本发明涉及一种药物组合物，具体涉及抗耐药真菌的药物组合物。
背景技术：
白色念珠菌是临床最常见的机会致病性真菌，约占所有医院真菌感染的50-60％。系统性念珠菌感染死亡率高达38％。作为机会致病菌，白念珠菌感染主要发生在免疫功能低下的人群，如艾滋病患者、肿瘤放化疗、糖尿病和使用免疫抑制剂的患者。氟康唑为广谱抗真菌药，因其生物利用度高、体内分布广、不良反应少、价格便宜，是临床治疗念珠菌感染的一线用药。现在白念珠菌90％的菌株具有不同程度的耐药性，成为临床上治疗失败的主要原因。
来氟米特(1eflunormide，LEF)是一种具有抗增殖作用的异唑类免疫调节剂，它通过抑制嘧啶从头合成途径中二氢乳酸脱氢酶(DHODH)的活性从而影响嘧啶的合成，使增生活跃的T、B淋巴细胞等受到抑制，减少免疫球蛋白的产生，阻止IL-1、IL-6、TNF-α的释放，抑制免疫性炎症反应，防止骨破坏，改善患者的生活质量。目前，来氟米特已经在风湿病得到广泛应用，疗效肯定。最近的研究显示，来氟米特是目前中国国内治疗类风湿关节炎使用率最高的抗风湿药。
重症细菌感染及系统性真菌感染是影响风湿病患者预后的重要因素，其感染高发与自身免疫功能紊乱、激素及免疫抑制剂使用等有关。所以，临床上迫切需要找到一种能与抗真菌药有协同抗菌作用的抗风湿药，以期在真菌感染时与抗真菌药联合使用既能控制风湿病情，又能起到辅助抗真菌药物的作用。
对于药物间的协同作用可使用体外抗真菌药敏实验、棋盘式微量稀释法联合药敏实验以及时间-杀菌曲线实验，发现并验证两药协同作用。
参照1997年美国国家临床试验标准化委员会(NccLs)提出的标准J(M27-A方案)，棋盘式微量稀释法(checkerboard microdilution assay)是体外药敏实验的延伸，具有操作过程简单、重复性好等优点，其不足之处为工作量较大，但此方法在抗生素间相互作用的研究中应用较多，也是目前研究抗真菌药物间相互作用最常用的体外实验方法。
部分抑菌浓度指数(FICI)是评价联合用药的两药相互作用方式的主要参数。当FICI≤0.5时，两药的相互作用为协同，FICI指数越小，协同作用越强。
时间-杀菌曲线(Time-kill curves)是常用的体外研究抗真菌药物间相互作用的方法，它评价了RPMI1640培养液中各种药物在特定时间内的杀菌程度。根据时间-杀菌曲线，当菌浓度比起始菌浓度降低99.9％时，即相差≥3log10时确定为杀菌活性；当生长降低<99.9％时判定为抑菌活性。药物作用24小时后，与两种药物中单用抗真菌活性最强者相比，两药合用后抗真菌活性的增强≥2log10CFU/ml时确认两药具有协同作用，至少联合用药中一种药物的浓度在其单独应用同一浓度时对生长曲线没有影响。两药合用后抗真菌活性的降低≥2log10CFU/ml时则认为两药具有拮抗作用。当两药合用后与单用抗真菌活性较强者的活性差别<2log10CFU/ml时，两药的相互作用划归为无关。
技术实现要素：
针对现有抗耐药真菌药物所存在的问题，本发明的主要目的在于提供一种具有协同抗耐药真菌的药物组合物，以提高抗菌效果。
在此基础上，本发明还进一步提供该药物组合物的制备方法，以及相应的应用。
为了达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：
方案1：一种具有协同抗耐药真菌的药物组合物，所述药物组合物由来氟米特和抗真菌药组成。
优选的，所述来氟米特和抗真菌药的配比为1:8-1:12。
优选的，所述抗真菌药为吡咯类抗真菌药，优选氟康唑、伊曲康唑或氟利康唑。
优选的，所述药物组合物呈液体形式、呈粉末形式、呈颗粒形式、呈固体形式、呈胶囊形式或呈片剂形式。
优选的，所述药物组合物中来氟米特和抗真菌药协同抗真菌的部分抑菌浓度指数FICI<0.078。
