白薇作为抗真菌类药物的新用途的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是白薇作为抗真菌类药物的新用途。

背景技术：

真菌感染分为浅部真菌感染和深部真菌感染两类，浅部真菌感染是由癣菌侵犯皮肤、毛发、指(趾)甲等体表部位造成，发病率高，难根除。深部真菌感染，又称侵袭性真菌病(invasive fungal disease，IFD)是由以念珠菌、隐球菌为主的酵母样真菌和以曲霉为主的丝状真菌侵犯内脏器官及深部组织造成，危害性大，病死率高。每年在世界范围内约130万人因严重真菌感染死亡。与危害严重的侵袭性真菌感染相比，抗真菌药物的发展相对滞后。随着临床上抗菌药的滥用，真菌耐药性随之蔓延，且临床有效抗真菌的品种有限。

真菌耐药性的一个原因是真菌在人体的生物材料表面形成生物被膜。生物被膜是一个微生物聚集群体，是微生物不可逆地与无活力物体或活组织表面接触，由自身产生的细胞外基质包裹着活菌细胞形成的微生态，其具有高度耐药性的特异表型。有研究报道，白念珠菌形成生物被膜后对氟康唑的敏感性下降几百倍，对两性霉素B的敏感性下降几十倍。目前临床对白色念珠菌的生物被膜尚无理想对策。(参见；赵兰雪.抗白念珠茵生物被膜中药成分的筛选及机制研究[D].福建中医药大学硕士论文，2013：1-2.)。

真菌由酵母态转变为菌丝态毒力增强会增强。白色念珠菌作为临床上的一种机会致病性真菌，其生长形态具有二相性，它能够依外界环境的变化从酵母态变为菌丝态。而菌丝态因其有着粘附和侵袭的优势，容易造成宿主的感染，因而白色念珠菌酵母态到菌丝态的转变将显著增强它的毒力。(参见；常文强.Retigeric acid B的抗真菌机制及白色念珠菌中分子工具的构建[D].山东大学博士论文，2013：1-2.)

综上所述，发现高效低毒无耐药性的新型抗真菌药物已经迫在眉睫。中药是我们国家的宝库，有悠久的临床实践基础，在化学结构方面和作用机制方面存在多样性，收到广泛的重视。由于中药和天然药物具有丰富的资源、无耐药性等优点，且在现在技术的帮助下发现其未知的药理活性，使中药再次成为大家研究的热点，也使我们看到抗真菌药研究的新希望。

为了研究新型抗真菌药物，本发明以中药白薇为研究对象。白薇为萝摩科鹅绒藤属植物直立白薇Cynanchum atratum Bunge.或蔓生白薇Cynanchum versicolor Bunge.的干燥根及根茎，具有清热凉血、利尿通淋、解毒疗疮的功效，用于温邪伤营发热、阴虚发热、骨蒸劳热、产后血虚发热、热淋、血淋、痈疽肿毒等症。直立白薇多生于山坡或树林边缘，分布于东北、中南、西南以及河北、山西、陕西、山东、安徽、江西、福建、湖北等地。直立白薇的化学成分主要为C21甾体皂苷类化合物，这类成分广泛存在于同属植物中。C21甾体皂苷类化合物具有抗炎、镇痛，退热和抗肿瘤等药理活性(参见：郑兆广，张卫东，柳润辉，张川，孔令义.蔓生白薇的化学成分研究[J].中草药,2006,37(7)987-989.)

白薇始载于《神农本草经》，列为中品，具有清热、凉血、利尿通淋、解毒疗疮的功效，用于温邪伤营发热、阴虚发热、骨蒸劳热、产后血虚发热、热淋、血淋、痈疽肿毒等症。现代药理表明白薇具有：退热、消炎、镇咳祛痰平喘、抗肿瘤、抗失忆、抗细菌等作用。而抗细菌作用仅见于1992年出版的《中药药理毒理与临床》中报道的白薇中的皂苷对肺炎球菌有抑制作用。(参见：赵新超.直立白薇质量研究[D].山东省医学科学院硕士论文，2009：7-8.)

