基因修饰的免疫效应细胞和用于扩增免疫效应细胞的工程化细胞的制作方法

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背景

1.发明领域

本文描述的是嵌合抗原受体(car)、表达car的免疫效应细胞以及制备和使用car和cart细胞的方法。还提供了具有增强的治疗性质的免疫效应细胞组合物和抗原呈递细胞。

2.相关领域的描述

临床级t细胞的效力可通过将基因疗法与免疫疗法组合以工程化生物制品来提高，所述生物制品具有(i)肿瘤相关抗原(taa)的识别，(ii)输注后的持久性，(iii)迁移到肿瘤部位的潜力以及(iv)在肿瘤微环境内循环效应子功能的能力的优良潜能。t细胞的此类基因工程可用于重定向细胞的特异性并提供具有抗原靶向的细胞毒性活性的治疗组合物。已经显示这些工程化的t细胞组合物对例如癌症患者的治疗干预是有效的(jena等，2010；till等，2008；porter等，2011；brentjens等，2011；cooper和bollard，2012；kalos等，2011；kochenderfer等，2010；kochenderfer等，2012；brentjens等，2013)。然而，仍然需要允许控制体内持久性的改进的t细胞和car构建体。

发明概述

在第一实施方案中，提供了包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(car)多肽。在一些方面，铰链结构域包含结与fc受体诸如fcγr2a或fcγr1a结合的序列。例如，铰链序列可以包含与fc受体结合的来自人免疫球蛋白(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igm、igd或ige)的fc结构域。在某些方面，铰链结构域(和/或car)不包含野生型人igg4ch2和ch3序列。

在另外的方面，实施方案的car的铰链结构域可包含表现出减少的与fc受体(诸如fcγr2a和/或fcγr1afc受体)结合或基本上无与所述受体结合的序列。在一些方面，铰链结构域包含(i)具有与seqidno：1(突变型igg4-fc序列)相同的至少8个连续氨基酸的人igg4-fc序列，所述序列相对全长野生型igg4-fc具有减少的fc受体结合；或(ii)人cd8a细胞外序列。

在一些方面，铰链结构域可包含具有与seqidno：1(突变型igg4-fc序列)相同的至少8个连续氨基酸的人igg4-fc序列，所述序列具有相对于全长野生型igg4-fc减少的fc受体结合。在一些方面，铰链结构域可包含与seqidno：3(12个氨基酸的间隔子)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个方面，铰链结构域可包含与seqidno：3(12个氨基酸的间隔子)相同的序列。在另外的方面，铰链结构域可包含相对于seqidno：3具有不超过1、2或3个氨基酸缺失或取代的序列。

在某些方面，铰链结构域可包含igg4-fc序列，所述序列相对于野生型igg4-fc包含至少一个突变，其降低fc-受体结合。在一些方面，igg4-fc序列可与seqidno：1具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些方面，igg4-fc序列相对于野生型序列可包含l235e或n297q突变。在某些方面，igg4-fc序列相对于野生型序列可包含l235e和n297q突变。在一个方面，igg4-fc序列可与seqidno：1相同，或相对于seqidno：1可包含不超过1个、2个或3个氨基酸缺失或取代。在另一方面，igg4-fc序列i与seqidno：1相同。

在一些方面，铰链结构域可包含cd8a细胞外序列。例如，铰链结构域可包含与seqidno：2的细胞外部分具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在另外的方面，car多肽可包含与seqidno：2的细胞外部分相同的序列，或相对于seqidno：2的细胞外部分可包含不超过1个、2个或3个氨基酸缺失或取代。在另外的方面，car多肽的铰链结构域包含与seqidno：20具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在另外的方面，car多肽可以包含与seqidno：20相同的序列，或者相对于seqidno：20可包含不超过1个、2个或3个氨基酸缺失或取代。

在一些方面，跨膜结构域可包含cd8a跨膜结构域。在某些方面，car多肽可包含与seqidno：2的跨膜部分具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个方面，car多肽可包含与seqidno：2的跨膜部分相同的序列，或相对于seqidno：2的跨膜部分可包含不超过1个、2个或3个氨基酸缺失或取代。在某些方面，跨膜结构域可包含cd28、cd8a或cd137的跨膜结构域。在另外的方面，跨膜结构域可包含与seqidno：19具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的cd8a跨膜结构域。在另外的方面，car多肽可包含与seqidno：19相同的跨膜序列，或相对于seqidno：19可包含不超过1个、2个或3个氨基酸缺失或取代。

在一些方面，细胞内细胞信号传导结构域可包含来自cd3ζ的结构域。例如，实施方案的car多肽可包含与seqidno：13具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的cd3ζ序列。在另外的方面，car多肽可包含与seqidno：13相同的cd3ζ序列，或相对于seqidno：13可包含不超过1个、2个或3个氨基酸缺失或取代。另外的方面，细胞内细胞信号传导结构域可包括来自cd28或cd137(4-1bb)的细胞内结构域。例如，car可包含细胞内细胞信号传导结构域，其包含与seqidno：15或seqidno：17具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在另外的方面，car多肽可包含细胞内细胞信号传导结构域，其包含与seqidno：15或seqidno：17相同的序列，或相对于seqidno：15或17可包含不超过1个、2个或3个氨基酸缺失或取代。

在各个方面，实施方案的car的抗原结合结构域可包含scfv或抗体的重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)。在另外的方面，抗原结合结构域可包含第一scfv结构域和第二scfv结构域，其中所述第一或第二scfv结构域之一与第一抗原结合，并且另一结构域结合第二抗原。在一些方面，vl结构域可以相对于vh结构域位于n末端。在某些方面，vh结构域可以相对于vl结构域位于n末端。在某些方面，car多肽还可在轻链可变结构域与重链可变结构域之间和/或第一与第二scfv结构域之间包含接头序列。在一些方面，接头序列可以是whitlow接头(seqidno：7)。

在各个方面，抗原结合结构域可结合感染性疾病抗原或癌细胞抗原。癌细胞抗原的实例包括cd19、cd20、ror1、cd22癌胚抗原、甲胎蛋白、ca-125、5t4、muc-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑素瘤相关抗原、突变p53、突变ras、her2/neu、叶酸结合蛋白、hiv-1包膜糖蛋白gp120、hiv-1包膜糖蛋白gp41、gd2、cd123、cd33、cd138、cd23、cd30、cd56、c-met、间皮素、gd3、herv-k、il-11rα、κ链、λ链、cspg4、erbb2、egfrviii、vegfr2、组合的her2-her3、组合的her1-her2或组合的her1-her3。在一些方面，癌细胞抗原可以是cd19，car可以是cd19靶向的car。

在另一个实施方案中，提供了编码根据实施方案的car多肽的核酸分子。在一些方面，编码car的序列侧接转座子重复序列或病毒ltr。

在另外的实施方案中，提供了包含根据实施方案的car多肽或核酸的分离的免疫效应细胞(例如，t细胞、nk细胞或nkt细胞)。在一些方面，细胞是t细胞或t细胞祖细胞。在另外的方面，细胞是人细胞。在某些方面，细胞组合物可包含低至100个或1,000个细胞。然而，在一些方面，细胞组合物包含至少约10⁴个、10⁵、10⁶个、10⁷个、10⁸个｀10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个或更多个表达car的免疫效应细胞。在一些方面，细胞可具有基本相同的遗传物质。在另外的方面，细胞可以是来源于可以是供体或患者的单个受试者的人类细胞。另一个实施方案提供了药物组合物，其在药学上可接受的载体中包含根据实施方案的表达car的细胞群。

在另外的实施方案中，提供了治疗受试者(例如，患有癌症或感染性疾病的受试者)的方法，所述方法包括施用有效量的表达根据实施方案的car多肽的免疫效应细胞。在某些方面，受试者可能患有癌症。在某些方面，癌症可以是血液癌症或实体癌，诸如t细胞all、b-all、cml、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、脑肿瘤或胰腺癌。在一些方面，患者可能已经经历了先前的抗癌疗法。在一些方面，患者可能处于缓解状态。在另一方面，患者可能没有癌症的症状，但包含可检测的癌细胞。另一方面，受试者可能具有病毒感染(例如，巨细胞病毒(cmv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)或人免疫缺陷病毒(hiv))。在另一个方面，受试者可具有细菌感染。在一个方面，所述疾病可以是败血症。

在某些方面，治疗受试者的方法包括施用表达car的免疫效应细胞(例如t细胞)，所述car包含具有结合人fc受体的多肽序列的铰链结构域。在一些方面，向例如患病组织的部位局部施用此类免疫效应细胞。在某些方面，局部递送部位具有减少数目(或基本上没有)的表达fc受体的细胞。例如，施用部位可存在于受试者的中枢神经系统(例如，脑)、眼或睾丸中。

在一些方面，car多肽可包含结合癌细胞抗原的抗原结合结构域。在某些方面，癌症可以是乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌或胰腺癌。在另外的方面，癌症表达被car的抗原结合结构域结合的癌细胞抗原。在另外的方面，受试者已被鉴定为具有表达car多肽所结合的癌细胞抗原的癌症。在另外的方面，先前从受试者分离了免疫效应细胞(例如，t细胞)。

在一些另外的方面，免疫效应细胞(例如，t细胞)可与患者同种异体。在各方面，同种异体细胞可以与或可以不与患者共享hla。另一个方面，免疫效应细胞对于患者可以是自体的。

在另一个实施方案中，提供了一种方法，其包括获得包含免疫效应细胞或其祖细胞(例如，t细胞或t细胞祖细胞)的细胞样品，用编码根据实施方案的car多肽的dna转染细胞，提供转基因表达car的细胞，以及在选择性增强表达car的免疫效应细胞(例如，表达car的t细胞)的增殖的培养基中离体培养转基因car细胞群。在一些方面，所述方法还包括用转座子侧连的car和转座酶转染细胞，所述转座酶有效地将编码car的dna整合入细胞的基因组中。在另外的方面，方法包括在转染前纯化或富集样品中的t细胞。在一些情况下，免疫效应细胞(例如，t细胞或t细胞祖细胞)来源于诱导的多能干细胞或胚胎干细胞。在另外的方面，富集样品中的细胞包括收集单核细胞级分。在一些情况下，细胞样品可以来自受试者的脐带血、淋巴器官或外周血样品。在一些情况下，可以通过单采或静脉穿刺获得细胞样品。在另外的方面，细胞样品是免疫细胞的亚群，诸如t细胞的亚群。在一些方面，将转基因car细胞灭活以用于表达内源t细胞受体和/或内源hla。在另外的方面，获得细胞样品包括从第三方获得细胞。

在一些方面，转染方法(例如，car构建体的转染方法)包括将编码car的dna电穿孔至细胞(例如，t细胞)中。在另外的方面，可使用病毒载体将car构建体转导入细胞。在一些方面，转染可以不涉及用病毒感染或转导细胞。在另外的方面，用编码膜结合的cγ细胞因子的核酸另外转染细胞。在一些情况下，膜结合的cγ细胞因子可以是膜结合的il-7、il-15或il-21。在具体方面，膜结合的cγ细胞因子是il-15-il-15rα融合蛋白(例如，诸如seqidno：4的mil-15多肽)。

在另外的方面，编码car的dna是质粒。在另外的方面，car可由引入细胞的rna编码。在某些方面，转座酶可以作为dna表达载体、mrna、多肽或可表达的rna来提供。在具体方面，转座酶是鲑鱼型tc1样转座酶(sb)。在另外的具体方面，转座酶是sb11或sb100x转座酶。

在实施方案的另外的方面，按照本文详述的方法培养转基因car细胞，包括在树突状细胞存在的情况下培养转基因car细胞，或者激活和繁殖刺激表达car的免疫效应细胞的扩增的细胞(aapc)。在另外的方面，aapc包含在aapc表面上表达的car结合抗体或其片段。在一些情况下，aapc可包含激活或共刺激t细胞的另外分子。在一些情况下，所述另外分子可包含膜结合的cγ细胞因子。在另外的方面，灭活或辐照aapc，或已测试其感染性物质并确认其不含感染性物质。在另外的方面，在aapc存在的情况下培养转基因car细胞包括在包含可溶性细胞因子诸如il-21和/或il-2的培养基中培养转基因car细胞。可以以约10∶1至约1∶10、约3∶1至约1∶5、约1∶1至约1∶3(免疫效应细胞cfaapc)或可来源于其中的任何范围的比例培养所述细胞。例如，t细胞和aapc的共培养物可以是约1∶1、约1∶2或约1∶3的比例。

在另外的方面，培养转基因car细胞群不超过7天、14天、21天、28天、35天或42天。在一些情况下，不在aapc存在的情况下离体培养转基因细胞。在一些具体情况下，实施方案的方法还包括在转染和/或培养步骤后富集表达car的免疫效应细胞(例如，t细胞)的细胞群。富集可包括荧光激活细胞分选(facs)和对表达car的细胞的分选。在另外的方面，car表达细胞的分选包括使用car结合抗体。富集还可包括cd56+细胞的耗尽。在实施方案的另外的方面，所述方法还包括冷冻保存转基因car细胞群的样品。

在另外的实施方案中，提供了通过任何实施方案的方法制备的表达car的免疫效应细胞(例如，t细胞)群。

在另外的实施方案中，提供了治疗患者疾病的方法，所述方法包括按照本实施方案的方法产生细胞组合物，并向有此需要的患者施用有效量的所述细胞组合物。在一些方面，提供了用于治疗患有医学病况的个体的方法，所述方法包括从本文描述的细胞群体提供有效量的细胞的步骤，包括在一些方面不止一次提供，例如间隔至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天。

在另外的实施方案中，提供了包含编码靶抗原的第一转基因和编码人白细胞抗原(hla)的第二转基因的工程化抗原呈递细胞(apc)，所述hla在与靶抗原的表位复合的apc的表面上表达。工程化的apc可以是或可以不是永生化的。在一些方面，工程化的apc是原代细胞或t细胞或t细胞祖细胞。在一些其它方面，工程化的apc是表达αβtcr或γδtcr的t细胞。在某些具体方面，在工程化的apc中表达的hla是hla-a2。在另外的方面，工程化的apc已被测试并被确认为没有传染性材料。

在一些方面，实施方案的工程化的apc还可包含编码共刺激分子的至少第三转基因。共刺激分子可以是可为膜结合的cγ细胞因子的共刺激细胞因子。在某些方面，共刺激细胞因子是il-15，其可以是或可以不是膜结合的。

在另外的方面，灭活或辐照实施方案的工程化的apc。在一些方面，工程化的apc可包含经编辑的基因以减少或消除抑制基因的表达。在具体方面，抑制性基因是pd-1、lim-3、ctla-4或tcr。

