本发明涉及生物医药及食品加工领域，特别是具有降血糖、抗癌的月季花有效提取物的制备方法及应用。
背景技术：
：月季花为蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa.L)植物月季(RosachinensisJacq.)的干燥花蕾或半开的花，原产于我国，十八世纪八十年代传入欧洲，现在在我国大部分地区广泛栽培，品种多，资源丰富。《本草纲目》中记载“月季花释名月月红、胜春、瘦客、斗雪红，甘、温、无毒，主治活血、消肿、敷毒”，现代药理实验证明，月季花具有抗菌、抗病毒，抗氧化，清除亚硝酸盐，利尿，增强机体免疫力，改善心脑血管疾病，抗癌等活性。在抗生素滥用的今天，植物源抗菌剂因其不易引起耐药的特性而备受关注，从天然产物中筛选具有很好抗菌活性且不易产生耐药性的新药已成为需要人们探索的又一有意义的研究领域。近年来人们对天然产物抗菌活性的研究逐渐增多，但月季花抗菌活性的研究相对较少。早在1976年，S.C.Tripathi的研究就表明月季花中的没食子酸具有很强的抗真菌活性，最近王娜等对月季花抑制白色念珠菌的研究也证明了月季花具有抑制真菌的活性。也有研究表明月季花对水产养殖中的多种细菌及真菌有明显抑制作用。目前，肺癌已成为世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，2003年世界卫生组织公布，每年死于肺癌的人数达到了110万。月季花一直被玛雅人用于治疗呼吸系统的疾病，说明月季花中含有益于呼吸系统的成分。目前国内外对月季花的研究逐年增加，所涉及领域也越来越广，但是研究方向主要集中在农业种植、挥发油的提取和应用等方面，公开报道的结果均停留在月季花总提物在抗癌、抗菌等方面的定性研究层次，未深入研究提取物中的有效部位物质群。月季花在很多治疗糖尿病的中药复方中出现，但对月季花降血糖和抗癌活性的有效物质群研究极少，特别是月季花唯一活性成分的提取应用，未见有公开报道。技术实现要素：针对上述问题，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供具有降血糖、抗癌的月季花有效提取物的制备方法及应用，可有效解决月季花资源整体利用率低，月季花唯一活性成分部位的制备问题。本发明的技术方案是：将月季花清洗除杂后，每次用药材重量的3~10倍的水煎煮提取2～3次，每次先武火煮沸10～15min，再文火提取0.5～1.5h，过滤合并提取液，加热浓缩至50℃下相对密度为1.2~1.4，得月季花浸膏；用月季花浸膏重量1～2倍的水进行分散，得分散液，再用分散液1～2倍体积的沸程60~90℃的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取分散液，每种溶剂萃取3～5次，分别合并3～5次的萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到月季花浸膏萃取的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位；收集乙酸乙酯部位，挥干残留溶剂，得唯一活性成分部位的月季花有效提取物；所述月季花为干燥月季花蕾、干燥月季花瓣或新鲜月季花瓣。本发明所述方法制备的月季花有效提取物为唯一活性成分部位在制备降血糖、抗癌药物及保健食品中的应用。所述的药物或保健食品的剂型为片剂、散剂、胶囊、颗粒或滴丸。所述方法制备的月季花有效提取物为唯一活性成分部位在制备体外抗菌药物中的应用。本发明生产工艺简单，节能环保，提高月季花资源整体利用率，生产成本低，易于工业化生产，并明确其中乙酸乙酯部位是具有降血糖、抗癌和抗菌活性的有效物质群，疗效确切可靠，安全无副作用，对糖尿病患者、癌症患者等人群的身体机能有显著效果，是糖尿病（中医称为消渴病）、癌症等疾病的保健和食疗康复问题上的创新，为月季花深层次开发提供了科学依据，也为月季花的综合开发利用奠定了坚实基础，经济和社会效益巨大。具体实施方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。本发明在具体实施中，是由以下实施例实现。