本发明属于医疗材料的制备技术领域，具体涉及一种脱细胞角膜的制备方法。
背景技术：
角膜病是我国第二大致盲性眼病，我国现有约400万角膜盲患者，每年角膜盲病人新增约10万余人，但目前国内每年仅能实现大约5000-8000例角膜移植手术。角膜供体严重不足的现实国情，导致绝大多数角膜盲患者在黑暗中排队等待，有的甚至错过最佳治疗机会，导致永久失明。角膜移植分为穿透性角膜移植、板层角膜移植和角膜内皮移植。其中板层角膜移植对供体材料的要求较低，适合于角膜内皮无明显病变的所有患者，板层角膜移植约占角膜移植总算的1/2，如解决了板层角膜移植的供体角膜材料，就解决了我国一半的角膜病盲人的手术复明问题。近年来，随着生物组织工程学的广泛和深入研究，脱细胞处理和病毒灭活等工艺制备的异种角膜基质材料在动物水平和临床应用中取得了初步的治疗效果，但角膜基质经脱细胞后，存在透明度差，部分力学结构破坏所致的抵抗力下降、厚度逐渐变薄等问题仍没有很好解决，故应用脱细胞基质的角膜在临床上仍不能替代人的角膜，没有解决我国角膜供体材料严重匮乏的问题，故优化脱角膜基质细胞的工艺，使经过脱细胞的角膜能保持透明和力学结构是目前研究的热点，也是为我国角膜盲患者重建光明带来的希望。
以往报道的角膜脱细胞方法多使用基本缓冲液，如PBS、HBSS、细胞培养液等对角膜进行溶胀，通过物理、化学或生物学方法将细胞破碎后进行洗脱，短时间处理不能有效清除细胞成分，一般需要24-72小时的脱细胞过程，当长时间处理往往会导致角膜有序胶原结构的破坏，伴随着角膜透明性丧失，光学效果差，达不到临床复明的手术要求。虽然经过甘油脱水后可再次恢复透明，但移植后会逐渐变薄或长期不透明，不能达到长期复明的目的。针对上述问题，研发新型的脱细胞角膜制备方法，避免因物理、化学和生物学等处理对角膜胶原纤维结构造成的破坏，使脱细胞后的角膜保持透明和应用的力学特性是目前亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是为了避免现有技术存在的缺点，提供一种始终保持角膜透明特性的脱细胞方法，制备过程中保持角膜胶原结构和透明度，避免现有方法对角膜胶原结构和透明性的影响。
为实现上述目的，本发明在于整个脱细胞过程使用一种角膜保护剂，维持角膜的正常厚度和透明性；采用静高压技术破碎细胞，避免角膜溶胀破坏角膜基质的显微结构；脱细胞处理采用去垢剂复合核酸酶联合作用有效去除细胞核成分，最后漂洗去除脱细胞用试剂和细胞碎片；在脱细胞步骤保持合适的压力条件、去垢剂、消化酶浓度和处理时间，最终实现脱细胞处理后的角膜保持其原有的透明度和有序的角膜基质显微结构。
本发明的方法，包括如下的步骤：
1)将角膜板层置于保护液中，并置于容器中密封；
2)采用高静压处理破碎细胞；
3)将角膜取出后，置于添加了去垢剂和核酸酶的保护剂中进行震荡脱细胞处理；
4)将脱细胞后的角膜置于保护剂中漂洗2小时以上完成制备。
所述的脱细胞角膜制备用保护液，是添加有5-12g/L透明质酸、5～20g/L硫酸软骨素、3～10g/L低分子量右旋糖酐的PBS或HBSS缓冲液；
上述的脱细胞角膜保护液，其pH值调至7.2～7.4；
上述的脱细胞角膜保护液，其渗透压为300-400mOsm
作为优选，本发明的脱细胞角膜保护液中还添加有妥布霉素，其添加量优选为1-3ml/L。
进一步的，步骤2)中高静压处理破碎细胞的条件为200-600MP，时间不超过10分钟；
步骤3)中的去垢剂为十二烷基硫酸钠，浓度为0.1-0.5％，消化酶为DNase I，浓度为500-2000U/ml，
脱细胞处理的条件如下：温度20-30℃，时间2小时。
本发明的方法使用的保护液通过组分与配比的选择使制备的保护液能维持脱细胞角膜制备液体的胶体渗透压，与传统的脱细胞角膜制备液体相比，可以显著降低胶原等细胞外基质成分在后期脱细胞处理过程中过度溶胀、丢失导致的角膜透明度下降；而且添加妥布霉素等抗生素成分，抑制易感染角膜的细菌滋生，如绿脓杆菌、克雷白杆菌、肠杆菌属、变形杆菌等，避免处理过程中的污染几率。在破碎细胞的同时，避免长时间高压对角膜基质胶原破坏引起的透明度下降。其次，去垢剂和核酸酶同时作用，更快速有效地去除细胞碎片和核酸成分，避免去垢剂和其他成分长时间处理对角膜胶原等蛋白成分破坏引起的角膜透明性下降。
具体实施方式
