、二磷酸或三磷酸。羧酸酯可包括但不限于作为相应的醇的式RA-OH化合物，其中RA如上所定义。在一个实施方式中，仅式(I)中的羧酸被酯化。在另一个实施方式中，仅式(I)中的酚羟基基团被酯化。在另一个实施方式中，RA是C1-C4烷基。如对于本领域技术人员将显而易见的是，此类酯用作前药，其在体内被水解以释放式(I)化合物或其盐。
在一个实施方式中，式(I)化合物是式(IA)化合物：
在另一个实施方式中，式(I)和式(IA)化合物的代谢物是式(IB)化合物：
在另一个实施方式中，所述化合物经口施用。在另一个实施方式中，所述化合物作为片剂或胶囊剂施用。在另一个实施方式中，式(IA)化合物以基本上不含其它多晶型的多晶型A存在。在另一个实施方式中，所述化合物作为液体剂型施用。在另一个实施方式中，所述化合物以分成一份、两份或三份的大约100mg/天至大约4000mg/天的量施用。
本文所用的化合物的功效可通过技术人员众所周知的方法，诸如在实施例部分所阐明的方法进行测试。
合成
式(I)化合物的合成和某些生物活性描述于美国专利No.4,985,585中，其通过引用整体并入本文。例如，式(IA)化合物通过使式(II)的苯酚与式(III)化合物反应以提供式(IC)化合物来制备：
其中，R是羧酸保护基团，
酸性保护基团或R基团的非限制性实例包括C1-C6烷基、苄基、二苯甲基和三苯甲基，其中苄基、二苯甲基或三苯甲基基团任选地被1个至6个C1-C6烷基、卤素基团和/或C1-C6烷氧基基团取代。对于本领域技术人员显而易见的是可使用不同于式(III)中的溴基团的离去基团。此类其它离去基团的非限制性实例包括氯或甲苯磺酸根。
式(IC)的受保护的羧酸的脱保护提供了式(IA)化合物。基于本申请显而易见的是，式(IC)化合物在根据本发明的一些实施方式中是有用的。脱保护方法的非限制性实例包括碱性水解和在H2以及诸如Pd/C或Pt/C的催化剂下的氢解。
反应在惰性有机溶剂中进行，该惰性有机溶剂例如且不限于丙酮、甲基乙基酮、二乙基酮或二甲基甲酰胺。亲核取代反应可在低于室温的温度(高达溶剂回流温度)下在无机基质(诸如碳酸钾或碳酸钠)的存在下和任选地在碘化钾的存在下进行。反应进行一段足以提供如通过众所周知的方法(诸如薄层色谱法和1H-NMR)确定的大量产物的时间段。本文利用的其它化合物通过遵循本文所描述的步骤以及起始材料的适当取代和/或遵循技术人员熟知的方法制得。还参见美国专利No.5,290,812(通过引用以其整体并入本文)。
将式(IA)化合物在控制的条件下重结晶以提供基本上纯的斜方晶系多晶型物，被称为A型晶体(如90％或更多、优选至少95％的A型)。多晶型A和用于产生其的方法描述于美国专利No.7,060,854和No.7,064,146中；其通过引用整体并入本文。式(I)化合物的所有多晶型是活性的，但多晶型A是优选的。在某些条件下，该多晶型物的溶解度和生物利用率优于其它多晶型物，因此A型可提供改善的固体制剂。
A型晶体可例如通过在25℃至40℃下将式(IA)化合物溶解于5重量份至10重量份的乙醇中以得到黄色至橘色溶液而获得。向乙醇溶液装入1份至10份水，并在20℃至25℃下搅动约15分钟至60分钟，然后在5℃至10℃下再搅动1小时至4小时、优选2.0小时至3.0小时的额外的时间段，从而产生灰白色混悬液。向该混悬液添加5份至15份水，并将混合物在5℃至10℃下再搅动1小时至4小时、优选1.5小时至2.0小时。将固态的白色至灰白色的产物通过真空过滤分离，将滤饼用水洗涤并在25℃至40℃下真空干燥12小时至24小时。
对于本文所用的以对映体形式存在的化合物，如式(I)化合物的某些代谢物(例如，式IB化合物)，两种对映体可在光学上进行拆分。此类拆分通过例如但不限于与相应的羧酸化合物形成碱(如(S)-(-)-1-(1-萘基)乙胺)的非对映盐，或通过使用手性柱色谱法分离对映体来进行。此类化合物的中间体也可以进行类似地拆分，所述中间体也以对映体形式存在。
施用和配制