在另外的方面，在实施方案的工程化的apc中表达的靶抗原可以是感染性疾病抗原或肿瘤相关抗原(taa)。靶抗原可以是细胞内或细胞表面抗原。例如，在一些方面，靶抗原是taa，诸如源自肿瘤细胞的亚细胞区室的taa。taa可以是膜结合的、细胞质的、核定位的或甚至由肿瘤细胞分泌的。优选地，与相应的正常组织相比，taa差异表达，从而允许免疫效应细胞优先识别肿瘤细胞。肿瘤抗原可以被松散地分类为癌胚胎的(通常只在胎儿组织和癌性体细胞中表达的)、致癌病毒的(oncoviral)(由致瘤转化病毒编码的)、过表达/积累的(由正常和肿瘤组织表达的，表达水平在瘤形成中高度升高)、癌-睾丸的(仅由癌细胞和成体生殖组织诸如睾丸和胎盘表达的)、谱系限制的(主要由单个癌组织型表达的)、突变的(仅由作为遗传突变或转录的改变的结果而产生的癌症表达的)、翻译后改变的(糖基化中的肿瘤相关的改变，等等)或独特型的(高度多态性的基因，其中肿瘤细胞表达特定的“克隆型”，例如，如在因克隆异常而导致的b细胞、t细胞淋巴瘤/白血病中)，任何此类taa可用作根据实施方案的靶抗原。靶抗原的具体实例包括但不限于wt1、muc1、lmp2、hpve6e7、egfrviii、her-2/neu、独特型、magea3、p53非突变体、ny-eso-1、psma、gd2、cea、melana/mart1、ras突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(pr1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、psa、htert、肉瘤易位断裂点、epha2、pap、ml-iap、afp、epcam、erg(tmprss2ets融合基因)、na17、pax3、alk、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mcn、rhoc、trp-2、gd3、岩藻糖基gm1、间皮素、psca、magea1、sle(a)、cyp1b1、plac1、gm3、boris、tn、globoh、etv6-aml、ny-br-1、rgs5、sart3、stn、碳酸酐酶ix、pax5、ot-tes1、精子蛋白17、lck、hmwmaa、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、legumain、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-1、fap、pdgfr-β、mad-ct-2和fos相关抗原1。其它方面，靶抗原是感染性疾病抗原。

在另外的方面，实施方案的工程化的apc是人细胞。在一些方面，可将工程化的apc的第一和/或第二转基因整合至细胞的基因组中。另外，在某些方面，所述第一和/或第二转基因可以侧接转座子重复或病毒ltr。在另外的方面，第一和/或第二转基因由重组mrna编码。

在另外的实施方案中，提供了包含根据实施方案的工程化的apc群和具有针对与apc中表达的hla复合的靶抗原的表位的特异性的免疫效应细胞(例如，t细胞)群的细胞培养物。在某些方面，培养物的免疫效应细胞具有与工程化的apc相同的遗传背景。在具体方面，免疫效应细胞表达与在工程化的apc中表达的hla复合的靶抗原表位结合的t细胞受体(tcr)。在特定方面，tcr是αβtcr。在某些方面，靶抗原是ny-eso-1。在一些具体方面，tcr包含与抗-ny-eso-1-αβtcr(seqidno：28)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或与其相同的序列。

在另外的方面，细胞培养物的免疫效应细胞(包括实施方案的工程化的apc)表达嵌合的t细胞受体(car)，其结合与在工程化的apc中表达的hla复合的靶抗原的表位。car可包含结合与在apc中表达的hla复合的靶抗原的表位的抗体可变结构域。在一些具体方面，靶抗原是ny-eso-1。在某些方面，car包含与ny-eso-1r-cd28tm-cd137-zcar(seqidno：22)、ny-eso-1r-cd8a-cd28-zcar(seqidno：24)或ny-eso-1r-cd8a-cd137-zcar(seqidno：26)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或与所述序列相同的序列。

在一些方面，实施方案的工程化的apc的细胞培养物可包含刺激免疫效应细胞(例如，t细胞)扩增的培养基。培养基可包含il-21和/或il-2。在具体方面，培养物包含为约10∶1至约1∶10(免疫效应细胞对工程化的apc)的比例。

在另外的实施方案中，提供了药物组合物，其案在药学上可接受的载体中包含根据本文所述的实施方的工程化的apc群。

在另外的实施方案中，提供了治疗患有疾病的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据实施方案的工程化的apc，其中所述apc表达与该疾病相关的靶抗原。在一些方面，受试者患有表达由工程化的apc编码的靶抗原的癌症。癌症可以是骨髓瘤或滑膜肉瘤。在某些方面，癌症是ny-eso-1阳性癌症，并且靶抗原是ny-eso-1。

在实施方案的一些方面，先前已从受试者中分离出工程化的apc。在另外的方面，所述方法另外包括向受试者施用抗原特异性免疫效应细胞群，所述免疫效应细胞对与在工程化的apc中表达的hla复合的靶抗原表位具有特异性。可能先前已从受试者中分离出来免疫效应细胞。在另外的方面，免疫效应细胞已被工程化来表达结合与在工程化的apc中表达的hla复合的靶抗原表位的t细胞受体(tcr)。在具体方面，tcr是αβtcr。在一些特定方面，目标抗原是ny-eso-1。在某些方面，tcr包含与抗-ny-eso-1-αβtcr(seqidno：28)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或与其相同的序列。

在该实施方案的另外方面，免疫效应细胞表达结合与在工程化的apc中表达的hla复合的靶抗原结合的嵌合t细胞受体(car)。car可包含结合与在工程化的apc中表达的hla复合的靶抗原表位的抗体可变结构域。在一些具体方面，靶抗原是ny-eso-1。在另外的方面，car包含与ny-eso-1r-cd28tm-cd137-zcar(seqidno：22)、ny-eso-1r-cd8a-cd28-zcar(seqidno：24)或ny-eso-1r-cd8a-cd137-zcar(seqidno：26)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或与所述序列相同的序列。

在另外的实施方案中，提供了重组car多肽，其包含与ny-eso-1r-cd28tm-cd137-zcar(seqidno：22)、ny-eso-1r-cd8a-cd28-zcar(seqidno：24)或ny-eso-1r-cd8a-cd137-zcar(seqidno：26)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或与所述序列相同的序列。在另外的实施方案中，提供了包含与ny-eso-1r-cd28tm-cd137-zcar(seqidno：22)、ny-eso-1r-cd8a-cd28-zcar(seqidno：24)或ny-eso-1r-cd8a-cd137-zcar(seqidno：26)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或与所述序列相同的car多肽的免疫效应细胞(例如，t细胞)。

在另外的方面，实施方案的方法另外包括富集表达抗原的工程化的apc的细胞群。在一些方面，富集包括荧光激活细胞分选(facs)。在具体方面，富集包括针对抗原表达的分选。

另外的实施方案提供了制备实施方案的工程化的apc的方法，所述方法包括获得包含apc的细胞样品并用包含编码靶抗原的转基因和编码人白细胞抗原(hla)的转基因的核酸转染细胞，使得所述hla在apc的表面上表达，与靶抗原的表位复合以产生工程化的apc的群体。在某些方面，apc是t细胞或t细胞祖细胞。在另外的方面，所述方法另外包括在转染前纯化或富集样品中的apc。在特定方面，t细胞或t细胞祖细胞来源于诱导的多能干细胞、胚胎干细胞或造血干细胞。在另外的方面，富集样品中的t细胞包括收集单核细胞级分。在一些方面，细胞样品可以来自受试者的脐带血、淋巴器官或外周血样品。在某些方面，细胞样品可通过单采或静脉穿刺获得。在另外的方面，细胞样品是t细胞的亚群。在一些具体方面，灭活转基因car细胞以用于表达内源t细胞受体和/或内源hla。在特定方面，获得细胞样品包括从第三方获得细胞。

在一些方面，apc的转染包括将编码转基因的dna电穿孔至apc中以产生工程化的apc。在另外的方面，apc可使用病毒载体进行转导。在一些方面，转染可以涉及或可以不涉及用病毒感染或转导细胞。在另外的方面，用编码膜结合的cγ细胞因子的核酸另外转染细胞。在某些方面，膜结合的cγ细胞因子可以是膜结合的il-7、il-15或il-21。在具体方面，膜结合的cγ细胞因子是il-15-il-15rα融合蛋白。

在另一方面，apc的转染另外包括将转座酶引入细胞，并且其中至少一个转基因侧接转座子重复序列。在一些方面，转座酶可以作为dna表达载体、mrna、多肽或可表达的rna来提供。在具体方面，转座酶是鲑鱼型tc1样转座酶(sb)。在另外的具体方面，转座酶是sb11或sb100x转座酶。

在实施方案的另外方面，生产工程化的apc的方法包括在促进apc增殖的培养基中离体培养工程化的apc细胞群的另外步骤。在一些方面，培养工程化的apc可包括在抗原特异性免疫效应细胞诸如t细胞存在的情况下培养细胞，所述细胞对与在apc中表达的hla复合的靶抗原的表位具有特异性。在某些方面，可从与apc相同的受试者获得免疫效应细胞。在另外的方面，免疫效应细胞已被工程化来表达结合与在apc中表达的hla复合的靶抗原表位的t细胞受体(tcr)。在特定方面，tcr是αβtcr。在另外的方面，免疫效应细胞已被工程化来表达结合与在apc中表达的hla复合的靶抗原表位的嵌合抗原受体(car)。在一些方面，car可包含结合与在apc中表达的hla复合的靶抗原表位的抗体可变结构域。

在另外的方面，已测试了实施方案的工程化的apc的感染性材料，并且已确认其不含传染性材料。在一些方面，在免疫效应细胞存在的情况下培养工程化的apc可包括在包含il-21和/或il-2的培养基中培养细胞。在另外的方面，在免疫效应细胞存在的情况下培养工程化的apc可能包括以约10∶1至约1∶10(免疫效应细胞对apc)的比例培养细胞。在某些方面，工程化的apc的培养不超过7天、14天、21天、28天、35天或42天。

在另外的实施方案中，提供了通过本文所述的任何实施方案的方法制备的工程化的apc群体。

在另外的实施方案中，提供了包含工程化的apc和/或抗原特异性免疫效应细胞的细胞组合物。细胞组合物可包含低达100或1,000个细胞。然而，在一些方面，细胞组合物包含至少约10⁴个、10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个或更多工程化的apc和/或抗原特异性免疫效应细胞。在一个方面，细胞可具有基本上相同的遗传物质。在一些方面，细胞可以是来源于单个受试者的人细胞，所述受试者可以是供体或患者。

在另外的实施方案中，提供了包含含有本实施方案的工程化的apc的细胞组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

在另外的实施方案中，提供了治疗患者疾病的方法，所述方法包括施用有效量的包含工程化的apc的细胞群或包含工程化apc的药物组合物。在一个方面，患者可以是人类患者。在某些方面，所述疾病可以是癌症。在另外的方面，癌症可以是血液癌症或实体癌，诸如t细胞all、b-all、cml、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、脑肿瘤或胰腺癌。在一些方面，患者可以已经经历了先前的抗癌疗法。在一个方面，患者可处于缓解状态。在另一个方面，患者可以没有癌症的症状，但包含可检测的癌细胞。在另一个方面，所述疾病可以是病毒感染(例如，巨细胞病毒(cmv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)或人免疫缺陷病毒(hiv))。在另一个方面，所述疾病可以是细菌感染。在一个方面，所述疾病可以是败血症。

在一些另外的方面，包含工程化的apc的细胞组合物对于患者可以是同种异体的。在各个方面，同种异体细胞组合物可以与或可以不与患者共享hla。在另一个方面，包含工程化的apc的细胞组合物对于患者可以是自体的。

在另外的实施方案中，提供了治疗患者疾病的方法，所述方法包括产生包含本实施方案的工程化的apc的细胞组合物，并向有此需要的患者施用有效量的所述细胞组合物。

在一些方面，提供了用于治疗具有医学病况的个体的方法，所述方法包括提供有效量的实施方案的工程化的apc的步骤，包括在一些方面中不止一次地提供，诸如间隔至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天。

在另外的实施方案中，本文提供了在用于治疗目的的基因修饰之后鉴定和选择高能免疫效应细胞(例如，car+t细胞)的方法。因此，在一个实施方案中，提供了用于选择具有线粒体备用呼吸容量的经car修饰的免疫效应细胞的方法。在一些方面，该方法包括检测线粒体报告基因的表达水平，并选择线粒体报告基因表达水平升高的免疫效应细胞，从而选择具有线粒体备用呼吸容量的免疫效应物。在一些方面，免疫效应细胞可以是人细胞，例如car-修饰的人t细胞。

在一些方面，根据实施方案使用的线粒体报告基因可以是内源基因。在一些方面，线粒体报告基因可以是外源基因，例如编码荧光报告蛋白的基因。在一些方面，荧光报告蛋白可包含线粒体定位序列。在某些方面，用于选择具有src的免疫效应细胞的方法可以包括流式细胞术或facs。

在某些方面，用src鉴定免疫效应细胞的报告基因的表达可处于核启动子(例如hef1a)的控制下。在某些方面，报告基因的表达可处于线粒体启动子的控制之下。在某些方面，表达的报告蛋白可包含线粒体定位序列。在某些方面，表达的报告蛋白可被引导至细胞表面。在某些方面，报告基因的表达可处于线粒体启动子的控制之下，并且所表达的报告蛋白被引导至细胞表面。在一些方面，外源报告基因可侧接转座子重复或病毒ltr。在一些方面，外源报告基因可包含在染色体外核酸如mrna或附加型载体中。

在一些方面，可将选择用于src(例如，经car-修饰的t细胞)的免疫效应细胞离体扩增一段时间，其在一些方面可包括用饲养细胞(诸如含有car配体或结合car的抗体(例如2d3scfv)的活化和繁殖细胞(aapc))培养细胞。在一个方面，aapc可以是转基因k562细胞。在一个方面，aapc可表达cd137l。在其它方面，aapc还可表达cd19、cd64、cd86或mil15。在某些方面，aapc可表达至少一种抗cd3抗体克隆，诸如，例如okt3和/或ucht1。在一个方面，可灭活(例如辐照)aapc。在一个方面，可能已测试了aapc的感染性物质，并且已确认其不含感染性物质。制备此类aapc的方法是本领域已知的。在一个方面，用aapc培养经car-修饰的t细胞群可包括以约10∶1至约1∶10的、约3∶1至约1∶5、约1∶1至约1∶3(t细胞对aapc)或可从其中导出的任何范围的比例培养细胞。例如，t细胞和aapc的共培养物可以是约1∶1、约1∶2或约1∶3的比例。在一个方面，培养步骤还可包括利用氨基二膦酸(例如，唑来膦酸)的培养。

在另外的实施方案中，为免疫效应细胞群(例如，经car-修饰的t细胞)提供线粒体备用呼吸容量和药学上可接受的载体。可以根据本实施例的方法来选择细胞群。在一些方面，细胞可以是治疗上可行的。在一些方面，细胞群可包含至少10个、1x10²个、1x10³个、1x10⁴个、1x10⁵个或1x10⁶个或可从其中导出的任何数目的细胞。在各个方面，细胞可以是nk细胞、天然杀伤t细胞、αβt细胞或γδt细胞。在一个方面，免疫效应细胞可具有基本相同的遗传物质。在一些方面，免疫效应细胞可以是经car修饰的人t细胞。在一些方面，细胞可以来源于可以是供体或患者的单个受试者。

