PSMA相关的疗法的制作方法

本申请要求在2014年10月10日提交的美国临时申请62/062,710和62/062,714的优先权，其全部内容在此参考并入。

发明背景

前列腺癌是男性中最常诊断的癌症之一，并且是继肺癌之后癌症相关死亡的最常见原因。发生前列腺癌的风险随年龄的增长而急剧增加，特别是对于超过50岁的男性。伴随着过去三十年间显著的人口老龄化和对寿命预期的增加，在美国前列腺癌的发病率接近每六名男性中就有一人患病。

前列腺癌的早期诊断和成功治疗仍然是主要的临床难题。除了准确检测前列腺损伤的新技术，理解前列腺癌的发生、转移和耐药性过程中重要的分子级联对于开发新的治疗剂和干预策略至关重要。前列腺癌的分子标志是在几乎每个前列腺肿瘤的质膜上的异常表达的跨膜糖蛋白前列腺特异性膜抗原(psma)。psma在前列腺癌上的表达谱以及其酶活性表明其可能在前列腺癌中起重要作用，并且适用于药理干预。调节psma水平和psma酶活性的能力可用于治疗由psma介导的癌症和其他疾病和状况。

发明概述

本发明包括这样的认识：psma可以通过其在复杂的信号级联中的作用影响癌症发展、血管生成和新生血管形成。本发明尤其提供了通过调节psma的活性来治疗癌症的方法，包括但不限于癌症的发病、进展、转移和血管形成。本发明还包括认识到psma的活性可以调节胞质钙水平。这种调节可导致改变肿瘤的代谢、氧合、血管形成和转移。因此，根据本发明的一个方面，psma可以用作治疗的新组分。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的化学治疗剂，所述患者由于已经接受了psma抑制剂因此对所述化学治疗剂敏感。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向患有或者易患有难治性癌症的受试者施用治疗有效量的psma抑制剂。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防癌症的方法，所述方法包括以下步骤：i)识别以高水平psma为特征的患有或易患有癌症的患者；以及ii)施用治疗有效量的psma抑制剂。

在一些实施方案中，本发明提供了用于在患者中降低对化学治疗剂的抗性的方法，所述方法包括在施用所述化学治疗剂的同时或之前施用治疗有效量的psma抑制剂。在一些实施方案中，本发明提供了使肿瘤细胞对化学治疗剂敏感的方法，所述方法包括用psma抑制剂处理所述肿瘤细胞。

在一些实施方案中，本发明提供了抑制癌细胞迁移的方法，所述方法包括向患有或者易患有癌症的患者施用治疗有效量的psma抑制剂。

在一些实施方案中，本发明提供了抑制新生血管形成的方法，所述方法包括向患有或者易患有癌症的患者施用治疗有效量的psma抑制剂。在一些实施方案中，所述新生血管形成是肿瘤新生血管形成。

在一些实施方案中，本发明提供了一种在患有或易患有癌症的患者中治疗所述癌症的方法，所述方法包括以下步骤：i)确定存在于患者肿瘤上的psma的量；和ii)向所述患者施用合适的化学治疗剂；其中高水平的psma指示所述患者应该用升高水平的化疗进行治疗。

在一些实施方案中，本发明提供了一种在患有或易患有癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用升高剂量的化学治疗剂的步骤，所述患者：a)正在接受化学治疗剂的治疗；和b)显示出高水平的psma。

定义

本文所用的术语“施用”是指将组合物施用给受试者。可以以任意适当的途径进行施用。例如，在一些实施方案中，施用可以是支气管(包括通过支气管滴注)施用、口腔施用、肠内施用、腹膜内施用、动脉内施用、皮内施用、胃内施用、髓内施用、肌内施用、鼻内施用、腹膜内施用、鞘内施用、静脉内施用、心脑室内施用、粘膜施用、经鼻施用、口服施用、直肠施用、皮下施用、舌下施用、局部施用、气管(包括通过气管内滴注)施用、透皮施用、阴道施用和玻璃体施用。

本文所用的术语“血管生成”是指从先前存在的血管上促生或发展出新的毛细血管，导致通常与特定器官或组织或者与肿瘤相关的血管形成的增加。

本文所用的术语“癌症”和“癌性的”是指或描述受试者的生理学、组织学或遗传学状况，其特征表现为不受调节的细胞生长或分裂。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在一些实施方案中，癌症是肉瘤、黑色素瘤、母细胞瘤、或癌。在一些实施方案中，癌症是鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、骨癌、腹膜癌、食道癌、眼癌、皮肤癌、胃(gastric)癌或胃(stomach)癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胆囊癌、肝癌、喉癌、口腔癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾(kidney)癌或肾(renal)癌、神经内分泌癌、前列腺癌、阴道癌、外阴癌、睾丸癌、甲状腺癌、尿道癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、以及头颈癌。

本文所用的术语“化学治疗剂”是指具有抑制细胞和/或杀细胞功能的试剂，并且其可用于治疗或预防癌症和/或新生血管形成。在一些实施方案中，这些化学治疗剂包括，但不限于，抗增殖性抗体，拓扑异构酶i抑制剂；拓扑异构酶ii抑制剂；微管活性化合物；诱导细胞分化过程的化合物；靶向/降低蛋白或脂质激酶活性的化合物和进一步抗血管生成的化合物；靶向、降低或抑制蛋白或脂质磷酸酶活性的化合物；抗雄激素；蛋白酶体抑制剂；mek抑制剂(例如来自arraybiopharma的arry142886，来自astrazeneca的azd6244，来自辉瑞的pd181461，以及甲酰四氢叶酸)。在一些实施方案中，化学治疗剂选自dna嵌入剂(多柔比星及其衍生物)、有丝分裂抑制剂(紫杉醇及其衍生物)、erk/mek抑制剂(例如，azd6244等)、pi3k/mtor双重抑制剂(例如，bez235等)、pi3k抑制剂(例如，bkm120、gdc-0941、cal-101、pi-103、xl147、zstk474、byl719、gsk458、pf-04691502、azd6482、apitolisib、gsk2636771、copanlisib)、mtor抑制剂(例如，依维莫司，azd8055)、egfr/erbb2抑制剂(例如，拉帕替尼等)，20s蛋白酶体抑制剂/ros上调剂(例如，万珂(velcade))、ar拮抗剂(例如，比卡鲁胺、galeterone、氟他胺、醋酸环丙孕酮、螺内酯)、或者ar抑制剂(例如恩扎洛胺、抗雄激素、arn-509、s7040、阿比特龙)。

本文所用的术语“抗增殖性抗体”包括，但不限于，曲妥珠单抗(herceptin^tm)、曲妥珠单抗-dm1、西妥昔单抗贝伐珠单抗(avastin^tm)、利妥昔单抗pro64553(抗cd40)、易普利姆玛(mdx-101、)、帕尼单抗和2c4抗体。抗体是指完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少2个完整的抗体形成的多特异性抗体、以及抗体片段，只要其显示出所需的生物学活性即可。这种抗增殖性抗体包括抗体-药物偶联物，并且可以包含放射性颗粒或其他化学治疗剂，例如ado-曲妥珠单抗emtansine

本文所用的术语“抗雄激素”涉及能够抑制雄性激素的生物学效应的任何物质，包括，但不限于，比卡鲁胺(casodex^tm)。

本文使用的术语“拓扑异构酶i抑制剂”包括，但不限于托泊替康，吉马替康，伊立替康，喜树碱及其类似物，9-硝基喜树碱，以及大分子喜树碱缀合物pnu-166148。伊立替康可以，例如以其销售的形式(例如在camptosar^tm商标形式下)进行施用。托泊替康以商品名hycamptin^tm进行销售。

本文所用的术语“拓扑异构酶ii抑制剂”包括，但不限于蒽环类(例如多柔比星(包括脂质体制剂，例如caelyx^tm)、多柔比星衍生物、柔红霉素、表柔比星、伊达比星和尼莫啶星)，蒽醌类(米托蒽醌和依索沙酮)，以及鬼臼毒素依托泊苷和替尼泊苷。依托泊苷以商品名etopophos^tm进行销售。替尼泊苷以商品名vm26-bristol进行销售。多柔比星以商品名acriblastin^tm或adriamycin^tm进行销售。表柔比星以商品名farmorubicin^tm进行销售。伊达比星以商品名zavedos^tm进行销售。米托蒽醌以商品名novantrontm进行销售。