本文所用的化合物可经口或通过静脉内、肌内和皮下注射或透皮方法施用。有效的剂量水平可广泛变化，如约100mg/天至约4000mg/天。在一个实施方式中，每日剂量范围是250mg至2000mg，以一份、两份或三份给予。在一个实施方式中，每日剂量范围是100mg至500mg，如100mg、200mg、300mg、400mg或500mg，以一份、两份或三份给予。在一个实施方式中，每日剂量范围是250mg至2000mg，如250mg、500mg、750mg、1000mg、1250mg、1500mg、1750mg或2000mg，以一份、两份或三份给予。在一个实施方式中，每日剂量范围是1000mg至4000mg，如1000mg、2000mg、3000mg或4000mg，以一份、两份或三份给予。在另一个实施方式中，所述剂量是1000mg，每天两次。在另外的实施方式中，适合的剂量包括1000mg qd(每天一次)、1000mg bid(每天两次)和750mg tid(每天三次)。
实际量应取决于正在治疗的患者的情况。如本领域技术人员公认的，改变活性物质作用的许多因素被治疗医师考虑在内，如患者的年龄、体重、性别、饮食和病况、施用时间、施用速率和途径。对于给定疾患组的最佳剂量可以由本领域技术人员使用常规的剂量测定试验来确定。
本文所用的化合物可以以任何药学上可接受的形式进行配制，包括液体、粉末、乳膏剂、乳剂、丸剂、锭剂、栓剂、混悬剂、溶液等。含有本文所用的化合物的治疗组合物将通常根据已知的且确定的实践与一种或多种药学上可接受的成分一起配制。通常，利用例如约10重量％的单独的或与羧甲基纤维素(Avicel)组合的载体(如改性淀粉)形成片剂。在片剂形成过程中，在1000磅至3000磅压力下压缩制剂。片剂优选显示出的平均硬度为约1.5kp/cm2至8.0kp/cm2，优选为5.0kp/cm2至7.5kp/cm2。崩解时间从约30秒变化至约15分钟或20分钟。
用于口服使用的制剂可以被提供为硬胶囊，其中本文利用的治疗活性化合物与诸如碳酸钙、磷酸钙或高岭土的惰性固体稀释剂混合；或者被提供为软胶胶囊，其中化合物与油性介质，例如液状石蜡或橄榄油混合。合适的载体包括碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。
本文所用的化合物可被配制为与药学上可接受的赋形剂混合的水性混悬剂，所述药学上可接受的赋形剂如悬浮剂，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、或者碱性氧化物与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、或者环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethylene-oxycetanol))、或者环氧乙烷与源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)、或者环氧乙烷与源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)。此类水性混悬剂还可以含有一种或多种防腐剂(例如乙基-或-正丙基-对羟基苯甲酸酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂(如甘油、山梨糖醇、蔗糖、糖精或环己基氨基磺酸钠或环己基氨基磺酸钙)。
适合的制剂还包括缓释剂型，诸如美国专利No.4,788,055；No.4,816,264；No.4,828,836；No.4,834,965；No.4,834,985；No.4,996,047；No.5,071,646；和No.5,133,974中描述的那些，其内容通过引用整体并入本文。
适合于口服施用的其它形式包括液体形式制剂(包括乳剂、糖浆剂、酏剂、水溶液)、或者固体形式制剂(其用来在使用前即刻转化成液体形式制剂)。乳剂可以在溶液中(例如，在丙二醇水溶液中)制备，或者可以含有乳化剂，例如卵磷脂、山梨聚糖单油酸酯或阿拉伯胶。水溶液可以通过将活性组分溶解于水并添加合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。固体形式制剂可以含有除活性组分之外的着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人工甜味剂和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、溶解剂等。