方案2：一种具有协同抗耐药真菌的药物组合物的制备方法，由来氟米特和抗真菌药按比例混合而成。
优选的，来氟米特和抗真菌药的配比为1:8-1:12。
方案3：来氟米特和抗真菌药的组合在制备抗菌药物中的应用。
优选的，每天按比例口服来氟米特和抗真菌药。
本发明中提供的方案通过来氟米特和抗真菌药之间的协同作用有效提高抗耐药真菌的效果。
再者，基于本方案能够得到能与抗真菌药有协同抗菌作用的抗风湿药，以期在真菌感染时与抗真菌药联合使用既能控制风湿病情，又能起到辅助抗真菌药物的作用。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。
图1为本发明实例中时间-杀菌曲线示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
针对背景技术部分所阐述的问题，本发明人通过大量的实验和创造性劳动，发现来氟米特与抗真菌药具有很好的协同作用。
以下以来氟米特协同氟康唑抗耐药白色念珠菌为例，具体说明一下两药协同作用。
本实例中主要采用棋盘式微量稀释法进行来氟米特与氟康唑之间相互协同作用的体外研究。
其中，使用体外抗真菌药敏实验、棋盘式微量稀释法联合药敏实验发现来氟米特与氟康唑能够协同抗耐药白色念珠菌，使用时间-杀菌曲线实验，验证两药协同作用。
本实例中针对来氟米特协同氟康唑抗耐药白色念珠菌实验主要包括两部分：体外药敏试验和时间-杀菌曲线实验。
其中，体外药敏试验的过程如下：
一、药物母液配制：
这里配置的药物母液主要包括：基于DMSO配制的32mg/ml的氟康唑溶液，基于DMSO配制的20mg/ml的来氟米特溶液。
二、真菌悬液配制，其配置过程如下：
(1)将临床耐药白色念珠菌以1:100接种至1mlYEPD培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。
(2)取经上述方式培养的菌液至1mlYEPD培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以RPMI-1640培养液调整菌液浓度至1×103～5×103cFu/m1。
三、单独药敏试验
(1)取无菌96孔细胞培养板(后简称无菌96孔板)，于B～G排1号孔加RPMI-1640液体培养基100μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的真菌悬液(以下简称菌液)100μl；2号孔加入菌液196.8μl；12号孔不含药物，只加菌液100μl作阳性生长对照。
(2)于无菌96孔板的B～D排第2孔加入20mg/ml的来氟米特母液3.2μl，E～G排第2孔加入32mg/ml的氟康唑母液3.2μl。对B～G排的2～11号孔进行二倍的倍比稀释。
这里的倍比稀释的具体方法是取2号孔药物与菌液的混匀液100ul加入3号孔中，3号孔混匀后取100ul加入4号孔，4号孔混匀后取100ul加入5号孔，以此类推，最后每孔的药物浓度是下一孔的2倍。
由此使得，B～D排各孔来氟米特的最终药物浓度分别为320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/ml；
E～G排各孔氟康唑的最终药物浓度分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml；
且各孔中DMSO含量均低于2％。
四、联合药敏试验(棋盘式微量稀释试验)
(1)取8根无菌玻璃试管，依次编号为A、B、C、D、E、F、G，A试管加新鲜配制的真菌悬液3992μl和32mg/ml的氟康唑母液8ul，B～G试管各加入真菌悬液2000ul；对A～G试管进行二倍的倍比稀释，使得氟康唑的终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/ml。