在另外的实施方案中，提供了治疗有此需要的患者的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的具有线粒体备用呼吸容量或就线粒体备用呼吸容量选择的免疫效应细胞(例如，经car修饰的t细胞)群。在一些方面，所述方法可包括向患者施用约100个至约1×10⁶个细胞或可从其衍生的任何数目的细胞。在某些方面，患者可以是人患者。在某些方面，具有src的免疫效应细胞群对于患者可以同种异体的。在各个方面，同种异体细胞组合物可以与或可以不与患者共享hla。在某些方面，具有src的免疫效应细胞群对患者可以是自体的。在各个方面，所述方法还可包括向患者施用第二疗法。

在一些方面，用具有src或就src选择的免疫效应细胞治疗的疾病可以是癌症。在某些方面，癌症可以是血液癌症或实体癌，诸如t细胞all、b-all、cml、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、脑肿瘤或胰腺癌。在一些方面，患者可以已经历了先前的抗癌治疗。在一个方面，患者可处于缓解状态。在另一个方面，患者可以没有癌症的症状，但包含可检测的癌细胞。在另一个方面，利用具有src的免疫效应细胞治疗的疾病可以是病毒感染(例如，巨细胞病毒(cmv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)或人免疫缺陷病毒(hiv))。在另一方面，所述疾病可以是细菌感染。在一个方面，所述疾病可以是败血症。

在一个实施方案中，提供了治疗患者疾病的方法，所述方法包括根据实施方案产生包含具有src的免疫效应细胞的细胞组合物，并向有此需要的患者施用有效量的所述细胞组合物。在一些方面，提供了用于治疗患有医学病况的个体的方法，所述方法包括提供有效量的具有src的免疫效应细胞的步骤，在一些方面包括不止一次，诸如间隔至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天。

在一个实施方案中，提供了包含本实施方案的细胞群的组合物，用于治疗患者的疾病。

可对本文所述的任何其它方法或组合物使用在实施方案的方法和/或组合物的上下文中讨论的实施方案。因此，关于一种方法或组合物的实施方案也可应用于实施方案的其它方法和组合物。

根据以下详细描述，实施方案的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，详细描述和具体实例仅通过说明的方式给出，因为根据该详细描述，实施方案的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图简述

图1：靶向cd19受体的嵌合抗原受体的示例示意图。car构建体(cd19rcd28)包含cd19结合结构域(vl/vh)、铰链结构域(igg4-fc)、跨膜结构域(cd28tm)和细胞内信号传导结构域(cd28-cd3ζ)。

图2a-b：a，图显示通过流式细胞术获得的散点图，该散点图显示在电穿孔后1天和与k562aapc共培养28天后cd19rcd28car在t细胞上的表达。b，图是通过流式细胞术获得的散点图，该散点图显示cd19rcd28cart细胞的fc受体(cd32(fcγr2a)、cd64(fcγr1a))的体外结合。

图3a-b：因fcr结合引起的有限的体内持久性可降低功效。用hrluc⁺nalm6肿瘤注射nsg小鼠，然后单次注射cd19rcd28t细胞(或对照注射)。a，随着时间的推移通过成像测量与肿瘤相关的生物发光。b，图表显示基于测量发光水平的处理或对照动物随时间推移的肿瘤负荷。

图4a-h：所述图显示了构建和测试的各种car的示意图。还提供了所选car结构域的序列。对于人igg4铰链区，将铰链从氨基酸cpsc(如seqidno：9所示的全长序列)突变为cppc(如seqidno：10所示的全长序列)，以增强二聚化igg4重链的稳定性。人igg4fc(具有氨基酸变化l235e和n297q的eq突变体)是如seqidno：1所示的。人cd8a链铰链和跨膜结构域以seqidno：3提供。将来自人igg4fc的12个氨基酸的间隔子从氨基酸cpsc(如seqidno：18所示的)突变成cppc(如seqidno：2所示的)以增强二聚化igg4重链(如seqidno：2所示的)的稳定性。对于人cd28跨膜胞质结构域，将人cd28跨膜和胞内结构域从rllh(如seqidno：11所示的全长序列)修饰为rggh(如seqidno：12所示的全长序列)，以改善car的表达。对于人cd28胞质结构域，将人cd28胞内结构域从rllh(如seqidno：16所示的全长序列)修饰为rggh(如seqidno：17所示的全长序列)以改善car的表达。

图5：该图显示通过流式细胞术获得的散点图，该散点图显示在电穿孔后1天和在与k562aapc共培养28天后，car的各种car在t细胞上的表达。

图6：该图显示通过流式细胞术获得的散点图，该散点图显示cd19r*cd28cart细胞对fc受体(cd32(fcγr2a)、cd64(fcγr1a))的体外结合减少。

图7：该图显示描绘了在与k562aapc共培养的28天中各种cart细胞的扩增动力学的图。

图8：该图显示描绘各种cart细胞相对于cd19el-4和nalm-6靶细胞显示的cd19特异性细胞毒性的图。

图9：该图显示当与不同靶细胞接触时，各种cart细胞的cd19特异性ifn-γ产生的图表。

图10：该图显示用肿瘤(hrluc+nalm-6)注射(i.v.)，然后在第二天用ffluc+car+t细胞注射(i.c.)的nsg小鼠的发光成像。在使用xenogenivis100系列系统分别注射enduren或荧光素后，进行肿瘤和t细胞成像。在确认心内注射(顶行)后立即进行t细胞成像。显示了表示来自肿瘤产生的hrluc活性随时间的光子通量的阴影图像。

图11：改善car+t细胞控制疾病的体内功效。该图显示表示基于图10中的生物发光测量的肿瘤负荷的图。如上所述，用hrluc+nalm-6肿瘤注射nsg小鼠，然后单次注射cart细胞。随着时间的推移测量肿瘤相关生物发光，并显示所述生物发光。(*)表示相对于仅肿瘤组的至少p＜0.05的显著性。

图12：该图显示描绘用各种cart细胞处理的nsg小鼠的存活曲线的图。当与仅肿瘤(无处理)组相比时，计算出显著性(p值)。

图13a-d：car⁺t细胞的表征。用cd19r*cd28或cd19rcd8cd28转座子和sb11转座酶对pbmc进行电穿孔，并在7天刺激周期中，将其在经辐照的k562抗原呈递细胞上与il-2和il-21一起共培养28天。在每个刺激周期结束时，对细胞进行计数和表型分型(cd3，car)。(a)在电穿孔后当天(第1天)和共培养28天后，car在cd3⁺t细胞上的表达。(b)显示扩增动力学的cd3和car+t细胞的推定细胞计数。(c)使用针对cd19^pos靶标(cd19⁺el-4、nalm-6、daudiβ2m)的标准铬释放测定法测量cd19特异性细胞毒性。背景裂解通过cd19^negel-4的裂解来描绘。(d)当用表达cd19的各种效应物靶刺激时，car⁺t细胞的ifn-γ的细胞内产生。

图14a-d：car⁺t细胞对nsg(nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1wjl/szj，nodscidγ)小鼠中的cd19⁺nalm-6细胞系的体内功效。(a-b)在最小残留疾病模型中，在第0天向nsg小鼠(n＝5/组)注射10⁴个hrluc⁺mkate⁺nalm-6细胞，然后在第1天心内注射t细胞(10⁷/小鼠)。随时间推移使用enduren活细胞基质，通过源自hrluc⁺nalm-6产的生物发光成像评估肿瘤负荷。(c-d)对于已建立的肿瘤模型，在第0天向nsg小鼠(n＝6/组)注射1.5x10⁴个ffluc⁺egfp⁺nalm-6，并将肿瘤移植5天，评价肿瘤负荷，并在第6天心内注射t细胞(10⁷/小鼠)。随着时间的推移，使用d-荧光素底物从ffluc⁺nalm-6进行生物发光成像来计算肿瘤通量。显示了表示光子通量和肿瘤通量随时间变化的伪彩图像。

图15：该图显示cart细胞的另外的信号传导分子。上图显示膜结合的il-15/il-15受体(mil15)构建体(构建体的多肽序列如seqidno：4所示)。下图是由膜结合的il-15/il-15受体(左图)和car构建体(右图)提供的信号传导的示意图。

图16：mil15和car的稳定共表达。左上图显示了电穿孔后24小时或刺激4(stim4)的mil15+car+t细胞的代表性流动图(flowplot)。左下图是显示表达car或car和mil15的电穿孔细胞的百分比的图。右上图，图显示抗原撤出后培养中的cart细胞数的变化。在无il-15，添加il-15复合物或利用共表达mil-15和car的细胞的情况下完成研究。右下图显示表达mil-15的cart细胞中各种转录调节子的表达水平的图。

图17a-b：a，该图显示用只表达car或表达与mil-15组合的car的ffluc+t细胞注射的小鼠的发光成像。在使用xenogenivis100系列系统分别注射荧光素后进行t细胞成像。阴影图像表示随着时间推移来自ffluc+t细胞活性的光子通量。b，左图，图显示在抗原存在的情况下或抗原撤出(wd)后培养mil-15-cart细胞中的因子的表达水平。右图板显示在刺激和不刺激的情况下cart细胞和mil-15-cart细胞的直方图。

图18：cart细胞对肿瘤生长的体内控制。该图显示用hrluc+肿瘤细胞注射的小鼠的发光成像(上图)和定量(下图，图)。如所指示的，某些小鼠还注射了表达car或car和mil-15的t细胞。

图19：举例说明用作抗原呈递细胞的t细胞(t-apc)的示意图。t细胞自体移植后，以及通过直接和交叉引发改善内源性长期免疫。

图20：用于遗传修饰人t细胞以表达肿瘤抗原ny-eso-1的睡美人质粒的图示。组成型表达由hef1-α启动子驱动，通过在0.2mg/ml潮霉素下繁殖t细胞来实现选择。

图21：用作aapc的k562上的t细胞共刺激分子的表。

图22：在电转染共表达flag标记的ny-eso-1和hytk的sb质粒后，在okt3-aapc上共培养的第28天进行的人t-apc的流式细胞术。

图23：在ny-eso-1⁺t-apc(上)对比k562aapc(下)上扩增的pbmc。

图24：在ny-eso-1⁺t-apc对比k562aapc上扩增的ny-eso-1⁺cart细胞。

图25：3次刺激后ny-eso-1⁺t-apc上的抑制分子。

图26：在aapc存在的情况下繁殖的ny-eso-1⁺mil-15⁺hla-a2⁺t-apc。

图27：t-apc扩增。t-apc能够成功地扩增cart细胞以及源自阳性对照k562的aapc。

图28：显示ny-eso-1特异性tcr⁺和car⁺t细胞杀死ny-eso-1⁺u266人多发性骨髓瘤细胞系的铬释放测定。在来源于k562的人工活化和繁殖细胞(aapc)上扩增t细胞，所述t细胞表达hla-a02和ny-eso-1⁺。数据表示两个独立实验，其中繁殖9-2-15的ny-eso-1特异性cart细胞，用hla-a2/ny-eso-1t-apc刺激3次，并且用衍生的aapck562刺激2次。9-2-15car含有cd8α茎，而先前的9-2-15car含有igg4茎。

图29a-29b：图29a.在经辐照的k562aapc存在的情况下，与对照t细胞一起离体生长的基因修饰的t细胞的tem(透射电子显微术)图像。与在相似条件下激活的未修饰的对照细胞(左图)相比，在经car修饰的细胞(右图)中看到线粒体数量的增加。图29b.显示与在第35天培养中繁殖的经car修饰的t细胞中的线粒体的缩合状态相比的未修饰的对照t细胞中的线粒体规则正统结构的透射电子显微术(tem)图像(比例尺500nm，50,000倍放大)。

图30：在未共同刺激的情况下的her1-3双特异性car-t细胞的离体扩增。细胞是未修饰的或用cd28和/或cd137t细胞信号传导胞内结构域修饰的car。当在培养中不提供共刺激时，相对于含有cd28信号传导结构域的cart细胞，具有cd137t细胞信号传导胞内结构域的细胞在培养中存活得更好。用于未经修饰的对照细胞的okt3刺激作用更好可能是因为通过cd3z诱导的较高的信号传导强度。显示了在k562aapc存在的情况下离体繁殖的靶向肿瘤抗原her1-3的car-t细胞的tem图像。还测试了其它肿瘤抗原靶向的car诸如ror1、cd123和c19的该tem图像。通过nexcelom，使用台盼蓝活/死亡排除法计算有活力的绝对t细胞数。

图31：荧光蛋白报告基因的sb质粒构建体。grx2是源自glrx2(pubmedid#np_932066.1)的线粒体定位序列。nls是核定位序列(pubmedid#nm_017921)。

图32：经car修饰的细胞中的eyfp内源性表达的流式细胞术分析。在培养的第35天在无共刺激的情况下生长的cd137-cart细胞中出现具有高eyfp的car+t细胞。cd28-t细胞显示较少或更暗的eyfp阳性t细胞。流式细胞术基于fc染色(针对car表达)和内源性eyfp(针对线粒体强度)。

图33a-33b：在无t细胞共刺激的情况下利用经辐照的饲养细胞(k562aapc)扩增的her1-3双特异性car-t细胞的线粒体生物量。图33a.显示线粒体在未修饰的t细胞和经修饰以表达靶向her1-her3(由cd28-cd3z或cd137-cd3zt细胞信号传导结构域组成)的原型car的t细胞中的分布的透射电子显微术(tem)图像(比例尺500nm，15,000倍放大)。图33b.每个细胞的平均线粒体数量在条形图中表示。与含有cd28信号传导结构域的car-t细胞相比，总体上具有cd137t细胞信号传导结构域的car-t细胞在第21天培养后显示出生物量的增加。

图34：高能t细胞(et)的体外细胞毒性。发现就高线粒体质量分选的高能t细胞保留了细胞毒性能力，如通过对肿瘤抗原阳性乳腺癌细胞的特异性杀伤所证明的。数据来自对cr标记的her1-3⁺t细胞(针对对于特定抗原呈阳性的乳腺肿瘤细胞系的)的进行的铬释放测定，所述cr标记的her1-3⁺t细胞被具有高eyfp/线粒体强度的cart细胞裂解。

图35：在最小活化和完全不存在共刺激的情况下，在经辐照的饲养细胞(k562aapc)存在的情况下离体扩增的未修饰的和经car修饰的t细胞的荧光显微术图像。含有cd137t细胞信号传导胞内结构域的car-t细胞显示较高的线粒体质量分布，如从报告蛋白(eyfp-grx2)内源性发出的荧光信号强度观察到的。与含有cd28信号传导结构域的car-t细胞相比，含有cd137t细胞信号传导胞内结构域的car-t细胞中的代谢活性t细胞数量明显更高。这是一致的，不论供体或car的类型。

图36：在经辐射的饲养细胞(k562aapc)存在的情况下生长的离体扩增的经car-修饰的t细胞中的线粒体分布模式。

图37a-37b：荧光显微术图像的综合形态测量分析显示基于代表特定信号传导胞内结构域的基因修饰的t细胞(her1-her3cd137-cd3zt细胞)组内的线粒体强度的经car-修饰的t细胞的异质群体。图37a.her1-3cd137car⁺t细胞中的eyfp-mito的群体变异。图37b.her1-3cd137car⁺t细胞中的eyfp-mito的平均强度。