目前，尚未见有关白薇抗真菌的报到，也未见其作为协同抗真菌增效药物的相关报道。经查新，以往均无白薇提取物作为主要进行配制的防治真菌感染疾病的药物的相关报道或专利。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种白薇作为抗真菌类药物的新用途。

本发明的第一方面，提供白薇作为抗真菌类药物的新用途，即，白薇在制备抗真菌药物、抗真菌药物增效剂、抗真菌生物被膜药物(试剂)以及抗真菌菌丝药物(试剂)中的应用。

优选的，所述的白薇为直立白薇。

优选的，所述的白薇是经75％乙醇粗提，再通过二氯甲烷萃取，最后采用大孔树脂富集60％的乙醇溶液洗脱部位的馏分，得白薇活性成份。

更优选的，所述白薇活性成份，具体通过如下方法获得：

1)75％乙醇粗提：白薇50g研磨成粉末，过20目筛，5倍量的75％乙醇50℃浸泡24h，超声提取30min，重复操作2次，合并2次提取液，离心取上清液，得终浓度为200mg生药/ml的提取液，置于4℃冰箱备用；

2)二氯甲烷萃取：取步骤1)制备的提取液1000ml，减压回流干燥至无醇味得浸膏，将浸膏与等体积的水混悬，不断搅拌，混合均匀，然后用等体积二氯甲烷萃取，将萃取液旋转蒸干至浸膏，保存到4℃冰箱备用；

3)大孔树脂富集：将步骤2)制备的二氯甲烷浸膏，超声用水溶解，过D101大孔树脂，富集60％的乙醇溶液洗脱部位的馏分，旋干至浸膏，制得白薇活性成分。

优选的，所述抗真菌药物增效剂中的抗真菌药物是氟康唑、酮康唑、伏立康唑或两性霉素B等抗真菌药物。

优选的，所述的真菌是深部真菌菌株、浅部真菌菌株、敏感菌株或耐药菌株。

优选的，所述的真菌是白色念珠敏感菌Y0109、白色念珠菌标准均sc5314、白色念珠耐药菌102、白色念珠耐药菌103、近平滑念珠菌22019、光滑念珠菌537、新生隐球菌32609、石膏样小孢子菌Cmccfmza、红色毛癣菌Cmccftla或烟曲霉菌7544。

优选的，所述的白薇在抗真菌菌丝药物(试剂)中的应用是指白薇经乙醇粗提得终浓度为200mg生药/ml的提取液，该提取液用于抑制真菌菌丝的形成。

本发明的第二方面，提供一种抗真菌的药物组合物，所述药物组合物的活性成分是抗真菌药物和白薇。

优选的，所述的抗真菌药物是氟康唑、酮康唑、伏立康唑或两性霉素B等抗真菌药物。

优选的，所述的药物组合物的活性成分是氟康唑和直立白薇。

本发明的第三方面，提供一种抗白念珠菌生物被膜的药物组合物，所述药物组合物的活性成分是抗白念珠菌生物被膜药物和白薇。

优选的，所述的药物组合物的活性成分是两性霉素B和直立白薇。

经实验证实，白薇对常见深部真菌和浅部真菌均有很好的抑制作用，对于耐药真菌，抗真菌药物与白薇合用时，能明显降低常规抗真菌药物的药物剂量，能不同程度地提高常用抗真菌药对真菌的抑制作用，并能使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，增强对耐药真菌的抑制作用。

白薇具有抗真菌生物被膜活性，不仅能抑制真菌生物被膜的粘附、生长增殖，而且能协同两性霉素B显著地抗生物被膜。白薇醇提物在200μg/ml(生药)的浓度下，能完全抑制白念菌丝形成。

白薇具有显著地抗真菌及其协同抗真菌的活性，直立白薇具有抗菌效果，对常见致病真菌(白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、石膏样小孢子菌、红色毛癣菌、烟曲霉菌)均有抑制作用。直立白薇的75％乙醇粗提物分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取后检测其抗真菌的活性，发现二氯甲烷萃取部位的抗菌活性效果最好。然后用D101大孔树脂富集二氯甲烷的活性部位，流动相为0％、30％、60％、100％的乙醇溶液，发现60％乙醇部位的抑菌效果最好。

本发明优点在于：

本发明为中药白薇开辟了新的用途，不仅本身具有抗真菌的作用，而且用于抗真菌药物的增效剂，不但能提高药物的抗真菌作用，而且在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，可降低抗真菌药物的用药剂量，为患者节省了医疗费用，并可减少药物的毒副作用。