本文所用的化合物可以被配制用于肠胃外施用(例如通过注射，例如快速注射或连续输注)并且可以以单位剂量形式存在于添加了防腐剂的安瓿、预装注射器、小体积输注或多剂量容器中。组合物可以采用诸如在油或水媒介物中的混悬剂、溶液或乳剂的形式，例如聚乙二醇水溶液的形式。油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如，橄榄油)和可注射的有机酯(例如，油酸乙酯)，并且可以含有诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂或悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制剂。可替选地，活性成分可以为通过无菌固体的无菌分离或通过溶液的冷冻干燥获得的粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌、无热原的水)复溶(constitution)。
本文所用的化合物可配制用于经鼻施用。将溶液或混悬剂通过常见方法例如用滴管、移液管或喷雾直接施加至鼻腔。所述制剂可以单剂量或多剂量形式提供。患者可经由滴管或移液管施用适当的预定体积的溶液或混悬剂。喷雾可例如通过计量雾化喷雾泵的方式施用。
本文所用的化合物可以被配制用于气溶胶施用，特别是至呼吸道并且包括鼻内施用。化合物将通常具有例如大约5微米或更小的小粒径。此类粒径可以通过本领域已知的方法，例如通过微粉化获得。用合适的推进剂如氟氯化碳(CFC)(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷)、二氧化碳或其它合适的气体在加压包中提供活性成分。气溶胶还可以适当地含有诸如卵磷脂的表面活性剂。药物的剂量可以通过计量阀控制。可替选地，活性成分可以以干粉的形式提供，例如在合适的粉末基质如乳糖、淀粉、淀粉衍生物(如羟丙基甲基纤维素)和聚乙烯吡咯烷中的化合物的粉末混合物。粉末载体将在鼻腔中形成凝胶。粉末组合物可以以单位剂量形式存在于例如明胶或泡罩包装的胶囊或药筒中，该粉末可从所述明胶或泡罩包装的胶囊或药筒通过吸入器的方式施用。
本文所用的化合物可以被配制用于以软膏剂、乳膏剂或洗剂、或者以透皮贴剂局部施用于表皮。软膏剂和乳膏剂可以例如用添加合适的增稠剂和/或胶凝剂的水性基质或油性基质来配制。洗剂可以用水性基质或油性基质配制并且将通常还含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。适合于在口中局部施用的制剂包括在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含活性剂的锭剂；在诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶的惰性基质中包含活性成分的糖果锭剂；以及在合适的液体载体中包含活性成分的漱口水。
本文所用的化合物可以被配制成栓剂用于施用。在此类制剂中，低熔点蜡，如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物首先熔化，活性组分例如通过搅拌均匀分散。然后，将熔化的均匀混合物倒入合适尺寸的模具中，以使冷却和固化。
本文所用的化合物可以被配制用于阴道施用。除了活性成分之外含有此类载体的阴道栓、棉塞、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾剂是本领域已知适当的。
当需要时，制剂可以制备有适合于活性成分的缓释或控释施用的肠溶包衣。可以用于本发明目的的常见类型的控释制剂包括惰性芯(如糖球)、第一层(其包被有含有内层药物的第二层)以及控制内层药物释放的外膜或第三层。
芯部优选是水溶性或可膨胀的材料，并且可以为常规地用作芯的任何此类材料或制成珠或球的任何其它药学上可接受的水溶性或水可膨胀的材料。芯可以为材料(如蔗糖/淀粉(糖球NF)、蔗糖晶体)的球体或通常由诸如微晶纤维素和乳糖的赋形剂组成的挤出的且干燥的球体。
