组织修复支架的3D打印浆料、组织修复支架及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医学组织工程技术领域，具体涉及一种组织修复支架的3D打印浆料、组织修复支架及其制备方法和应用。

背景技术：

组织工程是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。三维多孔组织修复支架，是指具有大量的一定尺寸孔隙结构和较高比表面积的多功能支架，它在组织工程中起着至关重要的作用，是目前再生医学领域的一个研究热点。

目前，组织工程多孔支架的制备方法包括：颗粒烧结法、溶液浇铸/粒子沥滤法、热致相分离/冷冻干燥法、静电纺丝法、超临界流体制备法，以及新兴的3D打印技术等。为了提高组织工程支架的修复能力，通常直接将许多生长因子、趋化因子、化学药物等活性物质被加入到上述制备好的支架中或在支架的制备过程中加入，但通常会存在以下弊端：支架对活性物质的负载效率低，活性物质易失活、在支架中的稳定性差，带活性物质的支架在植入生物体后存在突释等问题。以上弊端会影响支架的后续应用。

因此，有必要提供一种能有效提高修复能力的组织修复支架。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种具有缓释活性物质的组织修复支架，以克服现有技术的组织修复支架中活性物质稳定性差、负载率低及突释等问题。

第一方面，本发明提供了一种组织修复支架的3D打印浆料，所述3D打印浆料包括含海藻酸钠的水溶液和均匀分散在所述含海藻酸钠的水溶液中的载药缓释微球，所述载药缓释微球与所述海藻酸钠的质量比为(0.01-1)：1，所述含海藻酸钠的水溶液中海藻酸钠的质量分数为15-25％。

可选地，所述含海藻酸钠的水溶液中海藻酸钠的质量分数为15.5-20％。

可选地，所述3D打印浆料中还含有聚乙烯醇，所述聚乙烯醇与所述海藻酸钠的质量比为(0.16-0.70)：1。进一步可选为(0.33-0.69)：1。

本申请中，所述载药缓释微球与所述含海藻酸钠的水溶液的质量比为(0.01-1)：6.5。

可选地，所述载药缓释微球的粒径为3-40μm，载药率为67-78％。

进一步可选地，所述载药缓释微球的粒径为5-35μm。

可选地，所述载药缓释微球由载体和所述载体所负载的药物组成，所述载体的原料为海藻酸盐、壳聚糖和明胶中的一种或多种。所述载药缓释微球可以由乳化交联法制得。

可选地，所述药物包括生长因子、庆大霉素和地塞米松中的一种或多种，但不限于此。所述生长因子包括骨形态发生蛋白、转化生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子和成纤维细胞生长因子中的一种或多种。

进一步可选地，所述骨形态发生蛋白包括BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-7和BMP-14中的一种或多种；所述转化生长因子包括TGF-α和TGF-β中的至少一种。

本发明提供的具有缓释活性物质的组织修复支架的3D打印浆料，配方中含有具有药物缓释功能的载药缓释微球和含海藻酸钠的水溶液，其配方简单、不含其他有毒辅料，成分安全。制得的3D打印浆料分散均匀、粘度合适，适合连续挤出，用于制备组织修复支架。在所述3D打印浆料制备组织修复支架中，药物可被有效负载在载药缓释微球中，其药物活性不受打印工艺的影响，通过调控海藻酸钠、聚乙烯醇以及载药缓释微球的质量比来控制支架中药物(如生长因子等)的缓释速率，使支架可以起到长效、持久的组织修复功能。与现有技术中先制成多孔支架基体后，再滴加或浸泡载药缓释微球的溶液相比，采用本申请的3D打印浆料所制成的组织修复支架中，载药缓释微球在支架中的负载效率较高，几乎不存在药物突释问题。

第二方面，本发明提供了一种具有缓释活性物质的组织修复支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用乳化交联法制备载药缓释微球；

(2)配制海藻酸钠的质量分数为15-25％的含海藻酸钠的水溶液；将上述载药缓释微球加入到上述含海藻酸钠的水溶液中，常温下搅拌均匀后，得到具有缓释活性物质的组织修复支架的3D打印浆料，其中，所述载药缓释微球与所述海藻酸钠的质量比为(0.01-1)：1；