本发明的中药白薇是我国传统药物，具有资源丰富，价格便宜，副作用小等优点，白薇和抗真菌药物合用也能够减少药物的毒副作用，节省患者的医药费用。

附图说明

图1是白薇1mg～4mg对白念标准菌SC5314和白念耐药菌103不同程度的抑制作用以及白薇1mg-4mg与氟康唑合用的协同作用；

其中，a-白念标准菌SC5314；b-白念耐药菌103；c-白念耐药菌103+氟康唑6μg/ml；d-白念耐药菌103+氟康唑12μg/ml；

a、b、c、d中对应位置的6片药物为：1-白薇1mg/片；2-氟康唑10μg/片；3-白薇4mg/片；4-白薇3mg/片；5-空白纸片；6-白薇2mg/片。

图2是不同浓度白薇醇提液抑制白念珠菌菌丝的作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：白薇醇提取液单独抗常见致病真菌的作用

一、材料和方法

1、试剂

白薇：上海雷允上医药有限公司中药部

氟康唑(Fluconazole，FLC)：美国Sigma公司

伏立康唑(Voriconazole，VCZ)：美国Sigma公司

酮康唑(Ketoconazole，KCZ)：美国Sigma公司

无水乙醇：上海国药集团有限公司

石油醚：上海国药集团有限公司

二氯甲烷：上海国药集团有限公司

乙酸乙酯：上海国药集团有限公司

正丁醇：上海国药集团有限公司

其它试剂均为国产试剂

2、菌株

白念珠菌(Candida albicans)标准菌SC5314、敏感菌Y0109由美国华盛顿乔治敦大学的WilliamA.Fonzi教授惠赠，白念珠菌耐药菌(Candida albicans)102、103、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)ATCC 22019、光滑念珠菌(Candida glabrata)537、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)32609、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)Cmccfmza、红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)Cmccftla、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)7544均由长海医院真菌室提供。所有菌株已经形态学和分子鉴定。

3、培养基

RPMI 1640液体培养液：RPMI 1640 10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸34.5g，NaOH调pH至7.0，三蒸水定容1 000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌；4℃保存备用。Spider培养液(PH 7.2)：营养肉汤10g，甘露醇10g，磷酸氢二钾2g，三蒸水定容1000ml，高压灭菌，保存于4℃备用。

YEPD培养液：酵母浸膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，三蒸水定容至1 000ml，高压灭菌，于4℃保存。

沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)：蛋白胨10g、葡萄糖40g、琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH值至7.0，定容至1 000ml，高压灭菌，4℃保存。

4、仪器

DL-1000B智能超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)，

SW-CT-IF型单人双面超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，

96孔细胞培养板(丹麦Nunclon公司)，

12孔细胞培养板(美国Corning公司)，

80A漩涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)，

THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)，

隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，

XW-Multiskan MK3型酶标仪(芬兰Labsystems公司)，

倒置显微镜(美国EVOS公司)，

单反相机(日本Nikon公司)。

5、白薇粗提取液的制备：

白薇50g研磨成粉末，过20目筛，5倍量的75％乙醇50℃浸泡24h，超声提取30min，2次，合并2次提取液，离心取上清液，得终浓度为200mg生药/ml的提取液，置于4℃冰箱备用。

6、白薇二氯甲烷部位的制备：

将保存的白薇粗提物1000ml，减压回流干燥至无醇味，得浸膏，将浸膏与等体积的水混悬，不断用玻璃棒搅拌，使混合完全。然后用等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位，剩余部位为水部位。分别旋转蒸干至浸膏，取少量用75％乙醇配置成6.4mg/mL的溶液(用于检测石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇部位的抑菌活性，见表2)，剩余浸膏保存到4℃冰箱备用。

7、白薇大孔树脂100％乙醇馏分的制备：

将保存的二氯甲烷浸膏，用水超声溶解，过D101大孔树脂，流动相为0％、30％、60％、100％的乙醇溶液，富集各部位的馏分并旋干至浸膏，取少量用75％乙醇配置成6.4mg/mL的溶液，待测。

8、阳性药的配制

以二甲亚砜(DMSO)溶解FLC、VCZ、KCZ，配制成6.4μg/ml药物母液，置于4℃冰箱备用。

9、菌液制备

菌株活化酵母菌35℃SDA固定培养板孵育24-48h，挑取单克隆接种至含YEPD培养液，于30℃、200rpm/min振荡培养16h后，使其处于指数生长对数期，以保证菌的纯度和活力；丝状菌烟曲霉35℃马铃薯斜面培养基孵育7天，无菌纱布过滤。