术语“微管活性剂”涉及微管稳定化合物，微管去稳定化合物和微管聚合抑制剂，包括，但不限于紫杉烷类(如紫杉醇和多西紫杉醇)；长春生物碱类，例如长春碱或硫酸长春碱，长春新碱或硫酸长春新碱，长春氟宁，以及长春瑞滨；圆皮海绵内酯；秋水仙碱，以及埃坡霉素及其衍生物。紫杉醇以商品名taxol^tm和进行销售。多西紫杉醇以商品名taxotere^tm销售。硫酸长春碱以商品名vinblastinr.p^tm进行销售。硫酸长春新碱以商品名farmistin^tm进行销售。

本文所用的术语“靶向/降低蛋白或脂质激酶活性的化合物”，或者“靶向、降低或抑制蛋白或脂质磷酸酶活性的化合物”、或者“进一步抗血管生成的化合物”包括，但不限于，蛋白酪氨酸激酶和/或丝氨酸和/或苏氨酸激酶的抑制剂或者脂质激酶抑制剂，例如a)靶向、降低或抑制血小板衍生生长因子受体(pdgfr)的活性的化合物，例如靶向、降低或抑制pdgfr活性的化合物，特别是抑制pdgf受体的化合物，例如n-苯基-2-嘧啶-胺衍生物(例如伊马替尼、su101、su6668和gfb-111)；b)靶向、降低或抑制成纤维细胞生长因子受体(fgfr)活性的化合物；c)靶向、降低或抑制胰岛素样生长因子受体i(igf-1r)的活性的化合物，例如靶向、降低或抑制igf-1r活性的化合物，特别是抑制igf-1受体的激酶活性的化合物，或者靶向igf-1受体的细胞外结构域或其生长因子的抗体；d)靶向、降低或抑制trk受体酪氨酸激酶家族的活性的化合物，或者ephrinb4抑制剂；e)靶向、降低或抑制axi受体酪氨酸激酶家族活性的化合物；f)靶向、降低或抑制ret受体酪氨酸激酶活性的化合物；g)靶向、降低或抑制kit/scfr受体酪氨酸激酶的活性的化合物，例如伊马替尼；h)靶向、降低或抑制c-kit受体酪氨酸激酶(其是pdgfr家族的一部分)的活性的化合物，例如靶向、降低或抑制c-kit受体酪氨酸激酶家族的活性的化合物，特别是抑制c-kit受体的化合物，例如伊马替尼；i)靶向、降低或抑制c-abl家族成员、其基因融合产物(例如bcr-abl激酶)和突变体的活性的化合物，例如靶向、降低或抑制c-abl家族成员及其基因融合产物的活性的化合物，例如n-苯基-2-嘧啶-胺衍生物(如伊马替尼或尼洛替尼(amn107))；pd180970；ag957；nsc680410；parkedavis的pd173955；或者达沙替尼(bms-354825)；j)靶向、降低或抑制以下成员的活性的化合物：丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白激酶c(pkc)和raf家族成员，mek，src，jak，fak，pdk1，pkb/akt和ras/mapk家族成员，和/或细胞周期蛋白依赖性激酶家族(cdk)的成员(包括星形孢菌素衍生物，例如米哚妥林)；其他化合物的实例包括ucn-01，沙芬戈，bay43-9006，苔藓抑菌素1，哌立福辛；莫福辛；ro318220和ro320432；go6976；lsis3521；ly333531/ly379196；异喹啉化合物；fti；pd184352或qan697(p13k抑制剂)或at7519(cdk抑制剂)；k)靶向、降低或抑制蛋白质-酪氨酸激酶抑制剂的活性的化合物，例如靶向、降低或抑制蛋白质-酪氨酸激酶抑制剂的活性的化合物(包括甲磺酸伊马替尼(gleevec^tm))或酪氨酸磷酸化抑制剂(例如酪氨酸磷酸化抑制剂a23/rg-50810)；ag99；酪氨酸磷酸化抑制剂ag213；酪氨酸磷酸化抑制剂ag1748；酪氨酸磷酸化抑制剂ag490；酪氨酸磷酸化抑制剂b44；酪氨酸磷酸化抑制剂b44(+)对映体；酪氨酸磷酸化抑制剂ag555；ag494；酪氨酸磷酸化抑制剂ag556，ag957和adapthostin(4-{[(2,5-二羟基苯基)甲基]氨基}-苯甲酸金刚烷基酯；nsc680410，adaphostin)；l)靶向、降低或抑制受体酪氨酸激酶表皮生长因子家族(同源二聚体或异源二聚体的egfr1erbb2,erbb3,erbb4)及其突变体的活性的化合物，例如靶向、降低或抑制表皮生长因子受体家族的活性的化合物尤其是抑制egf受体酪氨酸激酶家族成员(例如egf受体，erbb2，erbb3和erbb4)的或者结合egf或egf相关配体(cp358774,zd1839,zm105180)的化合物、蛋白质或抗体；曲妥珠单抗(赫赛汀^tm)，西妥昔单抗(爱必妥^tm)，易瑞沙，特罗凯，osi-774，cl-1033，ekb-569，gw-2016，e1.1，e2.4，e2.5，e6.2，e6.4，e2.11，e6.3或e7.6.3，以及7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物；和m)靶向、降低或抑制c-met受体的活性的化合物，例如靶向、降低或抑制c-met的活性的化合物，特别是抑制c-met受体的激酶活性的化合物，或者靶向c-met的细胞外结构域或者与hgf结合的抗体。

术语“mtor抑制剂”涉及这样的化合物：其抑制雷帕霉素(mtor)的哺乳动物靶标并且具有抗增殖的活性，例如西罗莫司、依维莫司(certican^tm)、cci-779、azd8055、bez235、替西罗莫司、ku-0063794、pp242、42-(二甲基亚膦酰)雷帕霉素(ridaforolimus)、ink127、xl765、托林1、托林2、osi-027、wye-354、azd2014、palomid529、way-600和abt578。

本文所用的术语“蛋白酶体抑制剂”是指靶向、降低或抑制蛋白酶体活性的化合物。靶向、降低或抑制蛋白酶体活性的化合物包括，但不限于，硼替佐米(velcade^tm)和mln341。

本文所用的术语“体外的”是指发生在人造环境(例如，在试管或反应容器中，在细胞培养物中等)中的，而不是在生物体内(例如，动物、植物和/或微生物)的事件。

本文所用的术语“体内的”是指发生在生物体(例如，动物、植物和/或微生物)内的事件。

本文所用的术语“转移”是指肿瘤细胞进入循环系统并在其中存活，外渗，并且最后在次级器官或组织中建立远端肿瘤。

本文所用的术语“新生血管形成”是指新血管在通常不含有其的组织中形成，特别是在因疾病或创伤而循环受损的组织中形成。这种疾病或创伤的非限制性实例包括肿瘤、糖尿病性视网膜病变、关节炎和牛皮癣。

本文所用的术语“患者”、“受试者”或“测试受试者”是指例如，以用于实验，诊断，预防和/或治疗的目的，向之单独施用psma抑制剂或者组合施用psma抑制剂和本发明所述化学治疗剂的任意生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人；昆虫；蠕虫等)。在一些实施方案中，受试者可能患有和/或易患有疾病、障碍和/或状况(例如癌症、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变)。

“患有”疾病、障碍和/或状况的个体已被诊断患有和/或显示出或者已经显示出了所述疾病、障碍和/或状况的一种或多种症状或特征。

“易患有”疾病，障碍和/或状况的个体具有发展出所述疾病、障碍和/或状况的风险。在一些实施方案中，易患有疾病、障碍和/或症状的个体不显示所述疾病、障碍和/或状况的任何症状。在一些实施方案中，易患有疾病、障碍和/或症状的个体是尚未被诊断患有所述疾病、障碍和/或状况的个体。在一些实施方案中，易患有疾病、障碍和/或状况的个体是已经暴露于与所述疾病、障碍和/或状况的发展相关的环境的个体。在一些实施方案中，发生疾病、障碍和/或状况的风险是基于人群的风险(例如，患有变态反应的个体的家族成员等)。

本文所用的术语“治疗有效量”是指当作为治疗方案的一部分施用时，能引发所需的生物应答的物质(例如，治疗剂、组合物和/或制剂)的量。在一些实施方案中，当施用给患有或易患有疾病、障碍和/或状况的受试者时，物质的治疗有效的量是足够治疗、诊断、预防和/或延迟所述疾病、障碍和/或状况的发作的量。如本领域普通技术人员将理解的，物质的有效量可以根据诸如以下因素而变化：所需的生物学终点，待递送的物质，靶细胞或靶组织等。例如，用于治疗疾病、障碍和/或状况的制剂中化合物的有效量是缓解、改善、减轻、抑制、预防所述疾病、障碍和/或状况、延缓所述疾病、障碍和/或状况的发作，降低所述疾病、障碍和/或症状的严重程度、和/或降低所述疾病、障碍和/或状况的一种或多种症状或特征的发生率的量。在一些实施方案中，以单一剂量施用治疗有效量；在一些实施方案中，需要多个单位剂量来递送治疗有效量。

