肠降血糖素-胰岛素缀合物的制作方法

文档序号:14915472发布日期:2018-07-11 00:35
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2014年9月24日提交的美国临时申请序列号62/054,666的优先权,所述申请的完整内容在此通过引用并入本文。通过引用电子形式提交的材料的并入通过引用整体并入计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表,所述序列表与本文一并提交并如下标识:于2015年9月18日创建的名称为“242705_SeqList_ST25.txt”的一个1014KBACII(文本)文件。背景胰岛素是一种用于治疗青少年-发病型糖尿病和晚期成人-发病型糖尿病的经证实的疗法。所述肽被生物合成为低效力的较大线性前体(天然胰岛素的约2%-9%),称为胰岛素原。胰岛素原通过选择性除去35-残基连接肽(C肽)而蛋白水解转化为胰岛素。所得的通过胰岛素"A链"(SEQIDNO:1)和"B链"(SEQIDNO:2)链之间的二硫键形成的异源双链体,代表总共51个氨基酸,对于胰岛素受体具有高效力(nM范围)。相对于相关的胰岛素-样生长因子1受体,天然胰岛素对于胰岛素受体具有约100倍的选择性亲和力,但对于两种不同的胰岛素受体同种型(称为A和B)显示出很少的选择性。肠降血糖素是一组胃肠激素,其参与广泛种类的生理学功能,包括葡萄糖稳态、胰岛素分泌、胃排空和肠道生长,以及食物摄入量的调节。前高血糖素原是一种158个氨基酸的前体多肽,其在不同的组织中被加工以形成许多不同的肽。肠降血糖素包括许多高血糖素原-衍生的肽,包括胰高血糖素(SEQIDNO:701)、胰高血糖素-样肽-1(GLP-1;氨基酸7-36被提供为SEQIDNO:703且氨基酸7-35被提供为SEQIDNO:704)、胰高血糖素-样肽-2(GLP-2;SEQIDNO:708)和泌酸调节肽(OXM;SEQIDNO:706)。胰高血糖素是一种29个氨基酸的肽,其对应于前高血糖素原的氨基酸33-61,同时GLP-1被生产为一种37个氨基酸的肽,其对应于前高血糖素原的氨基酸72-108。GLP-1(7-36)酰胺(SEQIDNO:703;C末端是精氨酸酰胺)或GLP-1(7-37)酸(SEQIDNO:704;C末端是甘氨酸)是GLP-1的生物学有效形式,其对GLP-1受体显示基本上等效的活性。胰高血糖素是挽救生命的药物,其用于严重低血糖症的急性治疗。已报道泌酸调节肽具有抑制食欲和降低体重的药理学能力。用GLP-1受体激动剂或稳定的GLP-1类似物的临床研究已证明这一家族的肽是II型糖尿病的有效治疗。此外,抑胃肽(GIP)也被称为葡萄糖-依赖性促胰岛素肽,并且是激素的分泌素家族的一个成员。GIP衍生自由GIP基因编码的153-氨基酸的前蛋白并作为生物活性的42-氨基酸肽(SEQIDNO:707)循环。GIP基因在小肠以及唾液腺中表达并且是胃酸分泌的弱抑制剂。除了其在胃中的抑制效果,在葡萄糖的存在下,GIP当以生理学剂量施用时,促进由胰腺β胰岛细胞的胰岛素释放。GIP被认为作为肠因子发挥作用,其刺激胰腺胰岛素的释放并可在维持葡萄糖稳态中发挥生理作用。如本文公开,缀合物在胰岛素肽和肠降血糖素之间形成,包括例如胰高血糖素、GLP-1或GIP激动剂、GLP-1/GIP共激动剂、GLP-1/胰高血糖素共激动剂或胰高血糖素/GLP-1/GIP三重激动剂,其中缀合物对胰岛素受体和对应的肠降血糖素受体两者具有激动活性。更具体地,预期胰高血糖素相关肽(例如,GIP、GLP-1或胰高血糖素)的缀合产生胰岛素肽活性的有益的修饰。例如,预期将对胰高血糖素受体具有激动活性的肽连接至胰岛素肽增强缀合物靶向至肝脏,因为胰高血糖素受体主要位于肝脏中。缀合物靶向至肝脏是合乎需要的,因为肝脏主要参与葡萄糖生产而不是利用。因此靶向肝脏可以是比当胰岛素接触其它组织诸如肌肉或脂肪时发生的更安全的关闭葡萄糖生产的途径,其中除了关闭葡萄糖生产外,其还刺激导致低血糖症的更高风险的葡萄糖利用。