图38：在通用k562-aapc上生长的car+t细胞的透射电子显微术(tem)图像。图像来自实施例8中所述的研究的第14天。

图39：ror1-cart细胞在通用k562-aapc上的生长动力学。含有cd28信号传导的car-t细胞迅速进行凋亡(左图)，而含有cd137z信号传导的car-t细胞持续时间更长(右图)。

详述

临床试验已证明了在已经接受遗传修饰的t细胞的患者中的抗肿瘤作用。例如，已显示car-t细胞疗法在患有晚期b细胞恶性肿瘤的人类患者中表现出有意义的缓解(maude等，2014)。car-t细胞具有寻求和破坏体内肿瘤细胞所必需的特异性和细胞毒性能力，并且可持续足够长的时间来阻止复发。最近在几个于i期临床试验中接受治疗的患者中，已经显示了连续杀伤(一个t细胞杀死多个肿瘤细胞而不发生无反应性)的该经典情况(corrigan-curay等，2014)。然而，在car设计、cart细胞胞内结构域、间隔长度用法、scfv的亲和力等方面尚未出现统一而明确的临床相关结果(jena等，2014)。这再次因通过car-t细胞输注寻求治疗的患者群体中的可变肿瘤负荷和肿瘤类型而复杂化。设计治疗上有效的car构建体和最终基因修饰的t细胞群的主要挑战是，这将在肿瘤类型、肿瘤分期和患者群体的整个范围上减轻临床相关结果(无显著毒性)。

本文详述的研究鉴定了在cart细胞持久性中起作用的关键元件，其可影响t细胞的功效和潜在毒性(例如，来自脱靶细胞毒性活性)。具体地，显示了car多肽被fc受体结合的能力调节t细胞的持久性和抗肿瘤功效。因此，可通过改变在t细胞上表达的car多肽的fc受体结合性质来改变cart细胞功效(和体内持久性)。例如，可将fc受体结合序列(诸如来自人免疫球蛋白恒定区)包含在car中以减少t细胞的持续性并控制t细胞的潜在毒性。相反，可以修饰car多肽以除去fc受体结合元件以增加cart细胞的体内持久性并增强其功效。因此，本文详述的car多肽、cart细胞和方法允许cart细胞持久性的微调(通过调节fc受体结合)以控制cart细胞疗法的功效和毒性。

在另外的实施方案中，提供了包含编码靶抗原的转基因和编码人白细胞抗原(hla)的转基因的工程化的抗原呈递细胞(apc)。在一些方面，工程化的apc可另外包含编码共刺激因子(诸如il-15)的一种或多种转基因。此类工程化的apc可用于例如用于扩增t细胞(诸如，cart细胞)的离体方法，或可被施用于受试者以在体内刺激抗原特异性t细胞的生长。因此，本文提供的细胞可用于刺激抗原特异性t细胞的生长以用于治疗疾病(例如，癌症)。

本文公开的其它实施方案提供具有src或针对src选择的免疫效应细胞，其可以提供增强的治疗性质。具有高线粒体生物量的细胞在本文中例如被称为“能量t细胞”或“et细胞”。由于基因修饰的免疫效应细胞的增加的持久性与改善的治疗潜力正相关，因此预计免疫细胞诸如能量t细胞表现优于大量基因修饰的t细胞。另外，如果可基于线粒体强度(即备用呼吸容量或src)在输注前鉴定长期存活的car-t细胞，则可利用多种变量对car设计，从而对car功能的影响。因此，线粒体强度可有助于选择/分选最佳的连续t细胞杀伤剂而不论car胞内结构域的使用、car构建体的设计、间隔子的长度和scfv的亲和力，从而减少翻译障碍，以优化适合于特定的肿瘤抗原和肿瘤类型的car设计。在多种情况下，在输注前挑取最好的t细胞(例如，在肿瘤微环境中具有最大存活潜力的那些细胞)可以是有利的。因此，提供了使用报告荧光蛋白(例如，eyfp-grx2)测量car+t细胞的“适合性”的方法，所述报告荧光蛋白是可定量的并与线粒体src相关，其转而指示遗传修饰的t细胞在缺氧、无特定营养物用于糖酵解的不利条件下存活的代谢能力，和由高负荷肿瘤抗原引起的活化诱导的细胞死亡。

此外，选择更少，更具效力的car+t细胞用于输注可有助于减少或甚至消除输注后的t细胞相关毒性。限制输注所需的细胞数量将减轻生长大量难以生长的患者来源的自体t细胞(以用于遗传修饰)的负担。例如，在过继性细胞疗法的方法中，使用少量的免疫效应细胞(诸如t细胞)引发高抗肿瘤杀伤可以是非常希望的。使用少量的t细胞可使从经car-修饰的t细胞输注产生的输注相关毒性降至最低。此外，如果输注的细胞在体内存活时间更长，从而可防止肿瘤复发，则这可以是优选的。在这两种情况下，鉴定、选择和输注高能car修饰的t细胞的现有方法将是有益的。

在任何特定批次的经car修饰的t细胞中线粒体分布以及src之间存在异质性。因此，如果仔细选择，与大量群体相比，较少的细胞可在体内实现相似的结果。这对于肿瘤是有帮助的，在所述肿瘤中(i)car不能区分正常抗原与肿瘤相关抗原，因此较少细胞的输注是希望的，(ii)由于原始细胞群中固有的畸形，患者来源的自体t细胞的扩增是困难的，(iii)输注后经car修饰的t细胞在体内的有限持久性是希望的。测定src/线粒体强度的方法可基于使用mito-tracker染料(invitrogen)标记细胞，或其中取回细胞以用于临床应用是不可能的类似的修饰后方法。测定线粒体强度的其他方法(诸如测量氧气消耗或细胞外酸化)测量大量细胞的强度而非单个细胞的强度，其也缺乏临床应用。如本文所提供的，可使用非病毒dna电穿孔法来同时修饰效应细胞(诸如t细胞)以用于car表达和src鉴定。具体地，为了选择et细胞，可通过睡美人介导的转座(一种已经适应于临床翻译的基于非病毒dna的基因递送系统)来实现荧光线粒体指导的报告蛋白与car分子一起在细胞中表达。在基因修饰和基于配体刺激的k562的共培养后，et细胞的基于流式细胞术的分选可以在gmp条件下进行，适于翻译，并且可容易地适应于在诊所中使用。总之，可通过将临床相关方法组合以遗传修饰t细胞来产生可递送期望的抗肿瘤功效的代谢活性t细胞(et细胞)，使用具有最少的活化的基于辐照的k562的共培养将其扩增至大量，并基于荧光报告蛋白的表达来鉴定其。

i.定义

如本文中所用，“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可指一个/种或多个/种。如在权利要求中所用，当与单词“包含”一起使用时，单词“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可指一个/种或不止一个/种。

除非明确地指示仅指替代方案，或者替代方案是相互排斥的，否则在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，尽管本公开支持仅指替代方案和“和/或”的定义。如本文中所用，“另一”可表示至少第二或更多。

在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括用于测定值的装置、方法的固有误差变化或存在于研究对象之间的变化。

如本文中所用，术语“抗原”是能够被抗体或t细胞受体结合的分子。抗原另外地能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，从而导致b和/或t淋巴细胞产生。

如本文中所用，术语“抗肿瘤有效量”是指在受试者中减少癌细胞或肿瘤生长或减小肿瘤体积或肿瘤细胞数目的表达car的免疫效应细胞的有效量。“抗肿瘤有效量”还可增加预期寿命或减轻与肿瘤或癌症相关的生理作用的表达car的免疫效应细胞的有效量。

ii.嵌合抗原受体和组分

嵌合抗原受体分子是重组融合蛋白，特征在于它们通过其细胞质尾部中存在的免疫受体激活基序(itam)结合抗原(例如，her1/her3)和转导激活信号的能力。利用抗原结合部分(例如，由单链抗体(scfv)产生的)的受体构建体提供了为“通用的”的另外有利方面，因为它们以不依赖于hla的方式结合靶细胞表面上的天然抗原。

根据实施方案的嵌合抗原受体可通过本领域已知的任何方法产生，尽管优选使用重组dna技术来产生。编码嵌合抗原受体的几个区域的核酸序列可通过分子克隆的标准技术(基因组文库筛选、pcr、引物辅助连接、来自酵母和细菌的scfv文库、定向诱变等)来制备和组装成完整编码序列。可将所得的编码区插入表达载体中并用于转化合适的表达宿主(同种异体或自体免疫效应细胞)。

本文所述的car的实施方案包括编码抗原特异性嵌合抗原受体(car)多肽的核酸，包括包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含一个或多个信号传导基序的细胞外结构域的核酸。在某些实施方案中，car可识别由一个或多个抗原之间的共享空间组成的表位。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含：a)细胞内信号传导结构域，b)跨膜结构域，和c)包含抗原结合结构域的细胞外结构域。任选地，car可包含位于跨膜结构域与抗原结合结构域之间的铰链结构域。在某些方面，实施方案的car还包含将car的表达引导至细胞表面的信号肽。例如，在一些方面，car可包含来自gm-csf的信号肽(参见例如，seqidno：5)。

在某些实施方案中，当存在少量肿瘤相关抗原时，还可将car与膜结合的细胞因子共表达以改善持久性。例如，可将car与膜结合的il-15共表达。

取决于car的结构域和所述结构域中使用的特异性序列的排列，表达car的免疫效应细胞可具有不同水平的针对靶细胞的活性。在一些方面，可将不同的car序列引入免疫效应细胞以产生转基因细胞，针对升高的src选择转基因细胞，以及已测试所选择的细胞的活性，以鉴定经预测具有最大治疗功效的car结构的活性。

a.抗原结合域

在某些实施方案中，抗原结合结构域可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，该特异性来源于与受体结合的肽(例如，细胞因子)。“互补决定区(cdr)”是在抗原受体(例如，免疫球蛋白和t细胞受体)蛋白的可变结构域中发现的短氨基酸序列，其与抗原互补，因此为受体提供其针对该特定抗原的特异性。抗原受体的每条多肽链含有3个cdr(cdr1、cdr2和cdr3)。由于抗原受体通常由两条多肽链组成，所以每个抗原受体有6个cdr可以与抗原接触--每条重链和轻链含有3个cdr。由于在cdr中发现大多数与免疫球蛋白和t细胞受体相关的序列变异，因此这些区域有时被称为高变区。在这些可高变区中，cdr3显示出最大的变异性，因为其是通过vj(在重链和tcrαβ链的情况下为vdj)的重组而编码的。

预期car核酸，特别是scfv序列是增强人患者的细胞免疫疗法的人基因。在一个具体实施方案中，提供了全长carcdna或编码区。抗原结合区或结构域可包含来源于特定小鼠或人或人源化单克隆抗体的单链可变片段(scfv)的vh和vl链的片段。该片段还可以是任何数目的抗原特异性抗体的不同抗原结合结构域。在更具体的实施方案中，该片段是由针对用于人细胞中表达的人密码子选择而优化的序列编码的抗原特异性scfv。在某些方面，car的vh和vl结构域通过接头序列(诸如whitlow接头)分离(参见例如，seqidno：20)。还在国际(pct)专利公布第wo/2015/123642号(通过引用并入本文)中提供了可根据实施方案修饰或使用的car构建体。

在一些具体实例中，car的抗原结合结构域特异性结合her2/neu(stancovski等，1993)、erbb2(moritz等，1994)、叶酸结合蛋白(hwu等，1995)、肾细胞癌(weitjens等，1996)和hiv-1包膜糖蛋白gp120和gp41(roberts等，1994)。可被car结合的其它细胞表面靶抗原包括但不限于cd20、癌胚抗原、间皮素、ror1、c-met、cd56、gd2、gd3、α甲胎蛋白、cd23、cd30、cd123、il-11rα、κ链、λ链、cd70、ca-125、muc-1、egfr和变体、上皮肿瘤抗原等。

在嵌合抗原受体的某些实施方案中，受体的抗原特异性部分(其可被称为包含抗原结合区的细胞外结构域)包含如上文详述的her1/her3结合结构域。在一些方面，例如，her1/her3结合结构域包含美国专利公布第2012/0121596号(通过引用并入本文)中提供的序列之一。

b.铰链结构域

在某些方面，实施方案的car多肽可包括位于抗原结合结构域与跨膜结构域之间的铰链结构域。在一些情况下，可将铰链结构域包含在car多肽中以在抗原结合结构域与细胞表面之间提供足够的距离，或缓解可不利地影响car-基因修饰的t细胞的抗原结合或效应子功能的可能的空间位阻。

在一些情况下，car铰链结构域可来源于人免疫球蛋白(ig)恒定区或其部分(包括ig铰链)，或来源于人cd8α跨膜结构域和cd8a铰链区。在一个方面，car铰链结构域可包含抗体同种型igg4的铰链-ch2-ch3区。在一些方面，可在抗体重链ch2结构域中引入点突变以减少car-t细胞或任何其它经car修饰的细胞的糖基化和非特异性fcγ受体结合。

在某些方面，实施方案的car铰链结构域包含igfc结构域，其相对于野生型igfc结构域包含至少一个突变，所述突变减少fc-受体结合。例如，car铰链结构域可包含相对于野生型igg4-fc结构域包含至少一个突变的igg4-fc结构域，所述突变减少fc-受体结合。在一些方面，car铰链结构域包含相对于野生型igg4-fc序列在对应于l235和/或n297的位置处具有突变(诸如氨基酸缺失或取代)的igg4-fc结构域。例如，car铰链结构域可包含相对于野生型igg4-fc序列具有l235e和/或n297q突变的igg4-fc结构域。在另外的方面，car铰链结构域可包含的igg4-fc结构域，所述的igg4-fc结构域在位置l235处具有针对氨基酸的亲水性的(诸如r、h、k、d、e、s、t、n或q)或与“e”具有相似性质的(诸如d)的氨基酸取代。在某些方面，car铰链结构域可包含在n297位置处具有针对氨基酸的与“q”具有相似性质的(诸如s或t)的氨基酸取代的igg4-fc结构域。在另外的方面，car铰链结构域相对于野生型igg4-fc序列在对应于l235和/或n297的位置处包含突变，并与seqidno：1或seqidno：10具有约90％同一性。