(3)将所述3D打印浆料除泡后，按预设的3D打印参数将所述除泡后的浆料在常温下进行3D打印成型，得到固化前的组织修复支架粗品。

(4)向上述含海藻酸钠的三维支架滴加二价金属盐溶液，反应0.5-6h以进行固化成型，经洗涤、冷冻干燥后得到具有缓释活性物质的组织修复支架。

可选地，步骤(2)中，所述3D打印浆料中还含有聚乙烯醇，所述聚乙烯醇与所述海藻酸钠的质量比为(0.16-0.70)：1。进一步可选为(0.33-0.69)：1。

在本发明一实施方式中，当所述含海藻酸钠的水溶液中还加入有聚乙烯醇时，可选先将聚乙烯醇在80-100℃溶解于水配成水溶液，然后再加入海藻酸钠。

可选地，步骤(2)中，所述3D打印浆料中还含有生物陶瓷粉末，其中，所述生物陶瓷粉末包括但并不限于羟基磷灰石、磷酸八钙、磷酸钙、双相磷酸钙，以及含有Sr、B、Cu、P、Mg等元素的生物活性玻璃等。生物陶瓷粉末的添加，可以提高支架的力学性能、降解性能及促骨生长的功能。

可选地，所述载药缓释微球的粒径为3-40μm，载药率为67-78％。进一步可选地，所述载药缓释微球的粒径为5-35μm。

可选地，所述载药缓释微球由载体和所述载体所负载的药物组成，所述载体的原料为海藻酸盐、壳聚糖和明胶中的一种或多种；所述药物包括生长因子、庆大霉素和地塞米松中的一种或多种，但不限于此。可选地，所述载药缓释微球的原料为海藻酸盐、壳聚糖、明胶和葡聚糖中的一种或多种。

可选地，步骤(3)中，所述除泡处理具体为：将物料置于4℃冰箱4-6h。

可选地，步骤(4)中，所述二价金属盐溶液与海藻酸钠的物质的量之比为1:2-1:1。

步骤(4)中，所述洗涤是常用双蒸水进行洗涤2-5次。

可选地，步骤(4)中，所述二价金属盐为水溶性钙盐(氯化钙、醋酸钙、硝酸钙)、锌盐(氯化锌、硝酸锌、醋酸锌)和铜盐中的一种或多种，但不限于此。

进一步可选地，所述二价金属盐为水溶性钙盐。

本申请中，步骤(3)中，固化前的组织修复支架粗品为载药缓释微球/海藻酸钠复合支架，若所述含海藻酸钠的水溶液中还含有聚乙烯醇，则为载药缓释微球/海藻酸钠/聚乙烯醇复合支架；步骤(4)中，具有缓释活性物质的组织修复支架为载药缓释微球/海藻酸盐复合支架。若所述含海藻酸钠的水溶液中还含有聚乙烯醇，则为载药缓释微球/海藻酸盐/聚乙烯醇复合支架。其中，海藻酸盐的具体组成根据固化成型时加入的二价金属盐溶液决定，举例来说，若加入的是钙盐溶液，得到的载药缓释微球/海藻酸钙复合支架，若加入的是锌盐溶液，得到的载药缓释微球/海藻酸锌复合支架。

可选地，所述载药缓释微球为海藻酸盐载药缓释微球，具体采用如下乳化交联法制得：

(a)配制药物和海藻酸钠的混合溶液，作为水相；

(b)以Span-85及Tween-80作为混合乳化剂，将其加入到装有有机溶剂的容器中，在1000～4000rpm的转速下混合均匀，得到油相；

(c)在温度为6-10℃，以及400～950rpm的转速下，将所述水相滴加到上述油相中，滴加完后将转速调至1000～4000rpm，搅拌5-10min，制得乳化液；

(d)在400～800rpm的转速下，向上述乳化液中加入交联剂二价金属盐溶液，交联10-60min，将所得交联产物用乙醇和水交替洗涤，离心、冷冻干燥后得到海藻酸盐载药缓释微球。