(2)取无菌96孔细胞培养板，A排2号孔加入A试管悬液198.4ul，3～11号孔各加A试管悬液100ul；B排2号孔加入A试管悬液198.4ul，3～11号孔各加B试管悬液100ul；C排2号孔加入A试管悬液198.4ul，3～11号孔各加C试管悬液100ul；剩余D～G排的2～11号孔亦按上述方法加入相应试管的悬液；每排2号孔各加20mg/ml的来氟米特母液1.6μl；每排1号孔各加RPMI-1640液体培养基100μl作空白对照，每排12号孔各加新鲜配制的真菌悬液100μl作阳性生长对照。对A～G排的2～11号孔进行二倍的倍比稀释；至此，在96孔板上氟康唑与来氟米特以二维棋盘的纵(A排至H排)、横(2号孔至11号孔)两方向分别进行二倍的倍比稀释，使得氟康唑的终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/ml，来氟米特的终浓度为160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/ml，各孔中DMSO含量均低于2％。
五、每次配制药敏板(包括单独药敏试验和联合药敏试验形成的药敏板)的同时均配制一质控菌药敏板。这里的质控菌药敏板配制方法同上，只使用敏感菌，用于鉴定药物是抗真菌药，对敏感菌有效。
六、将各药敏板(每次配制药敏板和对应的质控菌药敏板)于35℃恒温箱，培养48小时后，用酶标分析仪于600nm测各孔OD值。
七、最低抑菌浓度(MIC值)的判定：与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC80(真菌生长80％被抑制时的药物浓度)。
八、计算部分抑菌浓度指数(FICI)：FICI＝CMI氟康唑(联合)/CMI氟康唑(单药)+CMI来氟米特(联合)/CMI来氟米特(单药)。当FICI≤0.5时，两药的相互作用确定为协同作用，且FICI指数越小，协同作用越强；0.5<FICI≤4时认为两药之间作用无关；当FICI>4时两药产生拮抗作用。
参见表1，其所示为基于上述的体外药敏试验方案进行多项的试验实例和结果。
表1
该表表明来氟米特联合氟康唑对多种耐药白念菌有效,且FICI非常小，即表示协同作用非常强。
对此，本实例进一步使用时间-杀菌曲线实验，验证两药协同作用。
其中，时间-杀菌曲线实验过程如下：
1、将临床耐药白色念珠菌以1:100接种至1mlYEPD培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。
2、取该菌液至1mlYEPD培养液中，用上述方法再次活化，16h后以RPMI-1640液体培养基稀释并调整菌液浓度至1×103～5x103cFu/m1的菌液。
3、将得到的1×103～5x103cFu/m1的菌液各分四份，每份20ml菌液，分别加入氟康唑16μg/ml、来氟米特80μg/ml、16μg/ml氟康唑合用来氟米特80μg/ml、空白对照加入相同体积的DMSO，所有菌液中DMSO含量均低于0.5％。于30℃孵箱中，以200rpm振荡培养。
4、分别于0、12、24、36和48小时后，所有菌液中各取100μl液体，再以0.9％生理盐水10倍系列稀释之，从不同稀释倍数的菌液中各取100μl均匀涂铺于含SDA固体培养基表面。
5、SDA平皿于30℃真菌培养箱中培养48小时后计数菌落数目，以平皿上生长菌落数达20个为最低限。计算菌落形成单位(CFU)，以log10CFU/ml对时间作曲线。
6、联合用药的效果评价：根据时间-杀菌曲线，当菌浓度比起始菌浓度降低99.9％时，即相差≥3log10时确定为杀菌活性；当生长降低<99.9％时判定为抑菌活性。