本文所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或者“治疗(treating)”是指用来部分地或者完全地缓解、改善、减轻、抑制、预防疾病、障碍和/或状况、延缓疾病、障碍和/或状况的发作，降低疾病、障碍和/或状况的严重程度、和/或降低疾病、障碍和/或状况的一种或多种症状或特征的发生率的任意方法。治疗可以施用给不显示疾病、障碍和/或状况的迹象的受试者。在一些实施方案中，例如用于降低与疾病、障碍和/或状况相关的病理的发展风险的目的，可以将治疗施用给只显示所述疾病、障碍和/或状况的早期体征的受试者。

本文所用的术语“肿瘤”是指由于过度的和异常的细胞分裂而导致的组织或细胞集的异常团块。其可以是良性的(非癌性的)或者恶性的(癌性的)。

附图简述

图1显示了psma在调节前列腺癌细胞中钙稳态中的作用。

图2显示了psma和mglur1/5在前列腺癌细胞质膜上的共定位。

图3显示了psma的酶活性可以上调几种钙依赖的信号传导效应物的磷酸化。

图4显示了psma在调节参与致癌作用的许多细胞组分的磷酸化中的重要性。

图5显示了psma促进前列腺癌发展的示例性机制。

图6显示了psma的活性对血管生成和肿瘤氧合的效应。

图7显示了通过抑制psma的活性来提升几种化学治疗剂的细胞毒性。

图8显示了psma参与形成对化学治疗剂的抗性，所述化学治疗剂能提升活性氧簇的细胞内水平。

图9显示通过抑制psma减少了肿瘤的生长和提升了动物的存活。图9a显示了经赋形剂(黑线)或2-pmpa(浅灰色)处理的无肿瘤动物的百分比。图9b显示了经赋形剂(黑色)处理的、具有降低的psma表达(lncap-kd，浅黑色)的、或者经高剂量(浅灰色)和低剂量(灰色)2-pmpa处理的动物的总生存期。

图10显示了psma水平与对化学疗法的应答之间的相关性。

图11显示鉴定了表达被psma的表达和活性上调的基因。

图12显示了psma的表达水平与mtor通路活化的相关性。

图13显示了模型，所述模型证明了psma在调节影响肿瘤生长和发展的各种细胞过程中所起的作用。

实施方案详述

psma是跨膜的谷氨酸羧肽酶，其发现于前列腺癌和大多数实体瘤的新生血管中，但在健康的前列腺和正常的血管中不存在。psma的表达与疾病阶段和生化复发相关，并且可用作疾病状态的生物标志物。在一些实施方案中，本发明提供了通过分析psma的表达和/或抑制psma的酶活性来治疗或预防癌症或癌症发展的方法。

本发明包括以下认识：即psma的表达使得细胞对许多药物具有抗性，但是对psma的酶活性的抑制使细胞对这些化学治疗剂敏感。psma的表达还可以使肿瘤对组合疗法具有抗性，而psma在体内的抑制可导致较小的肿瘤体积和较慢的肿瘤生长。因此，本发明的一个方面提供了治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向患有或者易患有难治性癌症的受试者施用治疗有效量的psma抑制剂。在一些实施方案中，本发明提供了通过在施用化学治疗剂的同时或者在其之前施用治疗有效量的psma抑制剂，从而在患者中降低对所述化学治疗剂的抗性或者使肿瘤细胞对所述化学治疗剂敏感的方法。

本申请详细描述了psma在调节肿瘤的生长及其对化学治疗剂的易感性中所起的作用，以及如何将患者肿瘤上psma的表达水平用作诊断标准来评价对化学治疗剂的易感性和/或是否需要psma的抑制。因此，本发明的一些实施方案提供了治疗或预防癌症的方法，其中识别以高水平psma为特征的患有或易患有癌症的患者，并且施用治疗有效量的psma抑制剂。

新生血管形成是肿瘤尺寸能够增长的关键步骤。转移是癌症发展的重要标志。如以下实例所详述的，psma的活性与这两个功能都相关。因此，在某些实施方案中，本发明提供了通过向患有或易患有癌症的患者施用治疗有效量的psma抑制剂来抑制癌细胞迁移和/或新生血管形成的方法。

对psma的酶活性的抑制降低转移性效应物(如前列腺素和vegf)的水平，同时将细胞的主要能量源从氧化磷酸化转换为有氧糖酵解。此外，对psma的抑制上调了原型雄激素受体的靶点前列腺特异性抗原(psa)的水平。不希望受任何特定理论的约束，相信这可能至少部分地归因于psma激活pi3k-akt通路的能力，其负调节前列腺癌中的雄激素受体(ar)通路。通过其酶活性，psma激活涉及pi3k和akt的下游信号传导。结果是，ar通路的活性和产量得以降低(以psa水平的形式进行测量)。或者，一旦抑制了psma的酶活性，pi3k和akt对ar的抑制被降低，这提升了ar的信号传导(反映为较高的psa浓度)。

不希望受任何特定理论的限制，本申请表明，psma通过其酶活性和加工(多)谷氨酸化的底物(包括naag和叶酸)的能力，激活代谢型谷氨酸受体i组，其启动下游信号传导级联，提升了胞质钙的水平。释放的钙进一步激活各种信号传导效应物，改变代谢并引发肿瘤及其转移的环境。参见图13。

根据本发明，可以使用任意的psma的抑制剂。psma的抑制剂在本领域中是已知的，例如(rs)-2-pmpa、(r)-2-pmpa、(s)-2-pmpa、(rs)-gpi5232、(s)-gpi5232、(rs)-2-mmpa、(r)-2-mmpa、(s)-2-mmpa、pbda、(r,r)/(s,s)-pbda、(s,s)/(r,r)-pbda、meso-pbda、(s)-glu-c(o)-(s)-glu、(r)-glu-c(o)-(r)-glu、(r)-glu-c(o)-(s)-glu、[¹¹c]dcmc、[¹²⁵i]dcit、va-033、zj43、zj11、zj17、zj38(zhouj,nealejh,pompermg,kozikowskiap.natrevdrugdiscov.2005dec；4(12):1015-26.)；ctt54(kastenb.b.等,bioorgmedchemlett.2013jan15；23(2):565-8)；tg97anddbco-peg4-ah2-tg97(martins.e.等,bioconjugchem.2014sep15)；dbco-peg(4)-ctt-54,dbco-peg(4)-ctt-54.2(nedrow-byers等,prostate,2013)；β-naag(yourickd.l.等,brainres.2003nov21；991(1-2):56-64)；培美曲塞，甲氨蝶呤(fultonm.d.和berkmanc.e.,pacificnorthwestresearchsymposium,2011,获自chemistry.oregonstate.edu/organic/symposium/archive/2011/abstracts2011/abs_fulton.pdf)；拟可逆抑制剂肽模拟物(liut.等,biochemistry.2008dec2；47(48):12658-60)；和类固醇衍生的氨基磷酸抑制剂(wul.y.等,biochemistry.2008dec2；47(48):12658-60)。在一些实施方案中，psma的抑制剂是本段中引用的任意参考文献中所述的psma抑制剂，其各自的全部内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，psma的抑制剂是2-pmpa或其类似物。

在一些实施方案中，psma的抑制剂是alphabody(即，可被调节成对目标靶点具有高亲和力的多肽)。alphabody的生产和选择是本领域已知的，其实例在wo/2012093172中有描述，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，psma的抑制剂是darpin(即，设计的锚蛋白，其是具有特异性的高亲和性靶点结合的重复蛋白)。darpin是本领域已知的并且有例如binz等(natbiotechnol.2004may；22(5):575-82)以及stumpp和amstutz(curropindrugdiscovdevel.2007mar；10(2):153-9)对其有过描述，其各自的全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，psma的抑制剂可以用作竞争性抑制剂。在其他实施方案中，所述抑制剂可以是非竞争性抑制剂或变构抑制剂。在一些实施方案中，可以将psma的抑制剂或其部分与有用的可检测试剂(例如但不限于荧光基团或放射性同位素)缀合。

癌症的治疗

psma具有谷氨酸羧肽酶的酶活性。所述酶活性涉及从底物(例如叶酸和n-乙酰天冬氨酰谷氨酸(naag)的谷氨酰衍生物)水解切割和释放谷氨酸。通过psma的酶活性释放的谷氨酸可以激活代谢型谷氨酸受体(mglur)，其中一些已被发现与psma共定位(mglur1和mglur5)。这些受体活化的一个组分是通过肌醇三磷酸的形成来提升胞质钙浓度。一些癌症(例如黑色素瘤)过表达mglur2和mglur3，并且psma可能通过激活这些受体而发挥作用。