本申请中，滴加水相时的转速为400～950rpm(可选为400～800rpm、600～900rpm)，加完水相，再调高转速这样可以将水相均匀地包裹在油相内，转速越高最后形成的载药缓释微球的粒径越小，本申请中加完水相后的转速调控在1000～4000rpm，可以制得粒径为1～40μm的载药缓释微球。此外，本申请中向乳化液加入交联剂是为了在二价金属离子的作用下使海藻酸钠交联固化得到载药缓释微球，加入交联剂时控制转速为400～800rpm，可以得到粒径均匀、表面致密光滑的规则球体。若加入交联剂时的转速太高，容易破坏微球的结构，转速太小则会导致微球粒径很不均匀。进一步可选地，加交联剂时控制转速为500～700rpm。更可选成600rpm。本申请中通过对油相、水相、交联剂加入前后的转速进行梯度控制，可以制得粒径均匀可控、形状规则的载药缓释微球。

可选地，所述海藻酸盐载药缓释微球的制备过程中，温度为7-9℃。温度太高，不易形成海藻酸盐载药缓释微球。

可选地，所述水相中，海藻酸钠的质量分数为1％-3％；所述药物与所述海藻酸钠的质量比为1:(900-45000)。

进一步可选地，所述水相中，所述药物与所述海藻酸钠的质量比为1:(900-9000)、1:(4500-45000)。

进一步可选地，所述药物为生长因子、庆大霉素和地塞米松中的一种和多种。

可选地，所述混合乳化剂中，Span-85与Tween-80的体积比为(5-6):1

可选地，所述有机溶剂为正戊烷、正己烷及正庚烷中的一种。

可选地，所述油相中，混合乳化剂与有机溶剂的体积比为(0.06-0.12)：1。

可选地，乳化前所述油相与水相的体积比为(8-16)：1；所述交联剂与所述水相的体积比为(0.5-1.5)：1。进一步可选地，所述交联剂与所述水相的体积比为(0.5-1.33)：1。

可选地，步骤(d)中，所述二价金属盐为水溶性钙盐(氯化钙、醋酸钙、硝酸钙)、锌盐(氯化锌、硝酸锌、醋酸锌)和铜盐中的一种或多种，但不限于此。所述海藻酸盐载药缓释微球的载体组成，依据所加入的二价金属盐的种类来决定，当采用钙盐作为交联剂时，所得的是海藻酸盐载药缓释微球，而当采用锌盐作为交联剂时，所得的是海藻酸锌载药缓释微球，也可以不进行区分，统称为海藻酸钠载药缓释微球。

可选地，步骤(d)中，所述二价金属盐与所述水相中海藻酸钠单体((C₆H₇NaO₆)_x)的物质的量比为(2～20):1。进一步可选为(5-18)：1、或(10-16):1。在本发明一实施方式中，为17.3:1。

可选地，步骤(d)中，所述交联时间为10-30min。

本发明第二方面提供的制备方法，操作简单，在组织修复支架的3D浆料制备过程中，将载药缓释微球与含海藻酸钠的水溶液直接混合，得到所述3D打印浆料，然后将所述3D打印浆料打印成组织修复支架粗品，在二价金属盐的作用下，可以实现载药缓释微球与含海藻盐的多孔支架的基体原料一起固化成型而使载药缓释微球弥散分布在基体中，可以得到载药缓释微球负载效率较高的具有缓释活性物质的组织修复支架。与现有技术中先制成支架基体后再滴加或浸泡载药缓释微球悬浮液相比，本申请采用3D常态打印方法所制得的具有缓释活性物质的组织修复支架，载药缓释微球在支架中的负载量较大且载药缓释微球中所负载的药物的功能活性不受打印工艺的影响，既能保持其药物活性又可实现缓释药物(如生长因子等)的功能，起到长效、持久的组织修复功能。

第三方面，本发明提供了一种由本发明第二方面所述的方法制得的具有缓释活性物质的组织修复支架，包括含海藻盐的多孔支架基体及分布在所述含海藻盐的多孔支架基体中的载药缓释微球，所述含海藻盐的多孔支架基体与所述载药缓释微球为一体成型结构；所述载药缓释微球的质量占所述组织修复支架质量的0.97-10％。