第一层中基本上水不溶性材料通常是“GI不溶性”或“GI部分不溶性”成膜聚合物(分散或溶解于溶剂中)。作为例子可提及乙基纤维素、醋酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、聚甲基丙烯酸酯(诸如丙烯酸乙酯/甲基丙烯酸甲酯共聚物(Eudragit NE-30-D)和甲基丙烯酸铵酯共聚物A型和B型(Eudragit RL30D和RS30D))、及硅酮弹性体。通常，增塑剂与所述聚合物一起使用。示例性增塑剂包括：癸二酸二丁酯、丙二醇、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、蓖麻油、乙酰化单甘酯、乙酰基柠檬酸三乙酯、乙酰基柠檬酸丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、三醋精、分馏椰子油(中链甘油三酯)。
含有活性成分的第二层可以由含有或不含作为粘合剂的聚合物的活性成分(药物)组成。当使用时，粘合剂通常为亲水的，但是可以为水溶性的或水不溶性的。在含有活性药物的第二层中使用的示例性聚合物为亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮，聚烷撑二醇(如聚乙二醇)，明胶，聚乙烯醇，淀粉及其衍生物，纤维素衍生物(如羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素)，丙烯酸聚合物，聚甲基丙烯酸酯或任何其它药学上可接受的聚合物。在第二层中药物与亲水聚合物的比率通常在1:100至100:1(w/w)的范围内。
适用于第三层或膜中用于控制药物释放的聚合物可选自任选地与增塑剂(诸如上文提及的那些)组合的水不溶性聚合物或具有pH-依赖性溶解度的聚合物，诸如，例如乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸纤维素偏苯三酸酯、聚甲基丙烯酸酯或其混合物。
可选地，控释层包括除上述聚合物之外的具有不同溶解度特性的另外的物质以调节渗透性，从而调节控释层的释放速率。可以与例如乙基纤维素一起用作改性剂的示例性聚合物包括：HPMC、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇、具有pH-依赖性溶解度的聚合物(如醋酸纤维素邻苯二甲酸酯或甲基丙烯酸铵酯共聚物和甲基丙烯酸共聚物)、或它们的混合物。如果需要的话，添加剂，如蔗糖、乳糖和药物级表面活性剂也可以包括在控释层中。
本文还提供了制剂的单位剂型。在此类形式中，所述制剂被细分为含有适当量的活性组分(例如且不限于式(I)化合物或其酯、或者其各自的盐)的单位剂量。所述单位剂型可为包装制剂，所述包装含有离散量的制剂，诸如于小瓶或安瓿中的包装的片剂、胶囊剂和粉剂。此外，单位剂型可为胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者其可为呈包装形式的适当数量的任何胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂。
其它适合的药物载体及其制剂描述于Remington：The Science and Practice of Pharmacy 1995，E.W.Martin编著，Mack Publishing Company，第19版，Easton，Pa中。
参考下面的实施例，将更加容易地理解由此一般地描述的本发明，该实施例作为说明提供且不用于限定本发明。
实施例
以下试验可用于证明MN-001、MN-002或本文所用的另一种化合物(统称为“本文所用的化合物”)在纤维化中的治疗有益效果。在本文提供的研究中，评价了本文所用的化合物对纤维化的作用。
实施例1
本文所用的化合物对纤维化的作用通过以下进行评价：体外使用原代人成纤维细胞、体外使用人皮肤、以及体内用TGF-β处理的小鼠皮肤。
材料和方法
原代成纤维细胞培养：培养人原代皮肤成纤维细胞。SSc患者、硬斑病患者和健康供体的临床相关的皮肤被用于原代成纤维细胞培养。将大约2cm的外周和皮肤的块切碎，并且如前所述，在补充有10％FBS、青霉素、链霉素和抗真菌剂的杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养成纤维细胞。使用3至6代之间的细胞。