在某些特定方面，铰链结构域包含与seqidno：1或seqidno：10的igg4-fc结构域、seqidno：20的cd8α细胞外结构域或seqidno：3的合成铰链序列具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

c.跨膜结构域

抗原特异性细胞外结构域和细胞内信号转导域可通过跨膜结构域连接。可用作跨膜结构域的一部分的多肽序列包括但不限于人cd4跨膜结构域、人cd28跨膜结构域、跨膜人cd3ζ结构域或半胱氨酸突变的人cd3ζ结构域或来自其它人跨膜信号传导蛋白(诸如cd16和cd8以及促红细胞生成素受体)的其它跨膜结构域。在一些方面，例如，跨膜结构域包含美国专利公布第2014/0274909号或美国专利第8,906,682号(均通过引用并入本文)中提供的序列之一。在某些具体方面，跨膜结构域可与seqidno：19的cd8α跨膜结构域或seqidno：12的cd28跨膜结构域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

d.细胞内信号传导结构域

实施方案的嵌合抗原受体的细胞内信号传导结构域负责激活经工程化以表达嵌合抗原受体的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指分化细胞的特化功能。例如，t细胞的效应可以是溶细胞活性或辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。初始t细胞、记忆或记忆型t细胞中的效应子功能包括抗原依赖性增殖。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并引导细胞进行特化功能的蛋白质的部分。在一些方面，细胞内信号传导结构域来源于天然受体的细胞内信号传导结构域。此类天然受体的实例包括t细胞受体的ζ链或任何其同源物(例如，η、δ、γ或ε)、mb1链、b29、fcriii、fcri和信号传导分子的组合，诸如cd3ζ和cd28、cd27、4-1bb、dap-10、ox40及其组合，以及其它类似的分子和片段。可使用活化蛋白家族的其它成员的细胞内信号传导部分，诸如fcγriii和fcεri。关于使用这些替代跨膜和细胞内结构域的t细胞受体的公开内容，参见gross等(1992)，stancovski等(1993)，moritz等(1994)，hwu等(1995)，weijtens等(1996)和hekele等(1996)。虽然通常将使用完整的细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用完整的细胞内多肽。在细胞内信号传导结构域的截短部分可被使用的程度上，只要其仍然转导效应子功能信号，就可使用此类截短部分替代完整链。因此，术语“细胞内信号传导结构域”意欲包括在car与靶标结合时足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的截短部分。在一个优选实施方案中，人cd3ζ细胞内结构域用作用于实施方案的car的细胞内信号传导结构域。

在具体实施方案中，car中的细胞内受体信号传导结构域例如包括t细胞抗原受体复合物的那些结构域(诸如cd3的ζ链)，还有单独的或与cd3ζ串联的fcγriii共刺激信号传导结构域、cd28、cd27、dap10、cd137、ox40、cd2。在具体实施方案中，所述细胞内结构域(其可被称为细胞质结构域)包含tcrζ链、cd28、cd27、ox40/cd134、4-1bb/cd137、fcεriγ、icos/cd278、il-2rβ/cd122、il-2rα/cd132、dap10、dap12和cd40的一种或多种的部分或全部。在一些实施方案中，可在细胞内结构域中使用内源t细胞受体复合物的任何部分。可使用一个或多个细胞质结构域，因为例如所谓的第三代car具有融合在一起以获得累加或协同作用的至少两个或三个信号传导结构域。

在一些实施方案中，car包含另外的其它共刺激结构域。其它共刺激结构域可以包括但不限于cd28、cd27、ox-40(cd134)、dap10和4-1bb(cd137)中的一种或多种。除了由cd3ζ引发的主要信号以外，由插入人car中的人共刺激受体提供的附加信号对于t细胞的完全活化是重要的，并且可以帮助改善体内持久性和过继性免疫疗法的治疗成功。

在某些特定方面，细胞内信号传导结构域包含与seqidno：13的cd3ζ细胞内结构域、seqidno：17的cd28细胞内结构域或seqidno：15的cd137细胞内结构域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

iii.载体和细胞工程

在具体实施方案中，提供了分离的核酸区段和整合了编码转基因的dna序列的表达盒。例如，转基因可编码car多肽。在另外的方面，转基因编码靶抗原(或其表位)和/或hla多肽。在另外的方面，转基因编码线粒体报告转基因，诸如包含线粒体定位信号的报告多肽(例如，荧光报告蛋白)。

如本领域技术人员将理解的，在一些情况下，可删除编码的转基因末端处的几个氨基酸的编码序列。例如，在编码car的转基因的情况下，可以删除car中的抗原结合结构域的几个氨基酸(通常不超过10个，更通常地不超过5个残基)的编码序列，而不影响该分子的特异性或效应物结合亲和力。此外，可能期望在转基因编码序列的边界引入少量氨基酸(通常不超过10个，更通常地不超过5个残基)。氨基酸的缺失或插入可以是由于构建、提供方便的限制性位点、易于操作、改善表达水平等的需要而引起的。另外，由于类似的原因，可发生不同氨基酸对一个或多个氨基酸的取代，通常取代不超过5个转基因编码序列(例如，在car的任何结构域中)中的氨基酸。

可以以常规方式制备根据实施方案的转基因构建体。因为在大多数情况下，可使用天然序列，适当时，可分离和操作天然基因，以便允许各种组分的适当联接。例如，在car的情况下，可以通过使用聚合酶链式反应(pcr)，使用合适的引物来分离编码嵌合抗原受体的n末端和c末端蛋白质组分的核酸序列，所述引物导致基因的不需要部分的删除。或者，克隆基因的限制性消化可用于产生嵌合构建体。在任一情况下，可以选择序列来提供平端化的，或具有互补重叠的限制性位点。

用于制备转基因构建体的各种操作可以在体外进行，并且在特定实施方案中，使用标准转化或转染方法将嵌合构建体引入用于在适当宿主中克隆和表达的载体。因此，在每次操作之后，克隆来自dna序列连接的所得构建体，分离载体，筛选序列以确保序列编码所需转基因(例如，嵌合抗原受体)和表达控制序列。可通过限制性分析、测序等来筛选该序列。

实施方案的载体主要被设计来将所需基因递送至免疫细胞，优选免疫效应细胞(例如，t细胞)或apc，使之处于受调节的真核启动子的控制之下。可根据实施方案使用的启动子包括例如mndu3启动子、cmv启动子、ef1α启动子或遍在蛋白启动子。此外，如果没有其他原因，载体可含有选择标记，以便于它们在体外的操作。在其它实施方案中，可以从从dna模板体外转录的mrna表达转基因(例如，car)。

在根据实施方案使用的示例性核酸构建体(多核苷酸)中，将启动子可操作地连接至编码实施方案的转基因的核酸序列，即将它们定位以促进信使rna从编码该转基因的dna转录。启动子可具有基因组来源或是合成产生的。用于t细胞的各种启动子是本领域公知的(例如，marodon等(2003)公开的cd4启动子))。例如，启动子可以是组成型或诱导型的，其中诱导与特定细胞类型或特定成熟水平相关。或者，许多公知的病毒启动子也是合适的。目标启动子包括β-肌动蛋白启动子、sv40早期和晚期启动子、免疫球蛋白启动子、人巨细胞病毒启动子、逆转录病毒启动子和friend脾病灶形成病毒启动子。启动子可以与增强子相关联，也可以不与增强子相关联，其中增强子可天然地与特定启动子或与不同启动子相关联。

编码转基因的开放阅读框的序列可获自基因组dna来源、cdna来源，或可合成(例如，通过pcr)或其组合。取决于基因组dna的大小和内含子的数量，可能希望使用cdna或其组合，因为已发现内含子稳定mrna或提供t细胞特异性表达(barthel和geldfeld，2003)。此外，还可有利的是使用内源或外源非编码区稳定mrna。

为了表达实施方案的转基因，编码转基因的核酸序列的天然存在的或内源转录起始区域可用于在目标宿主中产生嵌合抗原受体。或者，可使用允许组成型或诱导型表达的外源转录起始区(例如，tet-on或tet-off启动子系统)，其中可根据目标宿主、所需表达水平、目标宿主的性质等控制表达。

同样地，在一些情况下，可使用将由转基因编码的多肽引导至细胞表面的信号序列。在一些情况下，信号序列是存在于转基因的天然形式中的信号序列。任选地，在一些情况下，可能需要将该序列与不同的信号序列交换。然而，选定的信号序列应与用于表达转基因的细胞(例如，t细胞)的分泌途径相容，以使得转基因存在于细胞表面。

类似地，终止区可由转基因的天然形式的天然存在或内源转录终止区提供。或者，终止区可来源于不同的来源导。在大多数情况下，终止区的来源通常被认为对于重组蛋白的表达不至关重要的，并且可以使用多种终止区，而不会不利地影响表达。

预期可将转基因构建体，诸如car表达构建体作为裸露dna或于合适的载体中引入受试者自己的细胞(或引入来自不同供体受试者的细胞)。使用裸dna通过电穿孔来稳定转染细胞诸如t细胞的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利第6,410,319号(通过引用并入本文)。裸露dna通常是指以用于表达的正确取向包含在质粒表达载体中的本实施方案的编码转基因(例如，嵌合抗原受体)的dna。有利地，裸露dna的使用可减少产生表达实施方案的转基因的细胞所需的时间。

在另外的方面，可使用基于转座子的系统将转基因构建体引入细胞，以介导转基因(例如，car)构建体整合至细胞的基因组dna中。通常，此类方法将涉及将(i)编码转座酶(或转座酶多肽)的第一载体和(ii)编码侧连转座子重复序列的所需转基因表达元件的第二载体引入细胞。转座子或转座元件包括在其上游和下游具有末端重复序列的(短)核酸序列，并编码有助于将核酸切除并插入靶dna序列的酶。几种转座子/转座酶系统已适用于异源dna序列的遗传插入，包括睡眠美人(sb)，来自鱼的tc1/mariner样元件(其在多种脊椎动物培养细胞系和胚胎干细胞中以及在体内表现出转座活性(ivics等，1997))。在美国专利第6,489,458号、第7,148,203号、第8,227,432号、美国专利公布第2011/0117072号；mates等，2009中和ivics等，1997中(所述专利、专利公布和文献的每一篇通过引用整体并入本文)提供了另外的转座酶和转座子系统。

或者，可使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将转基因引入细胞。根据实施方案的方法使用的合适载体在受试者的细胞中是非复制的。已知大量基于病毒的载体，其中在细胞中维持的病毒拷贝数足够低以维持细胞的存活力。举例说明性载体包括本文公开的pfb-neo载体以及基于hiv、sv40、ebv、hsv或bpv的载体。

iv.免疫效应细胞

在某些方面，本文所述的实施方案包括制备和/或扩增抗原特异性重定向的免疫效应细胞(例如，t细胞、nk细胞或nkt细胞)的方法，其包括用含有编码car的dna(或rna)构建体的表达载体转染细胞，然后，任选地，用饲养细胞、重组抗原或受体的抗体刺激细胞以引起细胞增殖。在某些方面，经工程化以表达car的细胞(或细胞群)是干细胞、ips细胞、免疫细胞或这些细胞的前体。下面描述的方法涉及用于car表达的t细胞(或其它免疫细胞)工程的具体实例。

免疫效应细胞的来源包括同种异体和自体来源。在一些情况下，免疫效应细胞可从干细胞或诱导多能干细胞(ipsc)分化而来。因此，可从脐带血、外周血、人胚胎干细胞或ipsc分离根据实施方案的用于工程的细胞。例如，同种异体t细胞可被修饰来包括嵌合抗原受体(并且任选地，缺乏功能性tcr)。在一些方面，免疫效应细胞是原代人t细胞，诸如来源于人外周血单核细胞(pbmc)的t细胞、用g-csf刺激后收集的pbmc、骨髓或脐带血。转染或转导(例如，利用car表达构建体)后，可立即输注细胞或可以储存细胞。在某些方面，在转染后，可将细胞离体繁殖数天、数周或数月，在基因转移入细胞后约1天、2天、3天、4天、5天或更长时间内繁殖为大量群体。在另外的方面，转染后，克隆转染子，离体扩增显示存在单一整合的或以附加体维持的表达盒或质粒以及表达嵌合抗原受体的克隆。选择用于扩增的克隆显示出特异性识别和裂解表达抗原的靶细胞的能力。重组t细胞可通过用il-2或结合常用γ-链的其它细胞因子(例如，il-7、il-12、il-15、il-21等)刺激来扩增。可通过在人工抗原呈递细胞上刺激扩增重组t细胞。可在人工抗原呈递细胞上，或用与t细胞表面上的cd3交联的抗体(诸如okt3)扩增重组t细胞。可在人工抗原呈递细胞上或用结合t细胞表面上的cd52的抗体(例如campath)删除重组t细胞的亚群。在另一方面，可被冷冻保存遗传修饰的细胞。

在另外的方面，已选择了实施方案的免疫效应细胞的高线粒体备用呼吸容量(src)。如本文中所用，“具有高线粒体src的免疫效应细胞”是指具有比相应的平均免疫效应细胞(例如，t细胞)更高的线粒体活性或线粒体数目的免疫效应细胞(例如，t细胞)。因此，在一些方面，实施方案的细胞组合物包含具有高线粒体src的免疫效应细胞群，例如具有高线粒体src的表达car的t细胞群。

具有高线粒体src的免疫效应细胞(诸如cd8⁺t细胞)可在应激条件(诸如高肿瘤负荷、缺氧、缺乏用于糖酵解的营养物或抑制性细胞因子环境)下相对于具有较低src的细胞表现出增加的存活率。此外，选择用于高线粒体src的免疫效应细胞甚至可在应激条件下保留细胞毒活性。因此，通过选择具有高线粒体src的免疫效应细胞，可产生用于治疗和用于car构建体测试的改善的细胞组合物。

在一个方面，提供了包含可用于测定转基因效应细胞的线粒体src的报告分子的转基因免疫效应细胞。例如，转基因细胞可包含与线粒体定位信号连接的报告多肽。例如，报告子可以是荧光多肽，诸如增强的黄色荧光蛋白(yfp)或增强的绿色荧光蛋白(egfp)，线粒体定位信号可来自谷氧还蛋白(grx2)。在本文中，荧光报告子鉴定了具有高线粒体src的car+t细胞。例如，可基于强度荧光分选表达报告子的转基因细胞，并输注其以在体内杀伤肿瘤。同样地，可测试转基因细胞的靶细胞的离体杀伤，以测定例如候选car多肽的治疗功效。

在一些方面，根据实施方案使用的线粒体报告基因可以是内源基因。在另外的方面，线粒体报告基因可以是外源基因，诸如编码荧光报告蛋白的基因。在一些方面，荧光报告蛋白可包含线粒体定位序列。在某些方面，用于选择具有高src的免疫效应细胞的方法可包括流式细胞术或facs。

在某些方面，用于鉴定具有src的免疫效应细胞的报告基因的表达可处于核启动子(例如，hef1a)的控制之下。在某些方面，报告基因的表达可处于线粒体启动子的控制之下。在某些方面，表达的报告蛋白可包含线粒体定位序列。在某些方面，表达的报告蛋白可被引导至细胞表面。在某些方面，报告基因的表达可处于线粒体启动子的控制之下，并且表达的报告蛋白可被引导至细胞表面。在一些方面，外源报告基因可侧接转座子重复序列或病毒ltr。在一些方面，可将外源报告基因包含在染色体外核酸诸如mrna或附加型载体中。

v.用于繁殖免疫效应细胞的方法

在一些情况下，将实施方案的免疫效应细胞(例如，t细胞)与活化和繁殖细胞(aapc)共培养以帮助细胞扩增。例如，抗原呈递细胞(apc)可用于制备实施方案的治疗性组合物和细胞治疗产品。关于抗原呈递系统的制备和使用的一般指导，参见例如，美国专利第6,225,042号、第6,355,479号、第6,362,001号和第6,790,662号、美国专利申请公布第2009/0017000号和第2009/0004142号，以及国际公布第wo2007/103009号，所述专利或申请公布的每一篇通过引用并入。