进一步地，所述载药缓释微球在所述含海藻盐的多孔支架基体成型过程中与基体原料混匀而均匀弥散分布在基体中。

可选地，所述含海藻盐的多孔支架中还含有聚乙烯醇，所述聚乙烯醇与所述海藻酸钠的质量比为(0.16-0.70)：1。进一步可选为(0.33-0.69)：1。聚乙烯醇与海藻酸钙均匀混合在一起。

可选地，所述聚乙烯醇占所述组织修复支架质量的5.6-22.2％。进一步可选为10.6-22.0％。进一步可选为15-20％。

可选地，所述载药缓释微球占所述组织修复支架质量的2-10％。进一步可选为1.5-8％、3-8％、5-9％、6-10％、6-8％、8-10％。由于本申请中是在组织修复支架的3D打印浆料制备过程中，就加入载药缓释微球，可使得最终成型的支架中载药缓释微球的负载率较高。

3D打印技术可以对支架的孔径大小、孔隙率等进行调控，制得期望的具有缓释活性物质的组织修复支架，本发明实施例中，所述具有缓释活性物质的组织修复支架为规则的几何体(如长方体、正方体、圆柱体等，但不限于此)以及其他不规则的三维多孔结构体。可选为规则几何体。

可选地，所述具有缓释活性物质的组织修复支架的孔隙率为65.5-70.6％。

可选地，所述具有缓释活性物质的组织修复支架还包括孔径为50-800μm的孔洞。进一步可选地，孔径为110-190μm、或600-800μm。

第四方面，本发明提供了如本发明第一方面所述的3D打印浆料或如本发明第三方面所述的具有缓释活性物质的组织修复支架在药物控释载体和制备组织工程支架中的应用。

本发明实施例的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的载BMP-2的海藻酸钠载药缓释微球的形貌和粒径分布图；

图2是本发明实施例提供的载BMP-2的三维海藻酸钙复合支架的形貌图；

图3是本发明实施例提供的载BMP-2的三维海藻酸钙复合支架的药物缓释曲线。

图4是对比实施例中载BMP-2的海藻酸钠载药缓释微球的形貌图。

具体实施方式

以下所述是本发明实施例的可选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

若无特别说明，本发明实施例所采用的试剂皆为市售商品。

实施例1制备载BMP-2的海藻酸钠载药缓释微球

(1)制备水相：配制1.5％(质量体积浓度，g/mL)的海藻酸钠溶液30mL，向其中加入50μg的BMP-2，磁力搅拌使其混合均匀，得到水相；(2)将80mL正戊烷置于一个三口瓶中，在9℃下，600rpm条件下，加入4mL Span-85和0.8mLTween-80作为混合乳化剂，之后将转速调到1280rpm，搅拌1min使其混合均匀，得到油相；(3)再将转速调低至600rpm，逐滴加入6mL的上述水相，之后再将转速调高到1280rpm，搅拌5min，得到乳化液；(4)然后把转速调到600rpm，向所述乳化液中再加入8mL、质量体积浓度为10％(g/mL)的CaCl₂溶液作交联剂，固化交联15min；将所得交联产物转移至离心管中，在3000rpm下离心分离3min，再分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤3次，之后冷冻干燥24h，得到载BMP-2的海藻酸钠载药缓释微球，并保存备用。

所得载BMP-2海藻酸钠微球的形貌和粒径分布如图1所示，该载药缓释微球表面致密光滑，为规则球形，其粒径分布范围为3.9～34.3μm，平均粒径为12.5μm。

实施例2制备载地塞米松的海藻酸钠载药缓释微球

(1)制备水相：配制1.5％(质量体积浓度，g/mL)的海藻酸钠溶液30mL，向其中加入10μg的地塞米松，磁力搅拌使其混合均匀，得到水相；(2)将80mL正戊烷置于一个三颈瓶中，在7℃下，800rpm条件下，加入4.8mL Span-85和0.8mL Tween-80作为混合乳化剂，之后将转速调到1000rpm，搅拌1min使其混合均匀，得到油相；(3)再将转速调低至700rpm，逐滴加入6mL的上述水相，之后再将转速调高到1000rpm，搅拌10min，得到乳化液；(4)然后把转速调到700rpm，向所述乳化液中再加入3mL、10％(质量体积浓度，g/mL)的Zn(NO₃)₂)溶液作交联剂，固化交联20min；将所得交联产物转移至离心管中，在3000rpm下离心分离3min，再分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤3次，之后冷冻干燥24h，得到载地塞米松的海藻酸钠载药缓释微球，并保存备用。