体外人皮肤试验
从矫正整形手术获得人腹部皮肤。均匀地去除皮下脂肪组织，并将皮肤组织切成1.5cm×1.5cm的段。皮内注射以下物质：本文所用的化合物、本文所用的化合物与TGF-β(10ng/ml)的组合、及单独的TGF-β(10ng/ml)。在一些实验中，首先用TGF-β注射人皮肤48小时，随后在与TGF-β相同的注射部位施用本文所用的化合物。独立实验重复两次或者三次。包含完整的表皮层和真皮层的外植体在空气液体界面培养，其中表皮层和角蛋白层朝上且暴露于空气。每隔一天更换培养基。在1周或2周后，使用一次性8mm(Acuderm Inc.，Lauderdale，Fla.)采集对应于以注射部位为中心的直径为8mm的区域的皮肤组织。皮肤组织在包埋于石蜡中之前固定在10％福尔马林中。
体内小鼠实验
CB57BL6/J雄性小鼠购自杰克逊实验室(巴尔港，ME)。将本文所用的化合物单独或与TGF-β(10ng/ml)组合、或TGF-β单独，皮内注射至小鼠背部。注射在小鼠的两个不同的皮肤部位并在注射后一周处死。采集注射部位周围的皮肤并在包埋于石蜡中之前固定在10％福尔马林中。
皮肤真皮厚度的测量
石蜡包埋的人和小鼠的皮肤组织的6μm切片用苏木精和曙红(H&E)染色。在一些实验中，切片用鉴定胶原的马松三色法(Masson trichrome)染色。在Nikon Eclipse 800显微镜上拍摄图像。使用软件在每个切片的六个随机视野中测量真皮的厚度。
统计分析
所有连续变量表示为平均值+/-标准差。对于统计学显著性，视情况使用配对t-检验或曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)，测试两组之间的比较。三组之间的比较使用方差分析(ANOVA)，随后进行Bonferroni检验。
实施例1A
用本文所用的化合物处理从健康对照、具有SSc或局部硬皮病(硬斑病)的患者的皮肤获得的原代成纤维细胞。
实施例1B
肌成纤维细胞(表达α-SMA的活化的成纤维细胞)，通过TGF-β刺激诱导，并在纤维化中起作用。随后，检查本文所用的化合物对正常皮肤成纤维细胞中的α-SMA表达的作用。
实施例1C
培养的人皮肤外植体可以用作器官模型，以评估纤维生成因子的作用并评价抑制剂/疗法停止纤维化的进展以及可能逆转纤维化的功效。为了评价本文所用的化合物作为纤维化的潜在治疗剂的功效，使用了离体人皮肤模型。由于TGF-β可以作为在纤维化中发挥核心作用的前纤维化(pro-fibrotic)因子，因此首先皮内注射人重组TGF-β以评价纤维化水平。在注射后一周，TGF-β注射可以以剂量依赖性方式增加真皮厚度。TGF-β(10ng/ml)的纤维化作用两周消退。单独检查了本文所用的化合物的基线效应。
实施例1D
在体内进一步评价本文所用的化合物的抗纤维化作用。将本文所用的化合物与TGF-β组合注射到小鼠皮肤中，并随时间测量小鼠皮肤中的真皮厚度。
实施例1E
在纤维化的临床前模型中证实了本文所用的化合物的功效：a)在体内，小鼠皮肤中博莱霉素诱导的真皮纤维化和b)小鼠皮肤中TGF-β诱导的真皮纤维化。本文所用的化合物或对照化合物与TGF-β或博莱霉素同时施用或在施用TGF-β或博来霉素后3天至4天施用。在TGF-β-引发的真皮纤维化后一周和两周处死小鼠，以及在博莱霉素诱导的纤维化后两周至三周处死小鼠。腹膜内施用本文所用的化合物。对于这些研究，通过测量H&E皮肤切片上的真皮厚度、通过马松三色法染色评估胶原水平来评估纤维化。
实施例2
Tsk小鼠硬皮病模型
在5周龄、10周龄和20周龄(n＝6)时，对Tsk小鼠的皮肤测量皮下纤维层的胶原含量和厚度(Rheum.Dis.North Am.16,153,1990)，并与对照小鼠(pallid小鼠)比较。通过使用HPLC测量羟脯氨酸(胶原的标记物)来测定胶原含量。通过用Azan染色的组织学分析，然后使用图像分析系统测量纤维层的面积来测定纤维层的厚度。
本文所用的化合物对抗Tsk小鼠硬皮病模型的效果