胞内钙的增加可导致许多细胞激酶的活化，所述细胞激酶广泛影响下游信号传导。这些激酶可以包括但不限于主激酶钙/钙调蛋白依赖性激酶激酶ii(camkk2)和mtorc2。随后的实施例表明，psma的酶活性可以激活camkk2，其导致下游激酶(包括但不限于pi3k，akt，src和p27)的活化。本发明还包括以下认识：即psma调节其他激酶例如stat3、stat5和wnk1的活化。由于这些激酶对细胞稳态具有显著影响，因此其活化可导致对多种细胞过程的调节，所述细胞过程涉及细胞周期的调节和信号传导以及其他对肿瘤发生和癌症发展至关重要的途径。实际上，本文公开的研究显示，psma的活性与前列腺癌的发生和进展有关，提示有效抑制psma的早期的治疗干预可能具有很大的临床潜力并且能提升生存期。在一些实施方案中，所提供的方法包括与psma的抑制剂组合共同施用一种或多种这些激酶的抑制剂。这样的抑制剂是本领域已知的和/或在本文中有所描述。在一些实施方案中，stat3或stat5的抑制剂选自whi-p154、wp1066、stattic、s3i-201、ho-3867或硝呋酚酰肼。在某些实施方案中，wnk1的抑制剂选自pp1或pp2(参见yagi等,biochemistry.2009nov3；48(43):10255-66)，其全部内容通过引用并入本文。

虽然目前的护理性化疗标准可能会成功，但其也可导致对肿瘤的抗性。化疗抗性的机理包括但不限于关于以下问题：药物是否能接触肿瘤，输注速率和递送途径以及包括药物代谢和排出或排泄的机制。受psma活性影响的细胞内稳态和信号传导的变化也可能影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本申请公开的结果证明了当与psma活性的抑制剂组合使用时，某些化学治疗剂的细胞毒性提高。

鉴于这些发现，本发明的某些实施方案涉及通过向患者施用治疗有效量的化学治疗剂来治疗或预防癌症的方法，所述患者由于已经接受了psma抑制剂因此对所述化学治疗剂敏感。在一些实施方案中，所述方法包括在施用所述化学治疗剂之前向所述患者施用治疗有效量的psma抑制剂的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在施用所述化学治疗剂的同时向所述患者施用治疗有效量的psma抑制剂的步骤。

本发明还提供了治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向患有或易患有难治性癌症的受试者施用治疗有效量的psma抑制剂。在一些实施方案中，所述癌症是对阉割有抗性的前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症用雄激素受体抑制剂或者激素剥夺的治疗方式难以治疗。在一些实施方案中，所述癌症用本文所定义的化学治疗剂难以治疗。

在一些实施方案中，本发明提供了一种用于在患者中降低对化学治疗剂的抗性的方法，所述方法包括在施用所述化学治疗剂的同时或之前施用治疗有效量的psma抑制剂。

由于psma的表达是前列腺肿瘤和其他实体瘤的标志，因此本发明的实施方案提供了用于识别患有或者易患有癌症的患者的方法，所述患者以高水平的psma为特征。psma的水平可以通过许多测试来确定，包括但不限于组织学测试、活组织检查、血清学测试和医学成像。在一些实施方案中，可以使用放射性标记的示踪剂(例如包含此类示踪剂的抗体)来确定psma的水平。在某些实施方案中，可以使用染料标记的示踪剂来测定psma的水平。在一些实施方案中，可以通过将psma与放射性标记的示踪剂或者荧光示踪剂(例如但不限于抗体或小分子)结合来确定psma的水平。

在另外的实施方案中，可以通过使用纳米颗粒实现成像。在一些实施方案中，这种纳米颗粒由金属、类金属材料或非金属构成。在一些实施方案中，纳米颗粒核心可以任选地包括一个或多个涂层、表面相关实体和/或一种掺杂剂实体。在一些实施方案中，纳米颗粒可以具有一个或多个表面相关实体，例如稳定性实体、靶向性实体等。在一些实施方案中，这样的表面相关实体是层状或者包括在层中。在一些实施方案中，这样的实体与核心相关联或者附着于核心。在一些实施方案中，这样的实体与层相关联或者附着于层。在一些实施方案中，纳米颗粒与医用同位素结合，所述医用同位素与靶向性部分或掺杂剂共处一层。在一些实施方案中，这样的纳米颗粒包含psma抑制剂或其一部分。在一些实施方案中，这样的靶向性部分是抗体或小分子。在一些实施方案中，掺杂剂是荧光染料(例如，近红外(例如金属增强)荧光剂，双光子荧光剂等，例如alexa647，alexa488等)，激光泵送材料(例如，由稀土金属基化合物和/或过渡金属基化合物组的材料组成但不限于其的激光泵送材料)，由稀土金属光声活性染料和/或过渡金属光声活性染料组成的但不限于其的发光化合物，se(r)rs活性剂，上转换材料(例如由稀土金属和/或过渡金属组的材料组成的上转换材料)，诱导“慢光”的材料(例如，镨基化合物)，超声波(us)试剂及其任意组合(参见美国专利号5,306,403,6,002,471和6,174,677，其各自的全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方案中，从组织匀浆中确定psma的水平。在一些实施方案中，从质膜测定法确定psma的水平。

也可以如随后的实施例中所述，使用谷氨酸测定法来测量psma的水平。在一些实施方案中，所述测定法包括商购的amplexredglutamicacid测定法的改进版，其中叶酸(蝶啶-l-谷氨酸)适于被psma切割，使得谷氨酸成为所述amplexredglutamicacid测定法的底物。将表达的前列腺分泌物与叶酸和amplexred谷氨酸试剂一起孵育。含有psma的样品随后显示出正荧光，可用荧光读数器量化。在一些实施方案中，所述测定法包含通过酰胺键与虫荧光素缀合的谷氨酸，其适于被psma切割。将表达的前列腺分泌物与谷氨酸试剂加上atp和相关辅因子一起孵育。含有psma的样品随后显示出正发光，可用光度计量化。

在一些实施方案中，测定患者的psma水平以确定癌症的类型和/或候选的治疗方案是有用的。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防癌症的方法，所述方法包括识别以高水平psma为特征的患有或易患有癌症的患者；以及施用治疗有效量的psma抑制剂。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用所述psma抑制剂的同时或之后施用治疗有效量的化学治疗剂的步骤。

本文所用的术语“高水平的psma”是指以下情况：i)当所述患者的测试组织样品中psma的浓度高于来自所述患者的健康组织样品的psma浓度时的情况，或者ii)当所述患者的测试组织样品中的psma浓度高于在所述患者群体中正常的psma浓度时的情况。在一些实施方案中，健康组织样品是健康的前列腺组织或者来自良性前列腺增生的组织。在一些实施方案中，高水平的psma是这样的情况：在所述患者测试组织样品中psma的浓度比在所述患者的健康组织中psma的浓度或者在所述患者群体中正常的psma浓度高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或者至少10倍。

在一些实施方案中，当患者具有的psma水平高于约1-5pg/ml时提示高水平的psma。在一些实施方案中，当患者具有的psma水平高于约5pg/ml、约10pg/ml、约20pg/ml、约30pg/ml、约50pg/ml、约75pg/ml、约100pg/ml、约150pg/ml、约200pg/ml、约250pg/ml、约500pg/ml、或者约1000pg/ml时，提示高水平的psma。在一些实施方案中，当患者具有的psma水平高于约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、约275ng/ml、约300ng/ml、约325ng/ml、约350ng/ml、约375ng/ml、约400ng/ml、约450ng/ml、或者约500ng/ml时，提示高水平的psma。

在一些实施方案中，当与叶酸–amplexredglutamicacid试剂孵育的表达的前列腺分泌物样品(例如，如随后的实施例中所述)显示出对体积基准化后高于50的荧光或发光辐射时，指示高水平的psma。在一些实施方案中，当与叶酸–amplexredglutamicacid试剂孵育的表达的前列腺分泌物样品显示出对体积基准化后高于70、80、90、100、125、150、或者200的发光辐射时，指示高水平的psma。

在一些实施方案中，当与可活化剂孵育的表达的前列腺分泌物样品(例如，如随后的实施例中所述)显示出对体积基准化后高于50的发光辐射时，指示高水平的psma。在一些实施方案中，当与可活化剂孵育的表达的前列腺分泌物样品显示出对体积基准化后高于70、80、90、100、125、150、或者200的发光辐射时，指示高水平的psma。