菌悬液配制血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调整酵母菌液浓度至0.5×103CFU/ml～2.5×103CFU/ml、丝状菌液浓度0.5×104CFU/ml～2.5×104CFU/ml用于药敏实验。离心收集生长对数期白念珠菌，用灭菌的PBS缓冲溶液(PH7.2)清洗3次，将白念珠菌细胞混悬于1ml Spider培养液中，用血细胞计数板计数，调菌浓度为1.0×106cells/ml用于菌丝生长实验及生物被膜实验。

10、药物敏感测试板的制备

按2009和2008年CLSI推荐标准M27-A3和M38-A2方案：取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI1640液体培养基100μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液100μl；2号孔分别加菌液198μl和白薇提取物2μl；2～11号孔进行2倍倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906μg/ml，各孔中乙醇的含量均低于1％。12号孔不含药物，只加菌液100μl作生长对照。阳性药FLC、VCZ和KCZ的终浓度分别为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.0313μg/ml。各孔中DMSO的含量均低于1％。药敏板于35℃隔水式电热恒温培养箱中培养，念珠菌和烟曲霉孵育48h、新生隐球菌孵育72h，用酶标分析仪于630nm测各孔OD值，并辅以目测。

11、最低抑菌浓度(MIC值)

与生长对照孔比较≥90％生长抑制所对应的最低药物浓度为氟康唑和中药提取物的MIC90。生长对照孔的OD值控制在0.2左右，与生长对照孔比，以OD值下降90％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC90(真菌生长90％被抑制时的药物浓度)。中药提取物大多颜色较深可能产生假阳性结果，辅以目测，以肉眼观察无菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度。每块药敏板均设有质控菌株及质控化合物，实验过程中质控株近平滑念珠菌ATCC22019、质控化合物氟康唑、伏立康唑、酮康唑MIC波动范围不超过1个药物梯度浓度，且均在CLSI-M27-A3和CLSI-M38-A2公布的质控菌株MIC标准范围内，即本研究中实验结果数据可靠。实验在不同时间段重复3次，三次结果不超过一个浓度差则可信，且以高浓度MIC为准，若不符，再次重复测定。

12、纸片扩散实验

用0.9％生理盐水调菌悬液浓度为1.0×106cells/ml，取3ml铺于YEPD固体培养基，35°恒温培养30min，弃上层液体，待液体挥干，在板上放含不同剂量药物的无菌纸片，倒置平皿于35°培养箱孵育48h，观察抑菌圈内外菌落状态，并拍照。

二、实验结果见表1、表2。

由表1中可见，蔓生白薇对各类真菌均无效，直立白薇对念珠菌属及临床耐药白念珠菌均有很好的抑制作用，对常见深部真菌新生隐球菌、烟曲霉以及浅部致病真菌石膏状小孢子菌、红色毛癣菌抑制作用也较为明显。本实验说明中药直立白薇对常见致病真菌均有很好的抗真菌作用。

由表2可知，发现白薇的活性部位为二氯甲烷部分，对白念珠菌Y0109和新生隐球菌32609的MIC90为1μg/ml，通过D101大孔树脂进一步追踪其活性部位，发现白薇二氯甲烷60％-100％乙醇洗脱部位是其活性较好的部位，抗真菌作用较强。

图1表示白薇1mg～4mg对白念标准菌和耐药菌103均有不同程度的抑制作用，氟康唑10μg并无抑菌圈；白薇1mg-4mg与氟康唑合用，抑菌圈均明显扩大，说明有较好的协同作用。

实施例2：白薇与氟康唑联合对白念珠菌的作用

材料和方法

1、药敏板的制备

取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI1640液体培养基100μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液100μl；2号孔分别加菌液198μl和白薇提取物2μl；2～11号孔进行2倍倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906μg/ml，各孔中乙醇的含量均低于1％。12号孔不含药物，只加菌液100μl作生长对照。将各药敏板于30℃恒温箱培养。

其他实验步骤和方法同实施例1，实验结果见表3。

表3白薇与氟康唑联合对2株临床白念珠菌的MIC₈₀值(μg/ml)

由表3可知，白薇不但具有抗真菌作用，而且与抗真菌药物氟康唑协同具有抗菌增效作用。氟康唑单用的MIC80值均大于1024μg/ml，合用4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml的氟康唑后，白薇的MIC80由250μg/ml下降到31.25～125μg/ml，显示了白薇提取物对氟康唑的增效作用。