还有存在于胰腺的α细胞上的胰高血糖素受体。复合物递送至α细胞可抑制额外的胰高血糖素生产或使α细胞对低血糖症更敏感。申请人还期望胰高血糖素存在于胰高血糖素-胰岛素缀合物中可用作对偶联的胰岛素活性的缓冲剂,以提供更为基准的活性,因此避免血葡萄糖水平的峰值。类似地,期望胰岛素肽与其它胰高血糖素相关肽(包括肠降血糖素GLP-1和GIP)和对GLP-1和/或GIP受体具有活性的其它相关肽的缀合物将产生具有有益特性的缀合物。例如,GLP-胰岛素缀合物可靶向至下丘脑,以降低食欲以及减少血葡萄糖。可替代地或者另外地,GLP-胰岛素缀合物可以靶向至β细胞以驱动合成代谢反应(增加胰岛素的胰岛β细胞生产)。肠降血糖素-胰岛素肽缀合物也适合于进一步的结构增强,设想这样的结构增强通过使用前药化学以产生改善的治疗指数;通过血浆蛋白诸如白蛋白的连接或其它修饰,包括聚乙二醇化和脂质化(例如,添加C14-C30烷基或酰基)延长作用的持续时间;和通过糖基化增强物理稳定性。使用C-肽接头的单链胰岛素类似物的制剂也提供新颖的结构位置,对于这样的结构位置,这些化学修饰中的许多可以成功地布置。本文公开的胰岛素缀合物的一种用途是治疗糖尿病,同时刺激重量减轻或防止重量增加。概述提供胰岛素激动剂/肠降血糖素缀合物,其中缀合物在胰岛素受体和对应的肠降血糖素受体两者上具有激动活性。更具体地,在一个实施方案中,提供胰岛素激动剂/肠降血糖素缀合物,其中所述缀合物在胰岛素受体和GLP-1和/或GIP受体两者上具有激动剂活性。根据一个实施方案,单一化合物作为胰岛素蛋白和肠降血糖素蛋白的缀合物提供,其中所述缀合物充当诱导重量减轻或预防重量增加的完全效力胰岛素激动剂。缀合物的胰岛素肽组分可以是天然胰岛素或任何已知的在胰岛素受体具有活性的胰岛素类似物,包括例如在公开的国际申请WO96/34882、WO2010/080607、WO2010/080609、WO2011/159882、WO/2011/159895和美国专利号6,630,348(其公开内容通过引用并入本文)中公开的任何胰岛素肽。缀合物的肠降血糖素组分可以是如本文公开的任何肠降血糖素肽,包括例如天然胰高血糖素、GLP-1、GIP或任何已知的肠降血糖素或肠降血糖素肽,其在一个或多个肠降血糖素受体上具有活性。适合于根据本发明的用途的肠降血糖素肽包括,例如,在公开的国际申请WO2009/155258、WO2009/058734、WO2011/094337、WO2009/148089、WO2011/163473和WO2010/071807(其公开内容全文明确地并入本文)中公开的任何肠降血糖素肽。根据一个实施方案,肠降血糖素肽通过式I的通用结构的连接部分连接至胰岛素肽:其中R1、R2、R3和R4独立地选自H和C1-C3烷基;Y为C、S、Se或S=O,Z为C、S、Se、-S(C1-C3)(C5-C6芳基)-或Z与Y组合为-C=C-、-O-N=或1,2,3三唑;n为0或1;且m为1、2或3,条件是当Y为S=O时,Z为C。在一个实施方案中,所述连接部分是以下通式的二硫化物接头:其中R1、R2、R3和R4独立地选自H和C1-C3烷基,n为0或1,且m为1、2或3。在一个实施方案中,n为0,m为2,R4为H且R1、R2和R3独立地选自H和甲基。根据一个实施方案,提供通过肠降血糖素肽通过式I或II的连接部分连接至胰岛素肽而形成的缀合物,其当在正常和糖尿病模型小鼠中注射时表明高效力、在缀合物的相应受体的平衡活性、降低葡萄糖能力和增强的脂肪量损失。在一个实施方案中,肠降血糖素肽的C端区通过式I或II的连接部分,通过独立地选自以下的位置共价连接至胰岛素肽:选自A链的A9、A14或A15的位置、B链的位置B1、B2、B3、B10、B22、B28或B29的氨基酸的侧链、B链的N端α胺、A或B链的羧基端和在连接单链胰岛素类似物的A链与B链的连接部分的任何位置的氨基酸的侧链。根据一个实施方案,肠降血糖素肽的羧基端通过式II的二硫化物连接部分连接至胰岛素肽的N端,任选地其中肠降血糖素肽的羧基端通过式II的二硫化物连接部分连接至双链胰岛素肽的B链的N端。