一种具有抗菌效应的种植基台及其制备方法与流程

本发明属于牙科材料制备技术领域，具体涉及一种具有抗菌效应的种植体基台及其制备方法。

背景技术：

牙列缺损缺失是常见病和多发病，据统计，在我国35～44岁的人群中，缺牙患者占36.4％；65～74岁人群中占77.89％。种植义齿因其不损伤邻牙、功能好、寿命长、美观舒适等优点，已逐渐成为缺牙修复的首选方案。种植时，基台穿龈部位直接暴露于口腔有菌环境，基台周围软组织结合的形成与维持会一直受到细菌的侵袭和干扰，一旦软组织封闭形成初期遭遇细菌侵袭或者软组织结合形成后被破坏会导致种植体周围炎。文献显示：种植体周围炎的发病率为56％。种植体周围炎目前没有有效的治疗方案，最终会导致种植体失败。

目前，临床最常用的牙科种植体基台通常是光滑的，研究表明这种结构周围主要形成机械扣锁封闭，容易形成纤维包囊，软组织与种植体结合界面难以形成良好的生物封闭，并难以长期抵御细菌侵袭。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种具有抗菌效应的种植体基台及其制备方法，该方法操作简单，实用性强，通过该方法制得的种植体基台能够达到有效抑制细菌粘附和侵袭的目的。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种具有抗菌效应的种植体基台的制备方法，包括以下步骤：

1)采用微弧氧化(MAO)法，在纯钛种植体基台表面制备具有微米结构的多孔涂层；

2)采用溶胶凝胶法，制备庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒；

3)采用明胶交联法，将步骤2)制得的庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒在明胶溶液中均匀分散，然后滴加至步骤1)制得的具有微米结构的多孔涂层的纯钛种植体基台表面，发生交联反应，制得具有长期抗菌效应的种植体基台。

步骤1)中，微弧氧化法的具体操作条件为：

阳极为纯钛片，阴极为不锈钢锅；电解质溶液由0.04mol/L的β-甘油磷酸二钠盐五水及0.2mol/L乙酸钙的去离子水溶液组成；电源电压为300V，频率为600Hz，占空比为8％，处理时间为5min。

步骤1)中，所用的纯钛种植体基台在微弧氧化处理之前，将其表面打磨抛光后，依次用丙酮、无水乙醇及去离子水超声清洗20min，干燥后备用。

步骤2)中，采用溶胶凝胶法，制备庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒，具体操作为：

将盐酸庆大霉素溶解于质量分数为25％的氨水中，充分混匀后滴加于无水乙醇中，然后再向反应体系中加入正硅酸乙酯，充分搅拌反应24h，将反应产物反复离心、洗涤处理，真空冷冻干燥后，制得庆大霉素－二氧化硅纳米颗粒。

盐酸庆大霉素、质量分数为25％的氨水、无水乙醇及正硅酸乙酯的用量比为：(15～25)mg：(3～5)ml：(65～80)ml：(180～220)μL。

步骤3)具体操作，包括以下步骤：

(1)将步骤2)制备的庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒加入质量分数为0.1％的明胶溶液中，采用细胞破碎仪超声处理20min；

(2)将步骤(1)制得的液体滴加至具有微米结构的多孔涂层的纯钛种植体基台表面，漩涡振荡器上振荡30min，4℃干燥过夜；

(3)将经步骤(2)处理的种植体基台浸泡在质量分数为1％～3％的戊二醛溶液中发生交联反应，再用无水乙醇清洗数次，在种植体基台表面制得复合缓释涂层，即得到具有抗菌效应的种植体基台。

步骤(1)中，庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒与质量分数为0.1％的明胶溶液的用量比为(1.5～3)mg：(1～2)ml。

本发明还公开了采用上述的方法制得的具有抗菌效应的种植体基台，该种植体基台外表面具有微米形貌的微弧氧化涂层，且该微弧氧化涂层交联有庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的具有抗菌效应的种植体基台及其制备方法，首先采用微弧氧化法，在纯钛种植体基台表面制备具有微米结构的微弧氧化涂层；然后，采用溶胶凝胶法制备庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒；最后，利用明胶交联法，将庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒复合在微弧氧化涂层上，形成微纳米二级结构，建立复合缓释涂层，长期缓释庆大霉素，可以有效抑制细菌的粘附和侵袭，降低种植体周围炎的发病率并降低口腔种植的失败率。

经本发明方法制得的具有抗菌效应的种植体基台，其表面涂层可长期缓释庆大霉素，实现有效抑制细菌粘附和侵袭的目的。涂层体外缓释实验证实，庆大霉素可缓释数十天，抗菌实验证实细菌的粘附和繁殖得到明显抑制，且对细胞没有毒性，这将有利于种植体周围软组织封闭的形成与维持。

附图说明

图1为种植体基台微弧氧化处理后的扫描电镜图像；

图2为庆大霉素－二氧化硅纳米颗粒的透射电镜图像；

图3为牙科种植体基台抗菌涂层的扫描电镜图像；

图4为种植体基台接种细菌24h后的菌落计数统计图；

图5为牙科种植体基台接种细菌后的激光共聚焦图，其中，a、b、c分别为光滑组、微弧氧化组和抗菌涂层组种植体基台；

图6为种植体基台接种细胞后的扫描电镜图像；

图7为本发明的种植体基台释放庆大霉素的缓释曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明公开的具有抗菌效应的种植体基台的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备微弧氧化涂层