在一些情况下，将aapc与最佳长度的肽一起温育，这允许所述肽直接结合于mhc分子而无需额外的加工。或者，细胞可以表达目标抗原(即，在不依赖于mhc的抗原识别的情况下)。此外，在一些情况下，apc可表达通常与特定car多肽或多种car多肽结合的抗体(例如，通用活化和繁殖细胞(uapc))。此类方法公开于国际((pct)专利公布第wo/2014/190273号(其通过引用并入本文)中。除了肽-mhc分子或抗原以外，aapc系统还可包含至少一种外源性辅助分子。可使用辅助分子的任何合适数量和组合。辅助分子可选自多种辅助分子诸如共刺激分子和粘附分子，示例性共刺激分子包括cd70和b7.1(b7.1以前称为b7，也称为cd80)，除其它以外，其与t细胞表面的cd28和/或ctla-4分子结合，从而影响例如t细胞扩增、th1分化、短期t细胞存活和细胞因子分泌，诸如白细胞介素(il)-2(参见kim等，2004)。粘附分子可包括碳水化合物结合糖蛋白，诸如选择蛋白、跨膜结合糖蛋白诸如整联蛋白、钙依赖性蛋白诸如钙粘蛋白，和单次跨膜免疫球蛋白(ig)超家族蛋白，诸如细胞间粘附分子(icam)，其促进，例如，细胞间或细胞与基质的接触。示例性粘附分子包括lfa-3和icam，诸如icam-1。在例如美国专利第6,225,042号、第6,355,479号和第6,362,001号(通过引用并入本文)中例举了用于选择、克隆、制备和表达示范性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术、方法和试剂。

被选择成为aapc的细胞优选在细胞内抗原加工、细胞内肽运输和/或细胞内mhci类或ii类分子-肽负载中具有缺陷，或者是变温的(即，对温度攻击不如哺乳动物胞系敏感)，或具有缺陷和变温特性。优选地，被选择成为aapc的细胞也缺乏表达至少一种针对外源mhci类或ii类分子和被引入细胞的辅助分子组分的内源对应物(例如，如上所述的内源mhci类或ii类分子和/或内源辅助分子)的能力。此外，aapc优选在它们的修饰(以产生aapc)之前保留由细胞具有的缺陷和变温特性。示例性aapc构建与抗原加工(tap)缺陷型细胞系诸如昆虫细胞系相关的转运蛋白或来源于其。示例性变温昆虫细胞系是果蝇细胞系，诸如schneider2细胞系(参见例如schneider1972)。在美国专利第6,225,042号、第6,355,479号和第6,362,001号中提供了用于schneider2细胞的制备、生长和培养的举例说明性方法。

在一个实施方案中，还将aapc经受冻融循环。在示例性的冻融循环中，可通过使含有aapc的合适容器与适量的液氮、固体二氧化碳(即，干冰)或类似的低温材料接触来冷冻aapc，以使得冷冻迅速发生。然后，通过从低温材料中取出aapc并暴露于环境室温条件下，或通过其中使用温水浴或温暖的手以促进较短的解冻时间的促进解冻法来将冷冻的apc解冻。另外，可冷冻aapc，并在解冻之前将其储存延长的时期。还可将冷冻的aapc解冻，然后在进一步使用之前冻干。优选地，在含有经历冻融循环的aapc的介质中不存在可不利地影响冻融过程的防腐剂，诸如二甲基亚砜(dmso)、聚乙二醇(peg)和其它防腐剂，或所述防腐剂基本上被去除，诸如通过将aapc转移至基本上不含此类防腐剂的介质中。

在另外的实施方案中，可通过交联使异种核酸和对于aapc是内源的核酸失活，以使得在灭活后基本上无细胞生长、核酸复制或表达。在一个实施方案中，在外源mhc和辅助分子表达后，在此类分子在aapc表面上呈递后，以及在用所选择的肽或多种肽负载所呈递的mhc分子后的点上灭活aapc。因此，此类灭活和选择的肽负载的aapc，虽然基本上不能增殖或复制，但保留所选择的肽呈递功能。优选地，交联还产生基本上不含污染性微生物诸如细菌和病毒的aapc，而不显著降低aapc的抗原呈递细胞功能。因此，交联维持重要的aapc功能，同时有助于减轻对使用aapc开发的细胞治疗产品的安全性的担忧。关于与交联和aapc相关的方法，参见例如美国专利申请公布第20090017000号，其通过引用并入本文。

在某些情况下，可通过在用作治疗剂之前，使用荧光报告蛋白，使用facs基于它们的线粒体强度(或细胞的总线粒体含量)来分选经car修饰的细胞。

vi.工程化的抗原呈递细胞

在某些实施方案中，还提供了工程化的抗原呈递细胞(apc)。可以例如，如上所述，使用此类细胞来离体繁殖免疫效应细胞。在另外的方面，工程化的acp本身可被施用于患者，从而在体内刺激免疫效应细胞的扩增。实施方案的工程化的apc本身可用作治疗剂。在一些实施方案中，工程化的apc可用作治疗剂，其可刺激对于靶抗原是特异的内源免疫效应细胞的活化和/或增加对于靶抗原是特异的过继转移的免疫效应细胞的活性或持久性。

如本文中所用，术语“工程化的apc”是指包含至少编码人白细胞抗原(hla)的第一转基因的细胞。suvch工程化的apc还可包含用于表达抗原的第二转基因，以使得抗原存在于与hla复合的apc表面上。在一些方面，工程化的apc可以是呈递抗原的细胞类型(例如，树突状细胞)。在另外的方面，可以从通常不呈递抗原的细胞类型(诸如t细胞或t细胞祖细胞(称为“t-apc”))产生工程化的apc。因此，在一些方面，实施方案的工程化的apc包含编码靶抗原的第一转基因和编码hla的第二转基因，以使得hla在与靶抗原的表位复合的工程化的apc表面上表达。在某些特定方面，在工程化的apc中表达的hla是hla-a、hla-b、hla-c或hla-drb1。在另外的方面，在工程化的apc中表达的hla是hla-a2。

在一些方面，实施方案的工程化的apc还可包含至少编码共刺激分子的第三转基因。共刺激分子可以是可为膜结合的cγ细胞因子的共刺激细胞因子。在某些方面，共刺激细胞因子是il-15，诸如膜结合的il-15。在一些其它方面，工程化的apc可包含编辑的(或删除的)基因。例如，可以编辑抑制性基因诸如pd-1、lim-3、ctla-4或tcr，以减少或消除该基因的表达。

实施方案的工程化的apc可包含编码任何目标靶抗原的转基因。例如，靶抗原可为感染性疾病抗原或肿瘤相关抗原(taa)。靶抗原可以是细胞内或细胞表面抗原。例如，在一些方面，靶抗原是taa，诸如源自肿瘤细胞的亚细胞区室的taa。taa可以是膜结合的、细胞质的、核定位的或甚至由肿瘤细胞分泌的。在一些方面，与相应的正常组织相比，taa差异表达，从而允许免疫效应细胞优先识别肿瘤细胞。靶抗原的具体实例包括但不限于wt1、muc1、lmp2、hpve6e7、egfrviii、her-2/neu、独特型、magea3、p53非突变体、ny-eso-1、psma、gd2、cea、melana/mart1、ras突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(pr1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、psa、htert、肉瘤易位断裂点、epha2、pap、ml-iap、afp、epcam、erg(tmprss2ets融合基因)、na17、pax3、alk、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mcn、rhoc、trp-2、gd3、岩藻糖基gm1、间皮素、psca、magea1、sle(a)、cyp1b1、plac1、gm3、boris、tn、globoh、etv6-aml、ny-br-1、rgs5、sart3、stn、碳酸酐酶ix、pax5、ot-tes1、精子蛋白17、lck、hmwmaa、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、legumain、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-1、fap、pdgfr-β、mad-ct-2和fos相关抗原1。

在一些具体方面，实施方案的工程化的apc是被经工程化以用作抗原呈递细胞的t细胞(称为“t-apc”)。具体地，实施方案的t-apc包含编码靶抗原的第一转基因和编码hla的第二转基因。因此，t-apc可以呈现编码的抗原，诸如taa。例如，本文例举的t-apc包含编码ny-es0-1抗原和hla-a2的转基因。因此，这些细胞可用于离体或体内(在被施用于患者之后)繁殖ny-eso-1特异性免疫效应细胞。此外，本文所例举的t-apc可被进一步工程化来表达另外的共刺激分子，特别是膜结合的il-15(mil-15)。所述额外的共刺激分子进一步改善靶抗原特异性免疫效应细胞的产生并增加这些细胞的持久性。

vii.治疗应用

在一些方面，实施方案的嵌合抗原受体构建体和细胞通过减小这些受试者中的肿瘤的尺寸或阻止肿瘤的生长或再生长，应用于患有或怀疑患有癌症的受试者。因此，本文提供的实施方案还涉及这样的方法，所述方法通过将本实施方案的嵌合抗原受体构建体引入受试者的分离的t细胞并将所述转化的t细胞重新引入受试者中(从而实现抗肿瘤反应以减少或消除受试者中的肿瘤)来减少受试者中的肿瘤生长或阻止肿瘤形成。可使用的合适的t细胞包括细胞毒性淋巴细胞(ctl)或具有需要破坏的t细胞受体的任何细胞。如本领域技术人员所公知的，各种方法可容易地获得用于从受试者中分离这些细胞。例如，使用细胞表面标志物表达或使用市售的试剂盒(例如，来自pierce，rockford，ill的isocell^tm)。

一旦确定转染的或转导的免疫效应细胞(例如，t细胞)能够以所需的调节和期望的水平将嵌合抗原受体表达为表面膜蛋白，则可确定嵌合抗原受体在宿主细胞中是否具有提供所需的信号诱导的功能。随后，将所述转导的免疫效应细胞重新引入或施用于受试者以激活受试者中的抗肿瘤反应。为了便于施用，可用还可以是药学上可接受的适当的载体或稀释剂将根据实施方案的转导的t细胞制备成药物组合物或制成适于在体内施用的植入物。制备此类组合物或植入物的方法已在本领域中进行了描述(参见例如，remington′spharmaceuticalsciences，第16版，mack，编辑(1980))。适当时，可以以通常的方式将转导的t细胞配制成半固体或液体形式的制剂，诸如胶囊、溶液、注射剂、吸入剂或气溶胶。本领域已知的方法可用于在其到达靶组织或器官之前防止或最小化组合物的释放和吸收，或确保组合物的定时释放。然而，理想地使用不会影响表达嵌合抗原受体的细胞的药学上可接受的形式。因此，理想地，可将转导的t细胞制成含有平衡盐溶液，优选hanks平衡盐溶液或生理盐水的药物组合物。

在某些实施方案中，将实施方案的表达car的细胞递送至有此需要的个体，诸如患有癌症或感染的个体。然后细胞增强个体的免疫系统以攻击相应的癌症或病原体感染的细胞。在一些情况下，给个体提供一个或多个剂量的抗原特异性car细胞。在其中给个体提供两个或更多个剂量的抗原特异性car细胞的情况下，施用之间的持续时间应足以允许在个体中繁殖的时间，并且在具体实施方案中，剂量之间的持续时间为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更多天。用于获得治疗作用的合适剂量为例如优选在一系列给药周期中每剂量至少10⁵个或约10⁵个至约10¹⁰个细胞。示例性给药方案由4个一周的递增剂量的给药周期组成，始于第0天的至少约10⁵个细胞，例如在起始患者内剂量递增方案的数周内逐渐增加至高达约10¹⁰个细胞的目标剂量。合适的施用模式包括静脉内、皮下、腔内(例如通过储存器进入装置)、腹膜内注射和至肿瘤块内的直接注射。

实施方案的药物组合物(例如，包含表达car的t细胞)可以单独使用或与用于治疗癌症的其它良好建立的试剂组合使用。无论单独递送还是与其它药物组合递送，实施方案的药物组合物可通过各种途径递送至哺乳动物，特别是人体内的各个部位，以获得特定作用。本领域技术人员将认识到，尽管可使用不止一种途径来施用，但特定途径可提供比另一种途径更直接且更有效的反应。例如，真皮内递送可用于治疗黑素瘤。局部或全身性递送可通过将制剂施用(包括敷用或滴注)入体腔、吸入或吹入气雾剂，或通过肠胃外导入(包括肌内、静脉内、肝门静脉内、肝内、腹膜、皮下或真皮内施用)来实现。

实施方案的组合物可以以单位剂量形式提供，其中每个剂量单位，例如注射液，单独地或与其它活性剂适当组合地含有预定量的组合物。本文所用的术语单位剂型是指适合作为人和动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位单独地或与其它活性剂组合地含有预定量(以足以在适当的情况下与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物结合产生所需作用的量计算的)的实施方案的组合物。实施方案的新型单位剂型的规格取决于特定受试者中的与药物组合物相关的特定药效学。

理想地，有效量或足够数量的分离的转导的t细胞存在于组合物中并被引入受试者中，以使得建立长期特异性的抗肿瘤反应来减少肿瘤的尺寸或消除肿瘤增长或再生长，否则将不产生此类治疗。理想地，当与其中不存在转导的t细胞的在其它方面相同的条件相比，重新引入到受试者中的转导的t细胞的量导致肿瘤尺寸的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％减小。如本文中所用，术语“抗肿瘤有效量”是指减少受试者的癌细胞或肿瘤生长的表达car的免疫效应细胞的有效量。

因此，所施用的转导的免疫效应细胞(例如，t细胞)的量应考虑给药途径，并且应当使得足够数量的转导的免疫效应细胞被引入以达到所需的治疗反应。此外，包含在本文所述的组合物中的每种活性剂的量(例如，每待接触的每种细胞的量或每一定体重的量)可在不同的应用中变化。通常，转导的t细胞的浓度理想地应该足以在被治疗的受试者中提供至少约1×10⁶至1×10⁹个转导的t细胞，甚至更理想地，约1×10⁷至约5×10⁸个转导的t细胞，虽然可使用高于，例如大于5×10⁸个细胞，或低于，例如小于1×10⁷个细胞的任何合适的量。给药方案可基于良好建立的基于细胞的疗法(参见例如，topalian和rosenberg，1987；美国专利第4,690,915号)，或者可采用替代的连续输注策略。

这些值提供了在优化实施方案的方法时由实践者使用的转导的t细胞的范围的一般指导。此类范围在本文中的引述绝不排除较高或较低量的组分的使用，这在特定应用中可能是有必要的。例如，实际剂量和时间安排可取决于组合物是否与其它药物组合物组合施用，或取决于药代动力学、药物处置和代谢的个体差异而变化。本领域技术人员可以根据特定情况的紧急情况进行任何必要的调整。

vii.实施方案的试剂盒

可将本文所述的任何组合物包含在试剂盒中。在一些实施方案中，在试剂盒中提供同种异体cart细胞，所述试剂盒还可包括适合于扩增细胞的试剂，诸如培养基、apc、工程化的apc、生长因子、抗体(例如，用于分选或表征cart细胞)和/或编码转基因诸如靶抗原、hla、线粒体报告子、car或转座酶的质粒。