除了患者的治疗之外，本发明所述方法也可以在体外使用。在一些实施方案中，本发明提供了使肿瘤细胞对化学治疗敏感的方法，所述方法包括用psma抑制剂处理所述肿瘤细胞。

在本发明提供的方法中，化学治疗剂如本文所定义。在一些实施方案中，化学治疗剂选自下组：拓扑异构酶i抑制剂，拓扑异构酶ii抑制剂，微管活性化合物，诱导细胞分化过程的化合物，靶向/降低蛋白激酶活性或脂质激酶活性的化合物以及进一步的抗血管生成化合物，靶向、降低或抑制蛋白或脂质磷酸酶活性的化合物，抗雄激素，蛋白酶体抑制剂，或者mek抑制剂。在一些实施方案中，化学治疗剂选自多柔比星、紫杉醇、azd6244、bez235、拉帕替尼、万珂和恩扎鲁胺。

在一些实施方案中，psma抑制剂的有效浓度可以是1-100nm、1-500nm、1-1000nm、1-100um、1-500um、1-1000um、1-5mm、2-6mm、3-7mm、4-8mm、5-9mm的范围，其中所述psma抑制剂的浓度在单独使用时没有细胞毒性。在一些实施方案中，psma抑制剂的有效浓度可以为1-1000mg/m²、1-10mg/m²、11-50mg/m²、51-100mg/m²、101-500mg/m²、或者501-1000mg/m²的浓度。在一些实施方案中，所述psma抑制剂的浓度单独使用时减慢但不逆转肿瘤生长。在一些实施方案中，psma抑制剂的治疗有效量是有效抑制或降低癌症转移扩散的量。

在上文和本文中所公开提供的方法中，癌症可以是本文所定义的任何癌症。在一些实施方案中，所述癌症是前列腺的。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌，肺癌或结肠癌。在一些实施方案中，所述癌症包括实体肿瘤。在一些实施方案中，所述实体瘤不是前列腺肿瘤或肉瘤肿瘤。

在一些实施方案中，待治疗的癌症对化学治疗剂、雄激素受体抑制剂或激素剥夺形式的治疗具有抗性。

新生血管形成和转移的治疗

新生血管形成是几种疾病的进展和发病机制中的重要因素，所述疾病包括但不限于类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性和肿瘤生长。在癌症中，新血管的形成允许肿瘤细胞分裂并最终离开所述原始肿瘤，以在体内其他地方形成新的病灶或者转移。

psma的活性可调节细胞内信号传导，这在之前已经被发现参与新生血管形成的过程。具体来说，psma已经被证明通过调节p21激活的激酶(pak)和粘着斑激酶(fak)来调节整合素信号和细胞骨架动力学(conway等2006)。此外，本申请中的实施例证明了vegf-a的增加与psma的表达同时发生，并且结果显示对psma的抑制引起较低的肿瘤血管形成和较低的肿瘤氧合。这些结果进一步证明了psma在肿瘤生长和转移能力方面的重要性。

因此，本发明的某些实施方案提供了抑制癌细胞迁移的方法，所述方法包括向患有或易患有癌症的患者施用治疗有效量的psma抑制剂。

在一些实施方案中，本发明提供了抑制新生血管形成的方法，所述方法包括向患有疾病的其发病机理包括新血管形成的患者进行施用。另外的实施方案提供了抑制新生血管形成的方法，所述方法包括向患有或易患有癌症的患者施用治疗有效量的psma抑制剂。另外的实施方案提供了抑制新生血管形成的方法，其中所述肿瘤的非限制性例子包括癌、淋巴瘤、母细胞瘤和肉瘤。另外的实施方案提供了对新生血管形成的抑制，其中所述肿瘤是组织实体肿瘤，包括但不限于乳腺组织实体肿瘤，肺组织实体肿瘤或结肠组织实体肿瘤。

已经发现，一些抗血管生成的治疗作为单一疗法已经对癌症基本上无效，但与单独的常规化疗相比，其与常规化疗联合施用时能提供改善的结果。这种矛盾性效应可以通过抗血管生成治疗使得肿瘤脉管系统正常化来解释，其中所述脉管系统从“异常”变为更“正常”的表型。肿瘤中的“异常”表型通常以缺氧和营养剥夺为特征，其也会促进对治疗的抗性。这些血管的正常化可导致外源施用的治疗剂的递送和功效的改善。在不希望受任何特定理论约束的条件下，认为位于肿瘤新血管系统上的psma可以通过促进血管的高渗透性来促进产生异常的血管表型。因此，在一些实施方案中，本发明提供了通过施用psma抑制剂使肿瘤脉管系统正常化的方法。在一些实施方案中，psma抑制剂和化学治疗剂的共同施用通过使肿瘤脉管系统正常化而导致癌症治疗得到改善。

在一些实施方案中，所提供的方法包括治疗患有疾病的患者，其中使用psma抑制剂的浓度为单独使用时减慢但不逆转肿瘤生长的浓度。在一些实施方案中，所述psma抑制剂的治疗有效量是有效抑制或降低癌症转移扩散的量。

另外的实施方案提供了在患有或易患有癌症的患者中治疗所述癌症的方法，所述方法包括以下步骤：确定存在于患者肿瘤上的psma的量；并且向所述患者施用合适的化学治疗剂；其中高水平的psma指示应该用升高水平的化疗治疗所述患者。另外的实施方案提供了在患有或易患有癌症的患者中治疗所述癌症的方法，所述方法包括以下步骤：确定存在于患者肿瘤上的psma的量；并且向所述患者施用合适的化学治疗剂；其中psma的水平高于约1-5pg/ml指示应该用升高水平的化疗治疗所述患者。在一些实施方案中，本发明提供了在患有或易患有癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用升高剂量的化学治疗剂的步骤，所述患者：a)正在接受化学治疗剂；和b)显示出高于约1-5pg/ml的psma水平。

在一些实施方案中，当psma的水平高于约1-5pg/ml、约5pg/ml、约10pg/ml、约20pg/ml、约30pg/ml、约50pg/ml、约75pg/ml、约100pg/ml、约150pg/ml、约200pg/ml、约250pg/ml、约500pg/ml、或者约1000pg/ml时，指示应该用升高水平的化疗治疗所述患者。

在一些实施方案中，当psma的水平高于约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、约275ng/ml、约300ng/ml、约325ng/ml、约350ng/ml、约375ng/ml、约400ng/ml、约450ng/ml、或者约500ng/ml时，指示应该用升高水平的化疗治疗所述患者。

在一些实施方案中，当如上所述和本文所述的叶酸-amplexredglutamicacid测定法中指示高水平的psma时，应该用升高水平的化疗治疗患者。

在一些实施方案中，当如上所述和本文所述的可活化试剂测定法中指示高水平的psma时，应该用升高水平的化疗治疗患者。

在一些实施方案中，升高水平的化疗包括提高所述患者施用的一种或多种化学治疗剂的浓度。

在某些实施方案中，升高水平的化疗是大于先前施用剂量的剂量，大于推荐剂量的剂量或者大于经批准剂量的剂量。在一些实施方案中，升高水平的化疗代表在先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量上增加约10-200％。在一些实施方案中，升高水平的化疗代表在先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量上增加约10-100％。在一些实施方案中，升高水平的化疗代表在先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量上增加约20-100％。在一些实施方案中，升高水平的化疗代表在先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量上增加约30-100％。在一些实施方案中，升高水平的化疗代表在先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量上增加约40-100％。在一些实施方案中，升高水平的化疗代表在先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量上增加约50-100％。在一些实施方案中，升高水平的化疗代表在先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量增加约60-100％。在一些实施方案中，升高水平的化疗代表先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量增加约75-100％。在一些实施方案中，升高水平的化疗代表先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量增加约100-200％。

在一些实施方案中，升高水平的化疗是先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量的约1-10倍。在一些实施方案中，升高水平的化疗是先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量的约2-10倍。在一些实施方案中，升高水平的化疗是先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量的约2-5倍。在一些实施方案中，升高水平的化疗是先前施用剂量、推荐剂量或者经批准剂量的约1-5倍。

在一些实施方案中，升高水平的化疗包括向所述患者施用一种或多种另外的化学治疗剂。在一些实施方案中，另外的化学治疗剂选自米托蒽醌、泼尼松、多西紫杉醇、地塞米松、雌莫司汀、华法令、卡巴他赛、雌莫司汀、依托泊苷、恩杂鲁胺和bez235。在一些实施方案中，升高水平的化疗包括施用化学治疗剂的组合。在一些实施方案中，化学治疗剂的组合包括米托蒽醌和泼尼松，多西紫杉醇和泼尼松，多西紫杉醇和地塞米松，雌莫司汀和华法令，多西紫杉醇和卡巴他赛，雌莫司汀和依托泊苷，或者恩杂鲁胺和bez235。