①选用纯钛种植体基台，将其表面用碳化硅砂纸打磨抛光后，依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗20分钟后，干燥后备用；

②采用微弧氧化技术在种植体基台表面制备具有微米结构的多孔涂层。

微弧氧化具体方法：

微弧氧化电解质溶液由0.04mol/L的β-甘油磷酸二钠盐五水、0.2mol/L的乙酸钙的去离子水溶液组成，电源电压为300V，频率为600Hz，占空比8％，处理时间5分钟，阳极为纯钛片，阴极为不锈钢锅。试件依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗10分钟，干燥后备用。制得的具有微米结构的多孔涂层的纯钛种植体基台表面，扫描电镜图像如图1所示。

(2)制备庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒

溶胶凝胶法制备庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒。

具体方法如下：

①取15～20mg盐酸庆大霉素溶解在3～5ml的25％氨水中；

②将上述液体滴加至65～80ml无水乙醇，然后在其中缓慢加入180～220μL正硅酸乙酯；磁力搅拌下反应24小时；

③将产物反复离心洗涤，真空冷冻干燥后得到白色粉末即为庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒。透射电镜图像参见图2，从图中可以看出，庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒较均匀，粒径约为30～50nm。

(3)制备复合缓释涂层

明胶交联法制备复合缓释涂层。

具体方法:

①取1.5～3mg步骤(2)制得的庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒，加入至1～2ml0.1％明胶溶液中，细胞破碎仪超声处理20分钟，使其在明胶溶液中分散均匀；

②吸取200μL上述液体滴至步骤2制备的基台表面，漩涡振荡器上振荡30分钟；4度干燥过夜；

③将其浸泡在1％～3％戊二醛溶液中30分钟使明胶发生交联反应，无水乙醇清洗3次。

参见图3，为种植体基台抗菌涂层的扫描电镜图像，从图中可以看出，庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒较均匀的交联到了MAO表面。

实验方法：

1、菌落计数

具体步骤如下：

(1)用营养肉汤培养基将金黄色葡萄球菌稀释为浓度10⁶CFU/ML。

(2)各组基台与1ml上述细菌悬液共培养24h。

(3)将黏附在基台上的细菌超声振荡至PBS溶液内。

(4)将步骤(3)中的细菌PBS悬液稀释100倍后涂板。

进行菌落计数，结果参见图4，从图中可见，与传统的光滑种植体基台和微弧氧化基台相比，本发明的种植体基台表面菌落明显减少。

2、灭菌实验

具体步骤如下：

(1)用营养肉汤培养基将金黄色葡萄球菌稀释为浓度10⁶CFU/ml。

(2)各组基台与1ml上述细菌悬液共培养24h。

(3)用PBS和去离子水分别漂洗基台表面以去除未黏附的细菌。

(4)在其表面滴加死菌/活菌荧光染色剂使细菌着色。

置于激光共聚焦显微镜下观察拍照。结果参见图5，其中a、b、c分别为光滑组、微弧氧化组和本发明的抗菌涂层组种植体基台，显微镜下绿色为活菌，红色为死菌。与光滑组和微弧氧化组基台相比，本发明的种植体基台表面基本无活菌，绝大部分为红色的死菌，表明本发明的种植体基台可有效杀灭细菌。

3、接种细胞实验

具体步骤如下：

(1)细胞接种及培养

(i)制备细胞悬液：成纤维细胞铺满瓶底约80％时，于室温条件用0.25％胰蛋白酶消化离心稀释后，制备成5000/ml悬液。

(ii)将抗菌种植体基台安放48孔板，然后将细胞接种于材料表面，细胞的接种浓度为1500/孔。

(iii)加入DMEM细胞培养液在37℃下继续培养24小时。

(2)细胞固定脱水：

(i)将达到培养时间的孔板中的培养液去除，用PBS将未粘附的细胞漂洗洗干净。

(ii)将抗菌种植体基台置于2.5％戊二醛溶液中4℃过夜固定。

(iii)30％～100％乙醇溶液梯度脱水，干燥喷金后电镜观测。

实验结果参见图6，从图中可以看出，基台表面细胞生长状况良好，说明本发明的种植体基台对细胞生长无影响，具有较好的生物相容性。

4、缓释实验

具体步骤如下：

(1)将抗菌种植体基台置于分子量为100kDa的透析袋内。

(2)把透析袋浸没在50ml PBS溶液中。

(3)密封后置于振荡培养箱中恒速振荡。

(4)在预定的时间点从袋外缓冲液中取样1ml，并立即补加等量PBS。

(5)用ELISA试剂盒测定相应时间点的药物浓度，并绘制曲线。

结果如图7所示，从图7中可以看出，本发明的抗菌种植体基台可有效释放庆大霉素60天，且初期突释不明显。

综上所述，本发明制备的种植体基台为具有微米结构的微弧氧化涂层，先制备庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒；然后利用明胶交联法，将庆大霉素-二氧化硅纳米颗粒复合在微弧氧化涂层上，形成微纳米二级结构，建立复合缓释涂层，长期缓释庆大霉素，可以有效抑制细菌的粘附和侵袭，促进软组织封闭的形成，降低种植体周围炎的发病率并降低口腔种植的失败率。