13周龄的Tsk小鼠(n＝5)腹膜内施用本文所用的化合物，例如以10mg/kg至100mg/kg的剂量每日一次(诸如10mg/kg每日一次，30mg/kg每日一次，或100mg/kg每日一次)，持续2周。最后施用后五小时，测量皮下纤维层的肥厚程度，并与施用盐水组的值比较。
实施例3
测量纤维化组织中的羟脯氨酸水平
为了定量肺羟脯氨酸含量，将组织样品(例如但不限于，15mg至25mg)通过碱-酸水解法如下处理。在121℃，将组织样品用400μL的6N HCl酸水解20分钟，并用含有10mg/mL活性炭的400μL的4N NaOH中和。将AC缓冲液(2.2M乙酸/0.48M柠檬酸，400μL)添加至样品，然后离心以收集上清液。用从16μg/mL开始的反式-4-羟基-L-脯氨酸(Sigma-Aldrich，美国)的连续稀释液建立羟脯氨酸的标准曲线。将制备的样品和标准品(各为400μL)与400μL氯胺T溶液(Wako Pure Chemical Industries，日本)混合，并在室温孵育25分钟。然后将所述样品与欧立希氏溶液(Ehrlich’s solution)(400μL)混合并在65℃加热20分钟以显示颜色。在冰上冷却样品并离心以去除沉淀后，在560nm测量每个上清液的光学密度。根据羟脯氨酸标准曲线计算羟脯氨酸浓度。
虽然已阐明且描述了某些实施方式，但应当理解，根据本领域的普通技能可以在其中进行改变和修改，而不脱离如下面的权利要求所限定的在其更广泛的方面中的技术。
在没有未被本文明确公开的任何一个元素或多个元素、一个限制或多个限制的情况下，本文用作说明而描述的实施方式可适当地被实行。因此，例如，术语“包含(comprising)”、“包括(including)”、“含有(containing)”等应开放性地理解，而不受限制。此外，本文所用的术语和表述已被用作描述而非限制的措辞，且没有意图使用排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物的这类术语和表述，但应认识到，在所要求保护的技术的范围内可以进行各种修改。
本申请不受限于本申请中所描述的特定实施方式。正如对于本领域的技术人员显而易见的，可以进行许多修改和变动，而不脱离其宗旨和范围。对于本领域的技术人员来说，除了本文所列举的那些方法和组合物之外，在本申请的范围内的功能上等同的方法和组合物从前面的描述中将是显而易见的。这种修改和变动意图落在所附的权利要求的范围内。本申请仅受限于所附的权利要求项，连同这些权利要求有权要求的等同物的全部范围。应当理解，本申请不受限于无疑可以变化的特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统。也应当理解，本文所用的用辞仅是出于描述特定实施方式的目的，而非用于限制。
此外，根据马库什群组描述本申请的特征或方面，本领域的技术人员将认识到，本申请也因此根据马库什群组的任何个体成员或成员的子群组而被描述。
如将被本领域的技术人员所理解，出于任何和全部目的，尤其在提供文字说明书方面，本文所公开的所有范围也包含任何和所有的可能的子范围及其子范围的组合。任何所列出的范围可以容易地被认为充分地描述相同的范围和使相同的范围能够分解成至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作为非限制性实施例，本文所讨论的每个范围可容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如将被本领域的技术人员所理解，所有诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有措辞包括所引用的数字且指的是可随后被分解成如上所讨论的子范围的范围。最后，如将被本领域的技术人员所理解，范围包括各个单独的成员。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请、授权专利和其他文献通过引用并入本文，犹如各个单独的出版物、专利申请、授权专利或其他文献被明确地且单独地表明通过引用以其全文并入。被包含在通过引用并入的文字中的定义在它们与本申请中的定义矛盾的意义上被排除在外。
在权利要求中陈述了其他实施方式。