如本文所用,对肠降血糖素肽的C端区的提及意在涵盖胰高血糖素、GLP-1或GIP肽的天然C端或添加至胰高血糖素、GLP-1或GIP类似物的天然C端的任何氨基酸或相对于天然胰高血糖素序列分别已通过C端氨基酸处缺失而缩短的胰高血糖素类似物的C端氨基酸。例如,天然肠降血糖素肽的C端可延伸1至3个氨基酸,其然后通过C端区的氨基酸的侧链或通过C端羧基连接至胰岛素肽。在一个实施方案中,肠降血糖素肽的羧基端区共价连接至胰岛素肽的B链的氨基端区。在一个实施方案中,所述缀合物的胰岛素肽是包含彼此通过二硫键连接的A链和B链的双链胰岛素类似物。在另一个实施方案中,所述缀合物包含双链胰岛素类似物,其中肠降血糖素肽共价连接至胰岛素肽的选自B链的氨基端、A链的羧基端区和B链的羧基端区的位置。在一个实施方案中,所述肠降血糖素肽通过以下通用结构的二硫化物结合部分连接至胰岛素肽:其中R1、R2和R4独立地选自H和CH3;且n为0或1。在一个实施方案中,所述肠降血糖素肽选自天然胰高血糖素、天然GLP-1和天然GIP。在一个实施方案中,所述肠降血糖素肽是对选自胰高血糖素受体、GLP-1受体或GIP受体的两种或更多种肠降血糖素受体具有活性的胰高血糖素类似物。在一个实施方案中,所述缀合物的肠降血糖素肽组分包含(i)氨基酸序列:X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQIDNO:839),对其进行1至3个氨基酸修饰,其中X1和/或X2是非-天然(相对于SEQIDNO:701)氨基酸,其降低肠降血糖素肽对二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性,Z选自-COOH、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH、GPSSGAPPPS(SEQIDNO:78)和Y-COOH,其中Y为1至2个氨基酸,且此外其中(1)内酰胺桥连接位置i的氨基酸和位置i+4的氨基酸的侧链,其中i是12、16、20或24或(2)用α,α-二取代氨基酸置换所述肠降血糖素肽的位置16、20、21和24中的1、2、3个或所有氨基酸;且所述肠降血糖素肽具有胰高血糖素激动剂活性;(ii)SEQIDNO:701的氨基酸序列,其被修饰以包含至少一个选自以下的氨基酸修饰:用带电氨基酸置换位置28的Asn;用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、磺基丙氨酸和高磺基丙氨酸的带电氨基酸置换位置28的Asn;在位置28用Asn、Asp或Glu置换;在位置28用Asp置换;在位置28用Glu置换;用带电氨基酸置换位置29的Thr;用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、磺基丙氨酸和高磺基丙氨酸的带电氨基酸置换位置29的Thr;在位置29用Asp、Glu或Lys置换;在位置29用Glu置换;在位置29之后插入1-3个带电氨基酸;在位置29之后插入Glu或Lys;在位置29之后插入Gly-Lys或Lys-Lys;或其组合,和至少一个选自组A或组B或其组合的氨基酸修饰;其中组A是选自以下的氨基酸修饰:用Glu置换在位置15的Asp,和用Thr或AIB置换在位置16的Ser;且其中组B是选自以下的氨基酸修饰:用非-天然氨基酸置换位置1的His,其降低肠降血糖素肽对二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性,用非-天然氨基酸置换位置2的Ser,其降低肠降血糖素肽对二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性,用Phe或Val置换在位置10的Tyr;用Arg置换在位置12的Lys;用Ala或AIB置换在位置20的Gln;用Glu置换在位置21的Asp;用Ala或AIB置换在位置24的Gln;用Leu或Nle置换在位置27的Met;缺失在位置27-29的氨基酸;缺