在非限制性实例中，嵌合抗原受体表达构建体、用于产生嵌合抗原受体表达构建体的一种或多种试剂、用于表达构建体的转染的细胞和/或获得用于表达构建体的转染的同种异体细胞的一种或多种仪器(此类仪器可以是注射器、移液管、镊子和/或任何此类医学上认可的装置)。

在一些实施方案中，在试剂盒中提供了用于消除内源性tcrα/β表达的表达构建体，产生构建体的一种或多种试剂，和/或在试剂盒中提供了car+t细胞。在一些实施方案中，包括编码锌指核酸酶的表达构建体。

在一些方面，试剂盒包含用于细胞的电穿孔的试剂或装置。

试剂盒可包含一种或多种适当等分的实施方案的组合物或产生实施方案的组合物的试剂。可将试剂盒的组分包装在水性介质中或以冻干形式包装其。试剂盒的容器装置可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置，其中可以放置组分(优选适当地等分的)。当试剂盒中存在不止一种组分时，则试剂盒通常还将含有第二、第三或其它附加容器，可将附加组分分开放置在所述容器中。然而，可将组分的各种组合包含在小瓶中。实施方案的试剂盒通常还将包括用于容纳嵌合抗原受体构建体的装置和用于商业销售的严密封闭的任何其它试剂容器。此类容器可包括例如注射或吹塑塑料容器(将所需小瓶保留在其中)。

viii.实施例

通过参考以下实施例进一步详细描述本发明的实施方案。提供这些实施例仅是为了说明的目的，并且除非另有说明，否则不旨在限制。因此，本发明绝不应被解释为限于以下实施例，而应理解为包括由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。

实施例1-fc受体对car的结合与快速cart细胞清除有关

研究了fc受体与car多肽结合在cart细胞持久性中的作用。对于初步研究，研究了被靶向cd19受体的car构建体。cart细胞表达cd19rcd28构建体，其包含cd19结合结构域(vl/vh)、铰链结构域(igg4-fc)、跨膜结构域(cd28tm)和细胞内信号传导结构域(cd28-cd3ζ)(参见图1)。使用介导构建体的基因组整合(参见例如，国际(pct)申请第pct/us14/38005号，通过引用并入本文)的基于睡美人的转座子系统(sleepingbeauty-basedtransposonsystem)，经由电穿孔将car构建体引入细胞。然后通过流式细胞术分析产生的cart细胞以评估car多肽表达。发现car多肽在转染后高效表达，并且在与k562aapc共培养28天后，高比例的所得细胞群对于car表达呈阳性(图2a)。流式细胞术研究还表明，一部分cart细胞在体外被fcγr2a结合，表明fc受体的结合可能在体内影响casrt细胞，并且可在持久性cart细胞中起作用。

也在携带cd19阳性肿瘤的小鼠中完成了研究。简言之，用海肾荧光素酶(hrluc)⁺nalm6肿瘤细胞注射nsg小鼠，然后单次注射cd19rcd28t细胞(或对照注射)。经由随时间推移的成像测量与肿瘤细胞相关的生物发光。如图3a-b所示，虽然cart细胞最初能够控制肿瘤生长(第21天时间点)，但在注射后第28天，即使在处理的动物中，肿瘤的外生长也是非常明显的。该作用可能与例如因fcr结合引起的t细胞的体内持久性相关。因此，通过包含fc受体结合元件，可以限制car多肽的体内持久性(和潜在毒性)。

实施例2-具有减少的fc受体结合的car多肽

已产生不同cart细胞构建体的阵列来调节fc受体与cart细胞的结合。测试的构建体示于图4中。具体地，在许多不同的跨膜和细胞内/信号传导结构域的背景中测试了不同的铰链序列。图5中所示的流式细胞术研究表明，所有测试的构建体在转染的t细胞(如上所述，通过电穿孔，使用用于整合car受体构建体的基于睡美人的转座子系统完成转染、)中高效表达。同样地，在与k562aapc共培养28天后，高比例的所得t细胞呈car受体阳性(图5)。与k562aapc共培养的cart细胞扩增的动力学示于图7中，并证明所有cart细胞以相似的效率扩增。

接下来，通过流式细胞术测试cart细胞的体外fc受体结合。如图6所示，当包含人igg4铰链序列的cart细胞被fc受体(具体地被fcγr2a)结合时，表达具有l235e和n297q取代的突变型igg4铰链的细胞显示出显著更少的对fc受体的结合。

然后评估表达每种测试的car构建体的cart细胞的靶向cd19阳性肿瘤细胞的能力。在图8-9所示的研究中，在离体实验中测试cart细胞裂解靶细胞(图8)或响应于靶细胞产生ifnγ(图9)的能力。在这些研究之后进行体内实验，以测定各种cart细胞控制小鼠中的外植肿瘤的外生长的功效。简言之，如上所述，用肿瘤(hrluc+nalm-6)注射(i.v.)nsg小鼠，然后在第二天用螟娥萤火虫(p.pyralis)荧光素酶(ffluc)+car+t细胞注射(i.c.)所述小鼠。在使用ivis100系列系统分别注射enduren或荧光素后进行肿瘤和t细胞成像。小鼠的成像示于图10中。在每种情况下，在施用后立即对t细胞成像以确认心内注射(顶行)。阴影图像表示来自肿瘤来源的hrluc活性随时间推移的光子通量。也将来自这些研究的发光数据绘图，并将其示于图11中。最后，图12显示了描绘用各种cart细胞处理的nsg小鼠的存活曲线的图。这些研究的结果表明，与携带野生型igg4铰链序列的cart-细胞相比，表达减少fc受体结合的构建体(即，eq突变型igg4铰链、cd8a铰链或12个氨基酸的间隔子铰链)的cart细胞中的每一种具有更大的功效。具体地，这些构建体在小鼠中显示改善的对肿瘤细胞生长的控制，并延长了治疗的动物的存活时间。因此，这些研究表明，通过减少fc受体结合，可以显著增强cart细胞的体内持久性和抗肿瘤功效。

实施例3-附加的car结构研究

使用被靶向cd19受体的car构建体进行附加研究。与初始研究相似，用cd19r*cd28或cd19rcd8cd28转座子及sb11转座酶对pbmc进行电穿孔，并在7天的刺激周期中与il-2和il-21一起在经辐照的克隆1上共培养28天。在每个刺激周期结束时，对细胞进行计数和表型分型(cd3，car)(图13a-d)。

在这些研究之后进行体内实验以在nsg(nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1wjl/szj，nodscidγ)小鼠中针测定各种cart细胞针对cd19⁺nalm-6细胞系的功效。研究了最小残留疾病(mrd)模型和建立的肿瘤模型两者。在mrd模型中，在第0天注射10⁴个细胞的hrluc⁺mkate⁺nalm-6注射nsg小鼠，然后在第1天心肌内注射t细胞(10⁷/小鼠)。随时间的推移，使用enduren活细胞基质，通过来源于hrluc⁺nalm-6的生物发光成像评价肿瘤负荷(图14a)。在建立的肿瘤模型中，在第0天向nsg小鼠注射1.5x10⁴个ffluc⁺egfp⁺nalm-6，并将肿瘤移植5天，评价肿瘤负荷，并在第6天心内注射t细胞(10⁷/小鼠)。随时间的推移，使用d-荧光素底物，使用来自ffluc⁺nalm-6的生物发光成像计算肿瘤通量。显示了表示随时间推移的光子通量和肿瘤通量的伪彩图像(图14c)。也将这些研究的发光数据绘图，并对于每一个模型分别将其示于图14b和14d中。

实施例4-mil-15共表达cart细胞功效和持久性的作用

在自体或同种异体小鼠模型中进行cart细胞输注后，监测细胞因子il-2、il-4、il-7、il-9和il-15的水平。探究另外的信号传导构建体以改善持久性。图15显示膜结合的il-15/il-15受体(mil15)构建体。将mil-15构建体与car在t细胞中共表达。图16中的数据(参见例如，左图)显示car和mil15在绝大多数电穿孔的细胞上共表达。图16中呈现的另外的数据表明，当与car共表达时，mil-15能够在抗原撤出后使cart细胞在培养中免于下降(参见图16，右上图)。

随后在体内确认表明car-mil-15t细胞的持久性增强的细胞培养结果。对于这些研究，向小鼠注射表达单独的car或与mil-15组合的car的ffluc+t细胞。注射荧光素后进行t细胞成像。如图17b所示，mil-15-cart细胞在体内表现出延长的持久性。进一步的体内研究检查了表达mil-15的cart细胞在控制肿瘤生长方面的有效性。这些研究使用已建立的肿瘤模型来完成，并且在肿瘤植入(i.v.注射的)6天后，如所指示的，注射(i.c.)遗传修饰的t细胞。

实施例5-t细胞的遗传修饰

离体繁殖t细胞以用作抗原呈递细胞(t-apc)来呈递肿瘤相关抗原(taa)ny-eso-1。睡美人(sb)系统(hackett等，2010)适应于遗传修饰t细胞(图20)(cooper等，2005)。这涉及两个步骤：(i)表达sb转座子[即，重定向t细胞特异性的嵌合抗原受体(car)(jin等，2011；kebriaei等，2012)]和sb转座酶的dna质粒的电转移和(ii)在共表达cd64(fc受体)、cd86、cd137l和膜结合的白细胞介素(il)-15的突变蛋白(mil-15，图21)的来源于k562细胞系的设计者人工抗原呈递细胞(aapc)上稳定表达整合体的t细胞的繁殖和扩增。为了强化ny-eso-1免疫原的表达，用潮霉素选择培养物中的t-apc，因为质粒sb表达盒共表达潮霉素磷酸转移酶(hy)与胸苷激酶(hytk)的融合物(图20)。在杀细菌浓度的潮霉素b存在的情况下，通过用经γ辐照的负载有okt3的aapc连续刺激来繁殖遗传修饰的t细胞(图20)。通过使用病毒抗原甲型流感mp1，t细胞可在体外和体内用作t-apc(cooper等，2005)。在该实施例中，将t细胞工程化以表达ny-eso-1(融合至flag标记的hytk)(图22)，并在人工抗原呈递细胞(aapc)(图26)存在的情况下，使用sb系统繁殖ny-eso-1⁺mil-15⁺hla-a2⁺t-apc(hackett等，2010)。

实施例6-评价工程化的t细胞

本文所述实施方案的mil15⁺ny-eso-1⁺t-apc，当与pbmc共培养时，能够产生ny-eso-1五聚体阳性t细胞，并且能够扩增能够在体外杀死骨髓瘤细胞的ny-eso-1⁺cart细胞(图23和24)。然而，来自t-apc的cd137l活化的不存在以及来自lag3表达的增加的抑制可能已导致共培养3周后观察到的减弱的反应(图25)。lag3表达随着t-apc的每次刺激而增加，并且可以是耗尽的替代物。

图28进一步说明这些结果，所述结果显示ny-eso-1特异性tcr⁺和car⁺t细胞对ny-eso-1⁺u266人多发性骨髓瘤细胞系的杀伤。在来源于k562的人工活化和繁殖细胞(aapc)上扩增t细胞，并且所述t细胞表达hla-a02和ny-eso-1⁺。所显示的数据代表两个独立实验，其中繁殖9-2-15的ny-eso-1特异性cart细胞，用hla-a2/ny-eso-1t-apc刺激3次，并用衍生的aapck562刺激2次。9-2-15car含有cd8α茎，而先前的car含有igg4茎。增加的刺激导致骨髓瘤细胞的裂解增加。

还评价ny-eso-1⁺mil-15⁺hla-a2⁺t-apc的呈现taa的能力。这通过pbmc与自体t细胞的共培养来实现，所述自体t细胞先前已被遗传修饰来表达ny-eso-1特异性αβtcr。使用t-apc成功地在数值上扩增ny-eso-1五聚体⁺t细胞。类似地，还修饰了k562来源的aapc以呈现ny-eso-1，并将其用于选择性地活化和繁殖ny-eso-1特异性遗传修饰的t细胞(作为阳性对照)。该阳性对照不能像t-apc那样在pbmc中诱导免疫。还在hla的背景中研究了使用识别ny-eso-1来源的肽的嵌合抗原受体(car)来重定向t细胞的特异性。t-apc能够成功地扩增cart细胞以及阳性对照k562来源的aapc(图27)。

实施例7-src/线粒体强度的测定

所有细胞(癌细胞和原代细胞)均具有响应于可用代谢物将它们的线粒体从正统构型转换至缩合状态以及反之亦然的能力(krauss等，2001)。与在类似的离体培养条件下生长的模拟电穿孔的对照t细胞相比，在经car-修饰的t细胞中，线粒体形状是不同的(图29a和29b)。当在共刺激不存在的情况下，将用cd28信号传导结构域修饰的t细胞与用cd137t细胞信号传导结构域修饰的细胞进行比较时，某些经car-修饰的t细胞具有缩合状态线粒体的观察变得惊人(图30)。因此，离体生长的未修饰和经修饰的t细胞的代谢需求和消耗模式是不同的，并且当在特异性共刺激不存在的情况下离体繁殖细胞时变得突出。与此同时，在小鼠模型中显示，在cd8+t细胞中维持线粒体功能和src(备用呼吸容量)对感染后稳定的cd8⁺记忆t细胞形成是关键的(pearce等，2013；vanderwindt等，2012)。src被描述为可用于在细胞中在增加的工作或应激的条件下产生能量的额外线粒体容量，并且被认为对于长期细胞存活和功能是重要的。在体外进行了一系列实验以确定具有高线粒体强度的t细胞与具有规律线粒体质量的t细胞相比，是否能够更好地存活，从而在体内更有效。

遗传修饰t细胞以表达荧光报告蛋白。使用如前所述的睡美人介导的转座(rushworth等，2014)，开发荧光报告蛋白eyfp-grx2(图31)并在t细胞上表达。质粒eyfp-grx2-sb编码在hef1a启动子控制下表达的融合蛋白eyfp-mito，将所述质粒全部嵌入睡美人(sb)载体主链中。sb载体ir/dr序列有助于由从第二质粒pcmv-kan-sb11表达的酶sb11(转座酶)引导的编码具有线粒体定位序列(grx2)的荧光蛋白的转基因的转座。与荧光蛋白报告子和sb11一起，再表达两种质粒，一种质粒编码对于肿瘤相关抗原(诸如her1-3、ror1、cd19或cd123)是特异的嵌合抗原受体(car)，且一种质粒含有与将荧光蛋白引导至细胞核的核定位序列(nls)融合的第二荧光蛋白mcherry(即，mcherry-nls-sb)。使用人t-细胞核转染试剂盒(amaxa/lonza)和电穿孔装置(lonza)，通过电穿孔将所有组合的四种质粒递送至细胞。表达荧光蛋白质粒的载体图的示意图描绘于图31中。

car⁺t细胞的产生。通过sb介导的转座和dna转移(通过对pbmc来源的t细胞电穿孔进行的)的类似方法产生靶向特异性肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体阳性t细胞。设计具有靶向b细胞恶性肿瘤上的cd19和/或ror1、白血病干细胞(急性髓样白血病)上的cd123或egfr阳性乳腺癌上的her1-3的特异性的car+t细胞，并通过电穿孔的类似方法将其在t细胞上表达。每个car被设计来含有t细胞共刺激胞内结构域cd28或4-1bb(cd137)以及cd3z。每个car含有经修饰的igg4-fc茎，其用作支架来在细胞表面上突出与t细胞信号传导胞内结构域融合的scfv。使用fc-茎特异性抗体确认car在t细胞表面上的表达。