实施例3：白薇与两性霉素B联合使用对白念珠菌生物被膜的作用

材料和方法：

1、试剂

白薇：上海雷允上医药有限公司中药部。

两性霉素B：购自生工生物工程有限公司。

XT：购自Sigma公司。

甲萘醌(menadione)：购自Sigma公司。

二甲亚砜(DMSO)：中国医药(集团)上海化学试剂公司。

两性霉素B用二甲亚砜溶解，配成所需浓度，于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学实验。

XTT用灭菌的PBS配成0.5mg/ml的饱和溶液，用0.22μm孔径的滤器滤过除菌，甲萘醌(menadione)用100％丙酮配成10mM溶液，XTT、甲萘醌(menadione)于-80℃保存。实验前，将药物贮存液取出置4℃冰箱、35℃温箱梯度融化，充分混匀，进行药效学实验。

2、抗白念珠菌生物被膜药敏板制备：取无菌96孔板，于每排11号孔加RPMI 1640培养液150μl作阳性对照；2～10号孔各加RPMI 1640培养液150μl；1号孔分别加入RPMI 1640培养液298.8μl和两性霉素B溶液1.2μl。1～10号孔10级倍比稀释，使各孔的白薇最终药物浓度分别为5000、2500、1250、625、312.5、156.25、和78.13μg/ml，两性霉素B最终药物浓度分别为8、4、2、1、0.5和0.25μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1％。取出培养90min的生物被膜板，用PBS缓冲溶液洗3次，取配好的含药物培养液100μl加入到被膜板对应的孔中，12号孔不培养生物被膜，作阴性对照。各药敏板于37℃继续静置培养24h(一系列不含化合物的孔作为空白对照也采用上述培养方式培育)。

3、黏附最低抑菌浓度(sessile minimum inhibitory concentration，SMIC)的测定白念珠菌生物被膜于37℃培养24h后，取出生物被膜板，用PBS缓冲溶液轻轻洗3次，每孔加入200μl XTT/menadione(12号孔也加)，避光，37℃静置孵育2-3h，取出生物被膜板，吸取100μl XTT/menadione至无菌96孔板中，用Infinite M200多功能酶标仪(TECAN,Austria)于490nm测各孔OD值(直接反映被膜细胞代谢活性变化)。与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为SMIC80(生物被膜生长80％被抑制时的药物浓度)。当药物的SMIC80值超过白薇测定浓度范围时，按以下方法进行统计：SMIC80值高于最高浓度64μg/ml时，计为“>64μg/ml”；SMIC80值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/ml”。

4、联合用药的效果评价:

部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)是评价联合用药的两药相互作用方式的主要参数。抑菌浓度分数(FIC)，分别为每一种药物联合抑菌时所需最低抑菌浓度(MIC)与单用时MIC的比值.而FIC指数(FICI)则等于两种药物FIC之和。很多文献报道当FICI≤0.5时两药的相互作用确定为协同作用，且FIC指数越小，协同作用越强；0.5<FICI≤1时两药的相互作用确定为相加作用；1<FICI≤4时为无关作用；当FICI>4时两药产生拮抗作用

上述实验均平行操作6次，当SMIC80值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为SMIC80值；当SMIC80值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。XTT还原法的基本原理在于四氮唑盐能够在电子耦合剂甲萘醌的作用下，通过具有线粒体活性的酵母细胞转化为具有特殊颜色的甲月替四氮唑盐。

二、实验结果见表4

表4白薇及其和两性霉素B联合对白念珠菌成熟被膜的抑制效果

表4结果显示：白薇、两性霉素B单独用药对白念标准菌生物被膜均有抑制作用，而氟康唑则没有抑制生物被膜的作用；白薇合用0.0625～0.25μg/ml的两性霉素B后，SMIC80值由625μg/ml下降到125～31.25μg/ml，显示了白薇提取物对两性霉素B协同抗生物被膜作用。

实施例4：白薇醇提液抑制白念珠菌菌丝的作用

材料和方法

1、药敏板制备

取无菌12孔细胞培养板一块，每孔加入1ml 1.0×106cells/ml菌悬液，加入含有不同药物浓度中药醇提取液(v≤20μl)，37℃隔水式电热恒温培养箱中静止培养3h，在EVOS xl型倒置显微镜下观察菌丝生长状况并拍照。

其它实验步骤和方法同实施例1，实验结果见图2。

如图2所示，实验结果表明：白薇醇提物在200μg/ml(生药)的浓度下，能完全抑制白念菌丝形成。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。