在一些实施方案中，先前施用剂量是在确定存在于患者肿瘤上psma的量之前，先前施用于所述患者的剂量。在一些实施方案中，推荐剂量是由医师或其他医学专业人员推荐或指定的剂量。在某些实施方案中，批准剂量是由美国食品和药物管理局针对所述化学治疗剂批准的剂量。

示例

实施例1：材料和方法

细胞培养

所有细胞系均获自atcc(manassas，va)，并根据供应商的指导培养生长。lncap和pc3细胞在含有10％胎牛血清的rpmi1640培养基中生长，所述培养基补充有hepes缓冲液(1％)，青霉素/链霉素(1％)和丙酮酸钠(1％)。表达psma的经转导的pc3细胞在含有胎牛血清的f12k培养基中生长，所述f12k培养基补充有青霉素/链霉素(1％)和嘌呤霉素(6μg/ml)。将转导的lncap细胞(其中psma被敲低)在含有10％胎牛血清的rpmi1640培养基中生长，所述rpmi1640培养基补充有hepes缓冲液(1％)，青霉素/链霉素(1％)，丙酮酸钠(1％)和嘌呤霉素(3μg/ml)。hpmsa

为了将psma转导到pc3细胞中，在氨苄青霉素的选择压力下将含有人psma基因的sfg骨架质粒转染进细胞。以对嘌呤霉素的抗性为基础，选择成功转导的细胞。为了从lncap细胞中敲低psma，使用了shrnacloserlgh-du53991(transomic，huntsville，al)。

细胞质钙的定量

将细胞以每孔10,000的密度接种在96孔板上并生长过夜。根据制造商的说明加载钙感光染料fluo4(lifetechnologies，carlsbad，ca)。用毒胡萝卜素(1μm，tocris，minneapolis，mn)、l-使君子氨酸(110μm，tocris)、3,5-dhpg(0.67mm，tocris)、l-ap3(125μm，tocris)、u73122(50μm，tocris)和2-pmpa(100μm，tocris)处理所述细胞，然后紧接着用spectramaxm5酶标仪(moleculardevices，sunnyvale，ca)测量钙水平。

激酶组谱分析

camkk2、ampkα和akt抗体购自cellsignaling(danvers，ma)。将细胞生长至汇合并用2-pmpa(5μm，tocris)处理48h。用等电聚焦仪(nanopro1000，proteinsimple，santaclara，ca)测定目标蛋白的磷酸化状态，其中根据供应商的指导准备和分析所述样品。根据产品说明书，用人磷激酶阵列(ary003，r&dsystems，minneapolis，mn)确定关键蛋白的位点特异性磷酸化。

信号输出评估

在基于trizol的rna提取之后，在u133a2.0基因阵列(affymetrix，santaclara，ca)上进行基因表达阵列。通过测量前列腺特异性抗原(psa)的水平来评估雄激素受体(ar)通路的输出。具有功能性ar通路的lncap细胞获自atcc(manassas，va)，并生长至汇合。然后用2-pmpa(5μm)处理其48h，然后用delfiapsa测定法(perkinelmer，waltham，ma)在培养基中筛选分泌的psa。使用相应的购自caymanchemicals(annarbor，mi)的试剂盒对由一氧化氮合酶活性导致的一氧化氮的水平和所有分泌的前列腺素的浓度进行量化。通过使用来自caymanchemicals(annarbor，mi)的nad测定法和来自biovision(milpitas，ca)的staybriteatp试剂盒，通过定量细胞内的nad+和atp水平来测定由于信号的变化而导致的能量产生的改变。

psma和mglur1/5的免疫染色

将lncap细胞以每孔1,000个细胞的密度接种在4孔室载玻片上。过夜生长后，用4％多聚甲醛固定所述细胞，然后用小鼠j591抗体(用来检测psma的细胞外基序)和i型mglur的兔多克隆抗体(mglur1/5抗体，nb300-126，novusbiologicals，littleton，co)进行连续染色。细胞核用hoechst33342(lifetechnologies，carlsbad，ca)染色。用leica直立共焦sp5显微镜对切片进行成像。

体内代谢变化的成像

将lncap异种移植物(100μl基质胶，其中有300万个细胞)植入雄性无胸腺的裸鼠(harlanlaboratories，indianapolis，in)中。在异种移植后立即每天静脉注射2-pmpa(0.4mm，用100μl进行后眼窝注射)处理所述小鼠。使用vevolazr小动物光声成像平台(visualsonics，toronto，on，canada)，在处理开始后15天评估肿瘤的血管形成和氧合。

体外化疗

以96孔格式(每孔2500个细胞)接种细胞，并生长48h。然后用终浓度为200nm的以下药物对其进行处理：多柔比星、紫杉醇、azd6244、bez235、拉帕替尼和万珂(均购自selleckchemicals，houston，tx)。对于联合治疗，用2-pmpa(终浓度为5μm)处理细胞。在存在所述药物的条件下过夜孵育后，根据供应商的指导(lifetechnologies，calrsbad，ca)，用alamarblue方法测定细胞活力。

体内化疗

将lncap异种移植物(100μl基质胶，其中有300万个细胞)植入雄性无胸腺的裸鼠(harlanlaboratories，indianapolis，in)的每个侧腹中。在异种移植后立即每天静脉注射2-pmpa(0.4mm，100μl后眼窝注射物)处理所述小鼠。通过用千分卡钳测量肿瘤来评估所述肿瘤的体积。用具有lncap异种移植物的雄性无胸腺裸鼠进行联合治疗，每天在肿瘤检测后对其进行治疗。通过静脉注射(100μl后眼窝注射物)施用化疗，动物接受恩扎鲁胺(0.15mm)、2-pmpa(3mm)或者两种化合物都接受(0.15mm恩扎鲁胺和3mm2-pmpa)。用赋形剂(dmso)或者azd8055和xl184的组合(含有0.4mmazd8055和8μmxl184的100μl后眼窝注射物)处理具有pc3-psma异种移植物(100μl基质胶，其中有300万个细胞)的雄性无胸腺裸鼠。

人前列腺癌样品的分析

通过cbio门户(www.cbioportal.org)获得生化复发转移的数据，并将检索的数据在数据呈现软件prism上进行绘制。按照研究所的指导方针，从mskcc获得来自前列腺切除术的患者的前列腺癌活检物。将样品处理并放置在玻璃载玻片组织微阵列上，然后使用标准的免疫组织化学方法，用抗psma抗体(daco)，抗pten抗体(cellsignalingtechnology)或抗4ebp1(cellsignalingtechnology)进行染色。

成像和评分由与所述研究无关的独立的病理学家进行。然后在matlab上通过主成分分析对病理结果进行统计学评估和模式识别处理。在前列腺切除术之前，按照研究所的程序，在tum处使用68ga-psma特异性试剂在前列腺癌患者中进行pet成像。处理来自所述原发肿瘤的活组织检查物，并将样品沉积在载玻片上，按照标准的免疫荧光显微镜操作流程用抗psma抗体(dako)和抗pakt抗体(cellsignalingtechnology)对其染色。

使用由broadinstitute(www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)提供的软件包，对通过cbio门户(www.cbioportal.org)获得的患者数据和所述发明人在基因芯片(affymetrix)分析后收集到的细胞系数据进行基因集富集分析。

实施例2：psma在前列腺癌的钙稳态中的作用

根据供应商的说明，使用荧光fluo4测定试剂盒(invitrogen)评估psma的表达对前列腺癌细胞系中钙稳态的效应。将所述板在490nm激发，并用spectramaxm5酶标仪(moleculardevices)监测520nm处的荧光发射。结果表明，表达psma的细胞具有较高的细胞质钙浓度。当与缺乏psma的表达的细胞(例如pc3-wt)相比，psma的表达，例如通过lncap-wt和pc3-hpsma人前列腺癌细胞的psma的表达，导致更高的细胞质钙水平(图1a)。为了检查细胞质中钙的积累，用毒胡萝卜素(1μm，tocris)处理所述细胞，然后紧接着用酶标仪进行测量。研究表明，表达psma的细胞比所述pc3-wt细胞对毒胡萝卜素更加敏感，这导致钙在其细胞质中显著积累(图1b)。此外，我们研究了psma是否通过其酶活性经由mgluri型受体促进钙信号传导。在立即进行钙测量之前，用l-使君子氨酸(110μm；mgluri型激动剂，tocris)，l-ap3(125μm；mgluri型拮抗剂，tocris)或psma抑制剂(100μm，tocris)处理所述细胞。在表达psma的细胞中，我们发现所述钙水平受psma酶活性和mgluri型的调节，这是因为对psma的抑制类似于对mgluri型的抑制，都降低了钙水平(图1c)。另外，我们使用了(s)-3,5-dhpg(0.67mm；mgluri型激动剂，tocris)和磷脂酶c抑制剂u73122(50μm，tocris)，并且发现psma抑制作用类似于磷脂酶c抑制作用，都导致了钙水平的降低，证明psma通过其酶功能激活mgluri，导致磷脂酶c的活化和钙信号传导的启动(图1d)。