实施例1将6kg干燥月季花瓣清洗除杂后，依次用药材重量的8倍、6倍、4倍量的水煎煮提取3次，每次先武火煮沸10min，再文火提取0.5h，过滤合并提取液，浓缩至50℃下相对密度为1.2，得月季花浸膏3310g；取500g月季花浸膏，用700ml的水进行分散，得分散液，再用分散液1倍体积的沸程60℃的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取分散液，每种溶剂萃取3次，合并3次的萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到月季花浸膏萃取的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位；收集乙酸乙酯部位106g，挥干残留溶剂，得唯一活性成分部位的月季花提取物。实施例2将15kg新鲜月季花瓣清洗除杂后，依次用药材重量的6倍、4倍、4倍量的水煎煮提取3次，每次先武火煮沸15min，再文火提取1.5h，过滤合并提取液，浓缩至50℃下相对密度为1.4，得月季花浸膏；取368g月季花浸膏，用500ml的水进行分散，得分散液，再用分散液1.5倍体积的沸程90℃的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取分散液，每种溶剂萃取5次，合并5次的萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到月季花浸膏萃取的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位；收集乙酸乙酯部位71g，挥干残留溶剂，得唯一活性成分部位的月季花提取物。实施例3将10kg干燥月季花瓣清洗除杂后，依次用药材重量的10倍、6倍、3倍量水煎煮提取2次，每次先武火煮沸12min，再文火提取1h，过滤合并提取液，浓缩至50℃下相对密度为1.3，得月季花浸膏；取400g月季花浸膏，用400ml的水进行分散，得分散液，再用分散液2倍体积的沸程70℃的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取分散液，每种溶剂萃取4次，合并4次的萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到月季花浸膏萃取的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位；收集乙酸乙酯部位100g，挥干残留溶剂，得唯一活性成分部位的月季花提取物。实施例4将20kg新鲜月季花瓣清洗除杂后，依次用药材重量的6倍、4倍、3倍量的水煎煮提取3次，每次先武火煮沸10min，再文火提取1h，过滤合并提取液，浓缩至50℃下相对密度为1.2，得月季花浸膏；取400g月季花浸膏，用800ml的水进行分散，得分散液，再用分散液1.5倍体积的沸程80℃的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取分散液，每种溶剂萃取3次，合并3次的萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到月季花浸膏萃取的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位；收集乙酸乙酯部位150，挥干残留溶剂，得唯一活性成分部位的月季花提取物。上述月季花提取物作为唯一活性成分部位在制备降血糖、抗癌药物中的应用，开拓了月季花的药用价值。本发明对月季花进行提取，并明确其中乙酸乙酯部位是具有降血糖、抗癌和抗菌活性的有效物质群，未见公开报道，为其深层次开发提供了科学依据，也为月季花的综合开发利用奠定了坚实基础。本发明所述方法，经多次反复实验均取得了相同的效果，相关实验资料如下：一、降血糖活性实验（一）不同提取方法降血糖活性比较1.1实验材料1.1.1实验材料与动物月季花制备物，包括本发明方法提取物、水超声提取物和95%乙醇提取物；昆明种小白鼠，SPF，雄性，河南省实验动物中心购得，许可证号：SCKK（豫）2010-00021.1.2实验用试剂四氧嘧啶(ALX)Sigma公司葡萄糖(GLU)-过氧化物酶法试剂盒上海荣盛生物药业有限公司盐酸二甲双胍片中美上海施宝贵制药有限公司95%乙醇新乡市三伟消毒制剂有限公司葡萄糖上海商玺工贸有限公司1.1.3实验用主要仪器HF-5B超声循环提取器北京弘祥隆生物技术开发有限公司JHBE-50T破碎提取器金鼐科技UV2550紫外-可见分光光度计郑州富德仪器设备有限公司TLG-16G高速台式离心机上海安亭科学仪器厂RE-52AA旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂循环水式真空泵巩义予华分析天平奥豪斯仪器有限公司酶标仪NestBiotechCo.,LtdEclipse80i荧光生物显微镜尼康1.2实验方法1.2.1不同提取方法得到的月季花提取物降血糖活性的试验1.2.1.1月季花提取物的制备将阴干的月季花花瓣均分为三份，每份400g，分别用水超声提取法、95%乙醇超声提取法、本发明方法提取。