药物作用24小时后，与两种药物中单用抗真菌活性最强者相比，两药合用后抗真菌活性的增强≥2log10CFU/ml时确认两药具有协同作用，至少联合用药中一种药物的浓度在其单独应用同一浓度时对生长曲线没有影响。
两药合用后抗真菌活性的降低≥2log10CFU/ml时则认为两药具有拮抗作用。
当两药合用后与单用抗真菌活性较强者的活性差别<2log10CFU/ml时，两药的相互作用划归为无关。
参见图1，其所是基于103菌株进行时间-杀菌曲线实验得到的时间-杀菌曲线，其中菌液起始浓度103CFU/ml，LEF(来氟米特80ug/ml)，FCZ(氟康唑16ug/ml)。
由图可知，菌浓度比起始菌浓度降低99.9％时，即相差≥3log10，可确定为杀菌活性。药物作用24小时后，与两种药物中单用抗真菌活性最强者氟康唑相比，两药合用后抗真菌活性的增强≥2log10CFU/ml，可确认两药具有协同作用。
本方案中通过使用体外抗真菌药敏实验、棋盘式微量稀释法联合药敏实验发现来氟米特与氟康唑能够协同抗耐药白色念珠菌，在此基础上进一步使用时间-杀菌曲线实验，验证两药协同作用。
其中，棋盘式微量稀释法(checkerboard microdilution assay)是体外药敏实验的延伸，以此来进行来氟米特与氟康唑之间相互作用的体外研究。
本方案中通过部分抑菌浓度指数(FICI)作为评价联合用药的两药相互作用方式的主要参数，当FICI≤0.5时，两药的相互作用为协同，FICI指数越小，协同作用越强。
本方案中进一步采用时间-杀菌曲线(Time-kill curves)来进一步体外研究抗真菌药物间相互作用，由此评价RPMI1640培养液中各种药物在特定时间内的杀菌程度。根据时间-杀菌曲线，当菌浓度比起始菌浓度降低99.9％时，即相差≥3log10时确定为杀菌活性；当生长降低<99.9％时判定为抑菌活性。药物作用24小时后，与两种药物中单用抗真菌活性最强者相比，两药合用后抗真菌活性的增强≥2log10CFU/ml时确认两药具有协同作用，至少联合用药中一种药物的浓度在其单独应用同一浓度时对生长曲线没有影响。两药合用后抗真菌活性的降低≥2log10CFU/ml时则认为两药具有拮抗作用。当两药合用后与单用抗真菌活性较强者的活性差别<2log10CFU/ml时，两药的相互作用划归为无关。
基于上述的实验实例，可以确定来氟米特与氟康唑具有协同抗耐药白色念珠菌的效果。
在此实验方案的基础上，这里的氟康唑可以由其它吡咯类抗真菌药替换，如伊曲康唑或氟利康唑等。
在此基础上，本发明方案可进一步形成具有协同抗耐药真菌的药物组合物，该药物组合物由来氟米特和氟康唑等吡咯类抗真菌药组成。
其中，抗真菌药可根据实际需求而定，且来氟米特和抗真菌药的在1:8-1:12之间，优选1:10，以期达到最优的协同效果。
另外，在此基础上进一步研究确定，由来氟米特与抗真菌药形成的具有协同抗耐药真菌的药物组合物，其针对的抗耐药真菌除上述实例中的白色念珠菌外，对其它的系统性真菌同样也具有协同作用。
由此形成的药物组合物根据需要可呈液体形式、呈粉末形式、呈颗粒形式、呈固体形式、呈胶囊形式或呈片剂形式。
针对该药物组合物在具体制备时，由来氟米特与氟康唑等吡咯类抗真菌药按照配比直接混合而成。
由于这两种药物都是用于治疗风湿病及真菌感染的药物，由这两种形成的具有协同抗耐药真菌的药物组合物，在风湿病基础上罹患真菌感染时使用，既能控制风湿病情，又能起到辅助抗真菌药物的作用。
由此形成的药物组合物在使用时，按照临床治疗剂量使用，来氟米特20mg1/日、氟康唑200mg1/日口服，通过来氟米特与氟康唑协同作用，既能控制风湿病情，又能起到辅助抗真菌。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。