实施例3制备载庆大霉素的海藻酸钠载药缓释微球

(1)制备水相：配制1.5％(质量体积浓度，g/mL)的海藻酸钠溶液30mL，向其中加入100μg的庆大霉素，磁力搅拌使其混合均匀，得到水相；(2)将40mL正戊烷置于一个三颈瓶中，在8℃下，700rpm条件下，加入4mL Span-85和0.8mL Tween-80作为混合乳化剂，之后将转速调到4000rpm，搅拌1min使其混合均匀，得到油相；(3)再将转速调低至500rpm，逐滴加入2.8mL的上述水相，之后再将转速调高到4000rpm，搅拌10min，得到乳化液；(4)然后把转速调到500rpm，向所述乳化液中再加入2.8mL、质量体积浓度为10％(g/mL)的Cu(NO₃)₂)溶液作交联剂，固化交联30min；将所得交联产物转移至离心管中，在3000rpm下离心分离3min，再分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤3次，之后冷冻干燥24h，得到载地塞米松的海藻酸钠载药缓释微球，并保存备用。

实施例4不同PVA含量的载BMP-2的三维海藻酸钙复合支架的制备

(1)取1g海藻酸钠分别溶于5.5mL的蒸馏水中、5.5mL的PVA溶液(6％，w/v)中和5.5mL的PVA溶液(12.5％，w/v)中，分别得到3组含海藻酸钠的水溶液，即，PVA含量分别为0％，6％，12.5％(质量体积浓度，g/mL)的含海藻酸钠的水溶液中，被标记为0％，6％，12.5％组；

(2)另取0.0373g的实施1制得的载BMP-2的海藻酸钠载药缓释微球分散到上述各组水溶液中，混合均匀后，得到3组3D打印浆料；

(3)设置打印参数：支架的边长为5mm，行间距为1.11mm，层高0.3mm，层数为3层，打印速率15mm.s^-1，打印压力为400-500kPa。然后，采用三维打印机(德国Gesim公司生产的Bioscaffolder 2.1打印机)常温下打印以上3组3D打印浆料，得到载BMP-2的三维海藻酸钠复合支架。

(4)向上述载BMP-2的三维海藻酸钠复合支架中滴加1mL、1mol/L的CaCl₂溶液，反应2h进行固化成型，并用双蒸馏水洗涤3次、冷冻干燥后得到载BMP-2的三维海藻酸钙复合支架，即具有缓释活性物质的组织修复支架。

其中，将PVA含量分别为6％(质量体积浓度，g/mL)的含海藻酸钠的水溶液中，与上述载药缓释微球进行混合，最终制得载BMP-2的三维海藻酸钙复合支架的形貌如图2所示。图2为三维扫描显微镜拍的载BMP-2的三维海藻酸钙复合支架的形貌，从图2中可以看出，该复合支架呈三维结构，因混入载BMP-2载药缓释微球，支架的每根线条变得不平整。

实施例5载BMP-2的三维海藻酸钙复合支架的缓释曲线

将上述3组PVA含量分别为0％，6％，12.5％的载BMP-2的三维海藻酸钙复合支架(PVA/BMP-2/SA微球复合支架)，被标记为0％，6％，12.5％组，每组设置6个平行样，将各组支架置于10mL离心管内，之后加入2mL PBS溶液。将离心管置于37℃，100rpm的摇床上做药物释放实验。预设的时间点为1h、3h、5h、10h、1d、3d、5d、7d，每次取500μL缓释液于3mL离心管中，补充500μL新的PBS溶液，每次取样结束后标记好时间点，将缓释液置于-20℃保存。

缓释到14d时，取出离心管超声15min打碎支架后，离心取上清液500μL置于3mL离心管中，做好标记。将所有缓释样品恢复至室温。配置BMP-2标准溶液浓度，采用BMP-2试剂盒测定所有样品及BMP-2标准溶液的吸光度值，绘制标准曲线，通过标准曲线计算所有缓释样品中BMP-2的浓度，再计算各时间点释放的BMP-2的质量，然后计算复合支架中含的BMP-2的总量，最后计算各时间释放率并绘图，结果如图3所示。