我国及其他东南亚国家都面临着角膜供体匮乏的难题，严重影响了角膜盲患者的复明，角膜供体的来源也成为目前角膜病治疗过程中最为棘手的问题，寻找适合于人体的角膜替代物已成为当前眼科和组织工程领域研究的热点。猪角膜来源广泛，角膜厚度和屈光方面与人角膜最为接近，经脱细胞处理和病毒灭活等工艺制备的猪角膜基质材料在动物水平或临床应用中也取得了较好的治疗效果，部分解决了我国角膜供体材料严重匮乏的问题，为角膜盲患者重见光明带来希望。
申请人对已有的角膜保存液进行了组合和配比的优化，从而再使用尽可能少组分的情况下取得了更好的效果，同时采用静高压技术破碎细胞，避免角膜溶胀破坏角膜基质的显微结构；脱细胞处理采用去垢剂复合核酸酶联合作用有效去除细胞核成分，最后漂洗去除脱细胞用试剂和细胞碎片；在脱细胞步骤保持合适的压力条件、去垢剂、消化酶浓度和处理时间，最终实现脱细胞处理后的角膜保持其原有的透明度和有序的角膜基质显微结构。
下面通过实例对本发明进行具体的描述。
实施例1：脱细胞角膜制备用保护液的制备
组分1：
保护液成分为PBS缓冲液中添加8g/L透明质酸、10g/L硫酸软骨素、5g/L右旋糖苷，调整pH值为7.2，渗透压为320mOsm。
组分2：
保护液成分为PBS缓冲液中添加5g/L透明质酸、15g/L硫酸软骨素、3g/L右旋糖苷，调整pH值为7.2，渗透压为320mOsm。
组分3：
保护液成分为PBS缓冲液中添加5g/L透明质酸、13g/L硫酸软骨素、10g/L右旋糖苷，调整pH值为7.2，渗透压为340mOsm。
组分4：
保护液成分为PBS缓冲液中添加7g/L透明质酸、15g/L硫酸软骨素和10g/L右旋糖苷，调整pH值为7.2，渗透压为350mOsm。
组分5：
保护液成分为HBSS缓冲液中添加6g/L透明质酸、12g/L硫酸软骨素和10g/L右旋糖苷、3ml/L妥布霉素，调整pH值为7.2，渗透压为350mOsm。
实施例2：使用上述的保护液来制备脱细胞角膜
1)将角膜转入盛有含保护液的塑料袋中密封；
2)600MP高静压处理10分钟；
3)将角膜取出后，置于含0.1％十二烷基硫酸钠+1000U/ml DNA酶的保护液中，温度为25℃，消化2小时去除角膜中的DNA成分；
4)将角膜取出后，置于保护液中漂洗2小时以上。
其中保护液选用实施例1中的组分2的保护液。
脱细胞角膜分别采用直观观察脱细胞角膜的透明度和柔软度，使用微量测厚仪测量脱细胞角膜厚度。
经试验，使用上述保护液制备的脱细胞角膜保持与正常未脱细胞角膜相似的厚度(650±50μm VS 600±20μm)，而未使用上述保护液制备的脱细胞角膜厚度达到1000-2000μm。使用上述保护液制备的脱细胞角膜保持与正常未脱细胞角膜相似的柔软度，用显微镊夹持边缘，未见明显弯曲，而未使用上述保护液制备的脱细胞角膜明显变软，明显弯曲。此外，使用上述保护液制备的脱细胞角膜保持与正常未脱细胞角膜相似的透明度，置于打印有黑色A字纸上可见明显字母，而未使用上述保护液制备的脱细胞角膜明显变白，黑色A字不可见。
上述其它组分的保护液的使用效果与组分2的类似。
实施例3
本实施例的步骤如下：
1)将角膜转入盛有含保护剂缓冲液的塑料袋中密封；
2)400MP高静压处理8分钟；
3)将角膜取出后，置于含0.1％十二烷基磺酸钠+1000U/ml核酸酶的保护液中，设定摇床速度为100转/分钟，温度25℃，消化2小时去除角膜中的DNA成分；
4)将角膜取出后，置于含保护剂的液体中漂洗2小时以上。保护液选用实施例1的组分5的配方。
结果表明，本实施例方法进行角膜脱细胞处理快速，总体时间只需5-6小时，避免了长时间处理对角膜板层显微结构的破坏；使用本方法进行角膜脱细胞处理，整个过程角膜始终处于透明状态，未发生溶胀和变白等现象，避免了角膜溶胀导致的角膜板层胶原纤维结构破坏；使用本方法处理的脱细胞角膜仍保持与正常角膜相似的透明性、强度和韧性，且角膜板层胶原纤维结构未见明显破坏；使用本方法处理的脱细胞角膜具有良好的相容性，板层移植到兔角膜后发现术后5-7天角膜上皮生长完好。
实施例4
申请人将上述组分2中的透明质酸或硫酸软骨素替换为甘油，含量不变；制成的保护液使用在脱细胞角膜的制备中，结果发现，含甘油的保护液处理后角膜内的DNA成分未完全去除干净，有一定的残留；同时角膜硬度明显增加，失去角膜原有的柔软特性；角膜的透明度下降明显。同样，使用低分子右旋糖苷替换透明质酸或硫酸软骨素制成的保护液的效果也不如本发明的保护液。