实施例3：psma与glur共定位

psma在前列腺癌细胞的质膜上与mglur1/5共定位。用4％多聚甲醛固定lncap细胞，并用j591psma抗体和mglur1/5的多克隆抗体染色(图2)。将lncap细胞以每孔1,000个细胞的密度接种在4孔载玻片上。过夜生长后，用4％多聚甲醛固定所述细胞，然后用小鼠j591抗体(用来检测psma的细胞外基序)和i型mglur的兔多克隆抗体(mglur1/5抗体，nb300-126，novusbiologicals，littleton，co)进行连续染色。细胞核用hoechst33342(lifetechnologies，carlsbad，ca)染色。用leica直立共焦sp5显微镜对切片进行成像。

实施例4：psma的酶活性上调几种钙依赖性信号传导效应物的磷酸化

分析了钙依赖性下游效应物的磷酸化状态。由于代谢型谷氨酸受体及其相关g蛋白的活化可导致下游效应物的磷酸化，因此检查了关键蛋白相对于psma的表达的磷酸化水平。使用来自proteinsimple的nanopro系统，其基于所述靶蛋白的等电点变化来允许测定整体的磷酸化状态。在用nanopro裂解缓冲液裂解所述细胞后，按照供应商的指南制备了样品。所有使用的抗体均购自cellsignaling，用来检测靶蛋白的总蛋白水平。激酶camkk2的磷酸化在表达psma的细胞中更高(图3a)，而在psma阴性的细胞(pc3-wt)中，所述磷酸化水平显著降低。用所述psma抑制剂处理48h(5μm)降低了这些细胞中的camkk2的磷酸化，而在缺乏psma的细胞中没有效应(图3b)。同样地，在用所述抑制剂处理后，所述psma阳性的细胞中ampkα(camkk2的下游靶点)(图3c)和关键激酶akt(图3d)的磷酸化受损，表明psma通过其酶活性调节主要信号通路。先前已经表明，g蛋白激活的pi3k或者钙激活的mtorc2磷酸化pak可以引起akt的磷酸化。所有图形都表示mean±s.e.m.。

收集自人前列腺癌样品的数据用于确认psma在调节主要信号通路中的作用。证明psma(“folh1”)的表达水平与前列腺癌患者中加快的生化发生和转移有关(图3e)。此外，对含80个样品的组织微阵列的主成分分析显示了psma的表达和4ebp1的磷酸化之间的相关性，所述4ebp1处在akt和mtor的下游(图3f)。正如在小鼠模型中所发现的，通过pet显示了psma阳性的患者具有比psma阴性的个体更高水平的磷酸化akt。此外，在前列腺癌患者中，基于基因集富集分析发现，psma的表达与mtor通路的活化相关(图12)。

这些数据显示，在前列腺癌中psma的酶活性调节许多关键性信号传导效应物的磷酸化，提示其在致癌信号传导中的主要作用，并且表明前列腺癌中的独特的治疗机会。

实施例5：psma协调复杂的多组分原致癌库

考虑到psma的抑制作用影响了一些关键激酶的磷酸化，因此利用来自r&dsystems的人激酶组谱分析阵列来获得更宽范围的由该蛋白质调节的其它激酶。lncap-wt细胞在存在psma抑制剂(48h，5μm)的条件下生长，并且pc3-psma细胞在嘌呤霉素诱导的选择条件下生长。对照细胞包括在完整rpmi培养基中生长48h的lncap-wt和pc3-wt细胞。按照阵列方案裂解和处理细胞，并按照供应商的指导进行所述阵列检测。在存在化学发光底物和hrp缀合的检测抗体的条件下，在暗室中进行膜曝光后，进行了阵列膜的成像。结果表明，psma的抑制作用影响了许多蛋白(包括tor、p27和src)的磷酸化，而pc3细胞中psma的表达提升了这些蛋白的磷酸化(图4a)。在用所述psma抑制剂处理lncap-wt细胞后，许多重要效应物的磷酸化有所下降，而在pc3细胞中psma的表达(pc3-hpsma)相应地上调了这些蛋白的磷酸化。

使用affymetrixu133a2.0基因阵列进行的基因组分析显示在表达psma的pc3细胞中多个基因被上调(图4b)。基于这些基因的功能使用在线的david功能注释平台对其分类，显示了在表达psma的pc3细胞中上调的许多基因涉及信号转导、代谢和血管生成。不含psma的细胞具有更高mrna水平的参与细胞周期调节和信号传导的基因(图4c)。其中最突出的发现是，在表达psma的细胞中vegf-a的表达上调，而pigf的水平不受影响。在pc3细胞(pc3-psma)中psma的表达上调了前转移性的/血管生成效应器vegf-a的水平，而pigf的水平不受影响。这表明了psma在前列腺癌血管生成和一般肿瘤新生血管形成中起作用(图4d)。这些数据表明了psma对pca发生和发展起多重效果，表明能够有效抑制psma的早期治疗干预可能具有很大的临床潜力并能提高存活率。

实施例6：psma有助于前列腺癌的发展

由于psma调节akt的磷酸化，因此研究了psma的抑制以及随后的akt活性的下调是否影响雄激素受体(ar)通路的状态。由于psa的水平受所述ar通路的调节，因此将具有功能性雄激素受体(ar)的lncap-wt细胞在存在pmsa抑制剂(5μm)的条件下生长48h，并且筛选所述细胞的培养基检测psa(delfiapsa，perkinelmer)。结果显示，psma的抑制提升了psa水平，因为通过缓解akt介导的负反馈，导致ar信号级联的过度活化(图5a)。psma的抑制不影响psa的mrna水平。

由于akt也参与细胞代谢，因此通过测量nad+和atp的水平来确定pc3细胞中psma的表达是否改变其代谢途径。对于nad+的测量，分光光度测定法购自caymanchemicals，而atp的定量用来自biovision的staybriteatp测定法进行。所有测定均按照相应的供应商的方案进行。pc3-psma细胞比所述psma阴性细胞(pc3-wt)具有更高的nad+和atp水平，显示psma的表达改变前列腺癌的生物能量并且通过将能量的产生从有氧糖酵解转为氧化磷酸化来提升atp的产生(图5b)。

此外，由于akt和ca+2都调节一氧化氮合酶的活性和前列腺素的水平，因此检查了psma的抑制是否影响这些过程。通过使用来自caymanchemicals的试剂盒定量所述样品的总硝酸盐含量来评估一氧化氮合酶的活性，而用来自caymanchemicals的总前列腺素试剂盒测量分泌在细胞培养基中的总前列腺素的水平。通过在37℃，5％co2条件下用psma抑制剂(5μm)作用48h进行psma抑制。所有样品都根据试剂盒的说明进行制备，结果表明psma的抑制降低了硝酸盐和前列腺素的水平。psma的抑制降低了一氧化氮合酶的活性，由较低的硝酸盐水平所反映。用所述抑制剂进行的处理不影响在不表达psma的pc3-wt细胞中的硝酸盐浓度。与缺乏psma的细胞(pc3-wt)相反，在用所述psma抑制剂处理lncap和pc3-psma细胞后，分泌的前列腺素的总水平降低。(图5c-d)。这些数据显示，psma负调节所述ar通路并将前列腺癌的代谢转化为氧化磷酸化，其发生在晚期的和转移性的病变中。psma还调节潜在的血管生成效应物、炎性效应物和转移效应物的水平，其促进前列腺癌的病程发展并破坏有效治疗。

实施例7：psma影响体内的血管生成和肿瘤氧合

将lncap-wt异种移植物植入雄性无胸腺裸鼠侧腹并在异种移植物植入后每天用盐水或psma抑制剂(2-pmpa，0.4mm，100μl后眼窝注射物)处理，该体内研究显示，psma的抑制导致较低的肿瘤血管形成和较低的肿瘤氧合，所述肿瘤氧合使用visualsonics的光声系统基于氧血红蛋白和脱氧血红蛋白的不同的光吸收特性进行评估。所述研究中使用的肿瘤的大小大致相同。用所述抑制剂处理的动物具有的肿瘤总血红蛋白水平较低，表明psma在肿瘤血管形成中起作用。(图6a-b)。除肿瘤血管形成外，psma的抑制还影响所述肿瘤的代谢程序，其导致氧气的消耗量降低。(图6c)