将PVA含量分别为0％，6％，12.5％(质量体积浓度，g/mL)的含海藻酸钠的水溶液与同样的载药缓释微球进行混合，最终制得载BMP-2的三维海藻酸钙复合支架。由图3可以看出，以上制备的3组载BMP-2的三维海藻酸钙复合支架均可实现控释BMP-2的功能。其药物缓释性能略有差别，在一定程度内，复合支架中PVA含量越多，BMP-2的缓释速率越快，因此可以在一定条件下通过调整复合支架中PVA的量来控制所述载BMP-2的三维海藻酸钙复合支架BMP-2的释放速率。

为突出本发明中载药缓释微球的制备方法，还针对实施例1提供了以下2个对比实施例。

对比实施例1：(1)制备水相：配制1.5％(质量体积浓度，g/mL)的海藻酸钠溶液30mL，向其中加入50μg BMP-2，磁力搅拌使其混合均匀，得到水相；(2)在9℃下，600rpm条件下，将80mL正戊烷置于一个三口瓶中，加入4mL Span-85和0.8mL Tween-80作为混合乳化剂，搅拌1min使其混合均匀，得到油相；(3)在9℃下，600rpm条件下，逐滴加入6mL的上述水相，搅拌5min，得到乳化液；(4)在9℃下，600rpm条件下，向所述乳化液中再加入8mL、质量体积浓度为10％(g/mL)的CaCl₂溶液，固化交联15min；将所得交联产物转移至离心管中，在3000rpm下离心分离3min，再分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤3次，之后冷冻干燥24h，得到载BMP-2的海藻酸钠载药缓释微球，其扫描电镜如图4中(A)所示。

对比实施例2：(1)制备水相：配制1.5％(质量体积浓度，g/mL)的海藻酸钠溶液30mL，向其中加入50μg BMP-2，磁力搅拌使其混合均匀，得到水相；(2)将80mL正戊烷置于一个三口瓶中，在25℃下，600rpm条件下，加入4mLSpan-85和0.8mL Tween-80作为混合乳化剂，之后将转速调到1280rpm，搅拌1min使其混合均匀，得到油相；(3)在25℃下，再将转速调低至600rpm，逐滴加入6mL的上述水相，之后再将转速调高到1280rpm，搅拌5min，得到乳化液；(4)在25℃下，然后把转速调到600rpm，向所述乳化液中再加入8mL、质量体积浓度为10％(g/mL)的CaCl₂溶液，固化交联15min；将所得交联产物转移至离心管中，在3000rpm下离心分离3min，再分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤3次，之后冷冻干燥24h，得到载BMP-2的海藻酸钠载药缓释微球，其扫面电镜如图4中(B)所示。

对比实施例3：(1)制备水相：配制1.5％(质量体积浓度，g/mL)的海藻酸钠溶液30mL，向其中加入50μg的BMP-2，磁力搅拌使其混合均匀，得到水相；(2)将80mL正戊烷置于一个三口瓶中，在9℃下，3000rpm条件下，加入4mLSpan-85和0.8mL Tween-80作为混合乳化剂，搅拌1min使其混合均匀，得到油相；(3)在3000rpm转速下，逐滴加入6mL的上述水相，之后再搅拌5min，得到乳化液；(4)在3000rpm转速下，向所述乳化液中再加入8mL、质量体积浓度为10％(g/mL)的CaCl₂溶液，固化交联15min；将所得交联产物转移至离心管中，在3000rpm下离心分离3min，发现离心几乎得不到任何海藻酸钠载药缓释微球，可能是加入固化剂时搅拌速度太高，形成不了微球，这里就不再提供其电镜照片。

从图4中(A)可以看出，由于在加完混合乳化剂后未将转速调高、在向油相中加入低速水相后未调高转速(即在微球制备过程中未设置梯度转速)，结果导致形成的载药缓释微球的粒径不均一度较高。从图4中(B)可以看出，在载药缓释微球制备时温度较高(25℃)导致最终几乎不形成载药缓释微球，即对比例2的成球率较低。

对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。