设计和产生car种类的方法(参见例如，国际(pct)专利公布第wo/2015/123642号，其通过引用并入本文)是已知的，但预测哪些体外或动物试验将鉴定出在人中输注时具有优异治疗潜力的car设计仍然是一个挑战。目前，研究者通常依赖于以下测试的阵列来推进用于诊所的car结构：对活化诱导的细胞死亡(aicd)和car介导的增殖的抗性、杀伤和细胞因子产生。本文中教授的是鉴定可具有改善的治疗潜力的car设计的单一测试。cd8⁺记忆t细胞(但非cd8⁺效应t细胞)具有显著的线粒体备用呼吸容量(src)。记忆细胞，与效应细胞不同，具有独特组的代谢需求。在高肿瘤负荷期间应激增加的情况下，遗传修饰的t细胞的线粒体从正统结构转换为缩合形式(图29b和33a-33b)。然而，只有一些细胞保留了转换回原始正统线粒体结构的灵活性，这是t效应细胞的性能特征(characteristicfeature)。具有高线粒体src的t细胞能够在与高肿瘤负荷相关的不利条件(诸例如缺氧、缺乏用于糖酵解的营养物和抑制性细胞因子环境)下存活，但仍然可以保留它们的细胞毒性能力(图34)。此类细胞毒性t细胞在本文中被定义为“高能细胞”，其可以是体内肿瘤的最佳系列杀伤剂。

car⁺t细胞的离体扩增。将car-t细胞与表达car特异性配体(2d3scfv，参见例如，pct申请第pct/us2014/039365号)的经辐照的k562hla^cneg细胞一起共同培养，并且外源性添加il2但不存在共刺激(rushworth等，2014)。在car-t细胞的遗传修饰后，以1∶2(1car-t细胞：2aapc)的比例添加经辐照的、活化和繁殖的(aapc)饲养细胞(图30)。

鉴定并在数值上扩增了可在人体试验中长期体内存活的具有代谢活性的高能car⁺t细胞。这通过使用介导基因转移的睡美人(sb)系统来实现。在经辐照的“通用”活化和繁殖细胞(k562-uapc)上共同培养已经历从sb系统(编码car和sb转座酶)进行的两种dna质粒的电转移的t细胞。为了鉴定具有参与“高能”代谢的能力的遗传修饰的t细胞，同时也对命名为eyfp-grx2-sb的第三sbdna种类进行电穿孔。该sb转座子表达融合蛋白eyfp-2a-grx2并含有线粒体定位序列。荧光报告子鉴定了具有额外线粒体备用呼吸容量(src)的car⁺t细胞。这些细胞可基于eyfp荧光的强度来分选，并将其输注以用于体内肿瘤杀伤。

流式细胞术。按照标准分选程序在lsr-fortessa流式细胞仪(bd)上基于eyfp的内源表达，分选car-t的高线粒体强度，而无需任何染色标志物(图32)。

显微术。将经car修饰的细胞固定在1％多聚甲醛溶液中，并使用标准程序通过透射电子显微术进行分析。使用leicadmi6000倒置荧光显微镜和metamorph成像软件(7.8版)定量经car修饰的和未修饰的t细胞的荧光强度，以确定高线粒体强度的经car修饰的t细胞(et-细胞)是否具有额外的线粒体备用呼吸容量(图35、36、37a和37b)。

具有高eyfp表达的car可具有旁路细胞凋亡、上调car⁺t细胞中的抗凋亡基因的必要特征，并且在体内持久以达到临床相关的抗肿瘤作用。可能期望从电转移的体外转录的mrna种类瞬时表达报告基因和/或表达可用于顺磁珠基选择的细胞表面分子(例如，截短的神经生长因子受体)。代替针对某些car设计的人应用的排序，该方法提供了一种途径，通过该途径可在体外筛选大量不同的car分子(例如，如由ez-car系统产生的)的报告基因(例如，eyfp)的共同表达，从而基于期望的线粒体src选择所述car分子。

实施例8-4-1bb(cd137)介导的t细胞信号传导

car⁺t细胞的基因修饰和离体繁殖引起改变的线粒体代谢，并且4-1bb介导的t细胞信号传导促进car⁺t细胞在有挑战性的培养环境中更好地存活。

比较靶向ror1或her1-3的两种不同的car，以测定信号传导结构域对限制性培养条件下的car-t细胞生长的作用。如前所述，在睡美人(sb)载体主链上建立car构建体。car在各自的载体构建体中使用cd28-cd3z信号传导结构域或cd137(4-1bb)-cd3z信号传导结构域。除了靶向单独的肿瘤抗原之外，car主链如先前针对cd19特异性car所述的还保持不变，所述cd19特异性car利用靶向肿瘤抗原的小鼠scfv和人igg4fc来源的茎连接car与跨膜和信号传导结构域。先前已描述了靶抗原，即cll上的ror1(deniger等，plosone，2015)和乳腺肿瘤上的her1-3(jena等，ash，2014)。在sb介导的基因修饰之后，在经辐照的通用活化和繁殖细胞上繁殖car-t细胞(uapc；rushworth等，jimmunothrer.2014)。如实施例7中所述，研究car-t细胞的生长动力学、线粒体结构和线粒体形态学。

与cd137-cd3z信号传导相比，含有cd28-cd3z信号传导的car-t细胞的生长和存活较差，与所用的转座子负载或靶抗原无关(图38和39)。在本研究中共测试了总共3种不同的car，即含有cd28z或cd137z信号传导的cd19-car、her1-3car、ror1⁺car。在通用aapc上活化并扩增所有car，其中t细胞仅通过car-茎经由嵌合在k562细胞上的scfv配体进行信号传导。在特异性共刺激不存在的情况下，含有cd28信号传导的car-t细胞迅速进行细胞凋亡，而含有cd137z信号传导的car-t细胞持续更长的时间，并且始终显示增加的线粒体质量(通过共焦显微术观察到高eyfp强度)。

在cd28z-car-t细胞中线粒体数量很少且几乎没有分布，而cd137z-car-t细胞记录了更亮和更高水平的eyfp信号。这证明了线粒体的高备用呼吸容量(src)，并提供了cd137z-cart细胞在限制性培养环境中存活的机理证据。

***

虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将会想到许多变型、变化和替代。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且在这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构由些覆盖。

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序列表

<110>得克萨斯州大学系统董事会

<120>基因修饰的免疫效应细胞和用于扩增免疫效应细胞的工程化的细胞

<130>utfc.p1251wo

<140>未知的

<141>2015-11-05

<150>us62/075,561

<151>2014-11-05

<150>us62/075,642

<151>2014-11-05

<150>us62/075,667

<151>2014-11-05

<150>us62/169,979

<151>2015-06-02

<160>28

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>230

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成igg4fc区

<400>1

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151015

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<212>prt

<213>智人

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<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成igg4铰链区

<400>3

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1510

<210>4

<211>422

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<213>人工序列

<220>

<223>合成il-15-il-15受体融合物

<400>4

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<213>人工序列

<220>

<223>合成vl结构域

<400>6

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<223>whitlow接头肽

<400>7

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151015

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<213>智人

<400>11

phetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrserleu

151015

leuvalthrvalalapheileilephetrpvalargserlysargser

202530

argleuleuhisserasptyrmetasnmetthrproargargprogly

354045

prothrarglyshistyrglnprotyralaproproargasppheala

505560

alatyrargser

<210>12

<211>68

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成cd28跨膜结构域

<400>12

phetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrserleu

151015

leuvalthrvalalapheileilephetrpvalargserlysargser

202530

argglyglyhisserasptyrmetasnmetthrproargargprogly

354045

prothrarglyshistyrglnprotyralaproproargasppheala

505560

alatyrargser

<210>13

<211>112

<212>prt

<213>智人

<400>13

argvallyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglngly

151015

glnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyr

202530

aspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylys

354045

proargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlys

505560

asplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluarg

65707580

argargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthrala

859095

thrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg

100105110

<210>14

<211>27

<212>prt

<213>智人

<400>14

phetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrserleu

151015

leuvalthrvalalapheileilephetrpval

2025

<210>15

<211>42

<212>prt

<213>智人

<400>15

lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet

151015

argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe

202530

proglugluglugluglyglycysgluleu

3540

<210>16

<211>41

<212>prt

<213>智人

<400>16

argserlysargserargleuleuhisserasptyrmetasnmetthr

151015

proargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyralapro

202530

proargaspphealaalatyrargser

3540

<210>17

<211>41

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成cd28细胞质结构域

<400>17

argserlysargserargglyglyhisserasptyrmetasnmetthr

151015

proargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyralapro

202530

proargaspphealaalatyrargser

3540

<210>18

<211>12

<212>prt

<213>智人

<400>18

gluserlystyrglyproprocysprosercyspro

1510

<210>19

<211>32

<212>prt

<213>智人

<400>19

phealacysaspiletyriletrpalaproleualaglythrcysgly

151015

valleuleuleuserleuvalilethrleutyrcysasnhisargasn

202530

<210>20

<211>43

<212>prt

<213>智人

<400>20

lysprothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothr

151015

ilealaserglnproleuserleuargproglualacysargproala

202530

alaglyglyalavalhisthrargglyleuasp

3540

<210>21

<211>2037

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成car寡核苷酸

<400>21

atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgtgagctgccccaccccgcctttctgctg60

atcccccagtccgagctgacccagcccagatccgtgtccggctccccaggccagtccgtg120

accatctcctgcaccggcaccgagagggacgtgggcggctacaactacgtgtcctggtat180

cagcagcaccccggcaaggcccccaagctgatcatccacgacgtgatcgagaggtcctcc240

ggcgtgcccgacaggttctccggctccaagtccggcaacaccgcctccctgaccatcagc300

ggactgcaggccgaggacgaggccgactactactgctggtccttcgctggcggctactac360

gtgttcggcaccggaaccgacgtgaccgtgctgggcagcacctccggcagcggcaagcct420

ggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaagtgcagctgctggaatccggcggaggactg480

gtgcagccaggcggctccctgagactgtcttgcgccgcctccggcttcaccttctccacc540

taccagatgtcctgggtgcgccaggccccaggcaagggcctggaatgggtgtccggaatc600

gtgtcctctggcggctccaccgcctacgccgactccgtgaagggcaggttcaccatctcc660

agagacaactccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgagggccgaggacacc720

gccgtgtactactgtgccggcgagctgctgccctactacggcatggacgtgtggggccag780

ggcaccaccgtgaccgtgtcctccgagagcaagtacggccctccctgccccccttgccct840

gcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacacc900

ctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggac960

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ccccgggaggagcagttcaatagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcac1080

caggactggctgaacggcaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaagggcctgcccagc1140

agcatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctcgggagccccaggtgtacacc1200

ctgccccctagccaagaggagatgaccaagaatcaggtgtccctgacctgcctggtgaag1260

ggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaac1320

tacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaggctg1380

accgtggacaagagccggtggcaggagggcaacgtctttagctgctccgtgatgcacgag1440

gccctgcacaaccactacacccagaagagcctgtccctgagcctgggcaagatgttctgg1500

gtgctggtcgtggtgggtggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttc1560

atcatcttttgggtgaagagaggccggaagaaactgctgtacatcttcaagcagcccttc1620

atgcggcccgtgcagaccacccaggaagaggacggctgcagctgccggttccccgaggaa1680

gaggaaggcggctgcgaactgcgggtgaagttcagccggagcgccgacgcccctgcctac1740

cagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggccggagggaggagtacgac1800

gtgctggacaagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagccccggagaaagaac1860

cctcaggagggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgag1920

atcggcatgaagggcgagcggcggaggggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctg1980

agcaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccaga2037

<210>22

<211>679

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成car多肽

<400>22

metleuleuleuvalthrserleuleuleucysgluleuprohispro

151015

alapheleuleuileproglnsergluleuthrglnproargserval

202530

serglyserproglyglnservalthrilesercysthrglythrglu

354045

argaspvalglyglytyrasntyrvalsertrptyrglnglnhispro

505560

glylysalaprolysleuileilehisaspvalilegluargserser

65707580

glyvalproaspargpheserglyserlysserglyasnthralaser

859095

leuthrileserglyleuglnalagluaspglualaasptyrtyrcys

100105110

trpserphealaglyglytyrtyrvalpheglythrglythraspval

115120125

thrvalleuglyserthrserglyserglylysproglyserglyglu

130135140

glyserthrlysglygluvalglnleuleugluserglyglyglyleu

145150155160

valglnproglyglyserleuargleusercysalaalaserglyphe

165170175

thrpheserthrtyrglnmetsertrpvalargglnalaproglylys

180185190

glyleuglutrpvalserglyilevalserserglyglyserthrala

195200205

tyralaaspservallysglyargphethrileserargaspasnser

210215220

lysasnthrleutyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthr

225230235240

alavaltyrtyrcysalaglygluleuleuprotyrtyrglymetasp

245250255

valtrpglyglnglythrthrvalthrvalsersergluserlystyr

260265270

glyproprocysproprocysproalaproglupheleuglyglypro

275280285

servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser

290295300

argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserglngluasp

305310315320

progluvalglnpheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn

325330335

alalysthrlysproargglugluglnpheasnserthrtyrargval

340345350

valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu

355360365

tyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproserserileglulys

370375380

thrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthr

385390395400

leuproproserglngluglumetthrlysasnglnvalserleuthr

405410415

cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu

420425430

serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu

435440445

aspseraspglyserphepheleutyrserargleuthrvalasplys

450455460

serargtrpglngluglyasnvalphesercysservalmethisglu

465470475480

alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserleugly

485490495

lysmetphetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyr

500505510

serleuleuvalthrvalalapheileilephetrpvallysarggly

515520525

arglyslysleuleutyrilephelysglnprophemetargproval

530535540

glnthrthrglnglugluaspglycyssercysargpheprogluglu

545550555560

glugluglyglycysgluleuargvallyspheserargseralaasp

565570575

alaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyrasngluleuasn

580585590

leuglyargarggluglutyraspvalleuasplysargargglyarg

595600605

aspproglumetglyglylysproargarglysasnproglnglugly

610615620

leutyrasngluleuglnlysasplysmetalaglualatyrserglu

625630635640

ileglymetlysglygluargargargglylysglyhisaspglyleu

645650655

tyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyraspalaleuhis

660665670

metglnalaleuproproarg

675

<210>23

<211>1488

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成car寡核苷酸

<400>23