实施例8：psma酶活性的抑制改善许多化学治疗剂的细胞毒性

考虑到psma影响多个靶点的磷酸化状态，因此研究了psma的抑制是否可以抵消对临床中或者临床试验中使用的各种化学治疗剂的抗性。lncap和pcs3-psma细胞以96孔的形式，以每孔2,500个细胞的密度进行接种，并且生长48小时后用药物(多柔比星(阿霉素；dna嵌入剂))，紫杉酚(紫杉醇；微管稳定剂)，azd6244(司美替尼；mek1和erk1/2的抑制剂)，bez235(dactolisib；pi3k和mtor的抑制剂)，拉帕替尼(egfr和erbb2的抑制剂)，或者万珂(硼替佐米；20s蛋白酶体抑制剂)，在1xpbs中的终浓度为200nm)或者用药物(终浓度为200nm)和2-pmpa(终浓度为5μm)一起处理所述细胞。孵育过夜后，按照供应商的方案，使用alamarblue方法(invitrogen)以荧光法评估细胞活力。在表达psma的细胞中，psma的抑制增强了所有化学治疗剂的毒性，而缺乏psma的lncap细胞(lncap-kd)对所有药物比其亲本细胞系(lncap)更敏感。pc3-wt细胞针对所有药物(除了万珂之外)的细胞毒性谱与表达psma的pc3细胞(pc3-psma)相似。这可能归因于这两种细胞系之间不同的氧化应激负担，使得pc3-wt细胞对万珂更敏感。(图7a-d)。在所述研究的时程中，单独的psma抑制剂没有引起细胞毒性效应。这些数据证实psma为前列腺癌提供了化学耐药和生存优势。

实施例9：psma的表达对提升了活性氧簇的细胞内水平的化学疗法具有抗性

通过基于荧光的alamarblue法(λex＝565nm以及λem＝585nm)测定了(a)表达psma的细胞(lncap-psma+ve)和(b)psma阴性细胞(lncap-psma-ve，其中用shrna敲低了psma的表达)的细胞活力。在用赋形剂(dmso)或者产生ros的药物伊利司莫(250nm，selleckchemicals)进行了药物施用后的48h，评价了细胞活力。对psma酶活性的抑制(c和d)消除了耐药性并且使所述细胞易于死亡。经选择性psma抑制剂(2-pmpa，250nm)处理过的(c)表达psma的细胞和(d)psma阴性细胞的细胞活力。对所述细胞处理了48h，并且细胞活力用alamarblue法测定。(平均值±sd，n＝4)(图8)。

实施例10：体内的psma的抑制阻碍肿瘤生长并改善存活

使用在侧腹上具有lncap异种移植物的雄性无胸腺的裸鼠进行每日处理，来检查肿瘤生长。将含3,000,000个细胞的100μl基质胶注入每只动物的侧腹，并且立即用2-pmpa(0.4mm，100μl后眼窝注射物)处理所述动物。通过用千分卡钳测量肿瘤来评估所述肿瘤的体积。结果显示，psma的抑制不影响肿瘤起始(图9a)，但是其导致了缓慢生长的较小的肿瘤并延长了所述动物的存活(图9b)。在另一不同的研究中，每天在肿瘤检测后，用恩扎鲁胺(0.15mm，100μl后眼窝注射物)，2-pmpa(3mm，100μl后眼窝注射物)或者用两种化合物一起(0.15mm恩扎鲁胺和3mm2-pmpa，100μl后眼窝注射物)来处理具有lncap异种移植物的雄性无胸腺裸鼠。psma抑制剂(2-pmpa)和ar拮抗剂(恩扎鲁胺)的联合处理导致了较慢的肿瘤生长和早期的肿瘤消退，表明psma的抑制可能在所述疾病早期阶段提供重要的治疗干预窗口。(图9c-d)。

实施例11：体内psma的水平与较差的化疗反应相关

由于psma通过akt上调mtor和血管生成信号，因此研究了通过抑制所述mtor和血管生成通路的肿瘤治疗反应。使用具有高水平或低水平psma的细胞，将pc3-psma异种移植物植入雄性无胸腺裸鼠中(每侧腹的基底胶含3,000,000个细胞，皮下注射100μl)。在所有小鼠在其侧腹部发生肿瘤后，开始所述治疗过程，其中每隔一天用赋形剂(dmso)或azd8055和xl184的组合(azd80550.4mm和xl1848μm100μl后眼窝注射物；用卡尺测量肿瘤尺寸)处理所述小鼠。在所述研究结束时，与具有较高psma水平的异种移植物的对应物相反，经所述药物处理的并且具有较低psma水平的小鼠显示出肿瘤消退(图10a-b)。

实施例12：鉴定由于psma的表达和活性而被上调基因表达的基因

将基因分类到细胞过程家族中也显示，在前列腺癌中psma的表达使信号传导效应物的表达上调。lncapwt：psma阳性，lncapkd：psma阴性，pc3wt：psma阴性，pc3-psma：psma阳性(图11)。

实施例13：psma在前列腺癌中的作用

这些结果证实，psma通过其酶活性和加工(多)谷氨酰化的底物(包括naag和叶酸)的能力来激活代谢型谷氨酸受体i型，其启动下游信号级联，所述下游信号级联提高胞质钙水平。释放的钙进一步激活各种信号传导效应物，改变代谢并引发肿瘤及其转移的环境(图13)。

实施例14：用于定量临床样品中psma水平的改进版amplexred谷氨酸测定法

改进版的psmaamplexred谷氨酸/谷氨酸氧化酶测定试剂盒(lifetechnologies，carlsbad，ca)利用叶酸而非谷氨酸，这是因为叶酸由通过酰胺键与谷氨酸连接的蝶酰基部分组成。在psma存在的条件下，酰胺键被切开，释放出所述蝶酰基团和谷氨酸，其中所述谷氨酸可被所述amplexred测定法中的谷氨酸氧化酶氧化以产生α-酮戊二酸、氨和过氧化氢。为了增强信号，发生氨基转移反应，其中l-谷氨酸转氨酶将α-酮戊二酸转化为谷氨酸。在收集eps尿样后，就可以立即使用或者将其储存在-80◆c。对于定量psma，将这些样品在室温下，在50mmhepes和0.1mnacl缓冲液中与所述叶酸底物(2mm)预孵育24h。通过用该缓冲液进行稀释来调整总蛋白浓度。所述测定法使用阳性对照，其由重组的psma(4nm、10nm、20nm、40nm和100nm，r&dsystems，minneapolis，mn)组成。所述阳性对照补充有2mm的所述叶酸底物，以允许信号基准化和随后的psma的定量。在所述24小时孵育结束时，进行amplexred谷氨酸测定法，其中所述样品补充有100μμ的amplexred反应剂，所述amplexred反应剂在1x反应缓冲液中含有0.25u/ml辣根过氧化物酶，0.08u/mll-谷氨酸氧化酶，0.5u/mll-谷氨酸-丙酮酸转氨酶和200μml-丙氨酸(lifetechnologies，carlsbad，ca)。使用可以检测荧光的酶标仪(spectramaxm5，moleculardevices，sunnyvale，ca)以及使用小型动物成像系统(ivis200，perkinelmer，waltham，ma)获得结果。

实施例15：用于定量临床样品中psma水平的可活化剂

所述psma可活化剂由通过酰胺键与虫荧光素缀合的谷氨酸底物组成。在存在psma的条件下，所述酰胺键被切开，释放谷氨酸和可被荧光素酶检测到的虫荧光素。在收集eps尿样后，就可以立即使用或者将其储存在-80℃。对于定量psma，将这些样品在室温下，在50mmhepes和0.1mnacl缓冲液中与所述谷氨酸-虫荧光素底物(2mm)预孵育24h。通过用该缓冲液进行稀释来调整总蛋白浓度。所述测定法使用阳性对照，其由重组的psma(4nm、10nm、20nm、40nm和100nm，r&dsystems，minneapolis，mn)组成。所述阳性对照补充有2mm的所述谷氨酸-虫荧光素底物，以允许信号基准化和随后的psma的定量。在所述24小时孵育结束时，进行荧光素酶测定法，其中所述样品在生物发光缓冲液[40mmtris-乙酸酯，1mmedta，1mmdtt，3.45mmatp，0.2mnacl，5.7mmmgso4和0.76mm辅酶a(ph7.6)]中补充有2nm的萤火虫萤光素酶(roche，sanfrancisco，ca)。使用可以检测荧光的酶标仪(spectramaxm5，moleculardevices，sunnyvale，ca)以及使用小型动物成像系统(ivis200，perkinelmer，waltham，ma)获得结果。