1.2.1.3三种提取物对实验性糖尿病模型小鼠血糖影响的对比试验将三种不同提取方法得到的浸膏烘干、称重，水超声提取法、95%乙醇超声提取法及水煎煮提取法得到的提取物的干重分别为128.7g、115.3g和220.8g，用适量的蒸馏水将不同提取方法提取得到的粗提取物分散，分别得到水超声提取物，95%乙醇超声提取物，本发明方法提取物，于4℃保存，供动物实验使用。糖尿病小鼠动物模型的建立取60只体重为18~20g雄性昆明小鼠适应性饲养一段时间后，称重，禁食、不禁水16h后取10只作为空白对照组，其余小鼠连续三天空腹注射3%四氧嘧啶（依次为150mg/kg，100mg/kg，100mg/kg）。4天后，禁食不禁水12h，眼眶取血，测定小鼠空腹血糖浓度，血糖值在11.1mmol/L以上的小鼠为实验性糖尿病模型小鼠。糖尿病模型小鼠的分组及处理将小鼠分为空白对照组、模型对照组、月季花水超声提取物组、月季花95%醇超声提取物组、月季花水煎煮提取物组，每组10只，雌雄各半。除空白对照组为健康小鼠外，其余组均为筛选出的造模成功的糖尿病小鼠。采用灌胃法给药，空白对照组和模型对照组每天给予适量的生理盐水，其余组小鼠按每天4g/kg.bw灌胃给予月季花提取物。连续给药14天，给药七天后测一次空腹血糖值，给药14天后，于末次给药前禁食12h，给药2h后眼眶取血测血糖。血清的采集与数据处理眼眶取血与EP管中，3500r/min下离心15min；收集血清，用葡萄糖试剂盒检测血糖值。采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，所有数据用平均数±标准差表示。由表1.1数据可知，连续给药14天后测量小鼠空腹血糖，月季花95%乙醇超声提取物组与模型组相比，具有明显的差异(P＜0.05)；水煎煮提取物组与模型组相比，具有极显著的差异(P＜0.01)；水超声提取物组的血糖水平较模型组也有所降低。这些结果显示，月季花具有降低糖尿病小鼠血糖水平的作用，不同提取方法得到的月季花提取物对糖尿病小鼠的血糖水平降低程度不同，本发明水煎煮提取物的降血糖效果最好。表1.1不同提取方法得到的月季花总提物对糖尿病模型小鼠血糖水平的影响组别n初始血糖值(mmol/L)14天后血糖值(mmol/L)空白组107.57±0.816.63±1.06模型组1028.42±4.64##29.43±5.34##月季花水超声提取物组1028.30±3.0024.10±5.65月季花醇超声提取物组1028.14±2.7520.09±4.78*月季花本发明提取物组1028.92±4.0017.08±5.15**注：与空白组相比，##P﹤0.01；与模型组对比，*P﹤0.05，**P﹤0.01结论：在对不同提取方法得到的月季花提取物的降血糖活性试验中发现，95%醇超声提取物与本发明提取物的紫外图谱较接近，说明二者含有的化合物种类和含量大致相同，所以它们都有降糖效果，而月季花本发明方法提取物的降血糖活性更好，这也恰好与古方中用月季花治疗消渴症多采用水煎煮法相吻合。（二）月季花水提物各极性部位降血糖活性的对比试验2.1实验材料的制备取500g月季花水煎煮提取物，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯部位浸膏106g，正丁醇部位浸膏96g，水部位浸膏296g，各部位浸膏得率分别为21.2%，19.2%，58.2%。将不同极性部位的浸膏放入真空干燥箱中，在50℃下烘干备用。取一定量的月季花水煎煮提取物、月季花乙酸乙酯部位、月季花正丁醇部位、月季花水部位、二甲双胍粉末，用蒸馏水分散成一定浓度的溶液备用。2.2对糖尿病小鼠作用的试验取100只体重18~20g雄性昆明小鼠，适应性饲养一周后，称重，随机取12只做空白对照，其余88只小鼠禁食不禁水16h后腹腔注射3%四氧嘧啶，连续给药三天(150mg/kg，100mg/kg，100mg/kg)，4天后，眼眶取血测小鼠空腹血糖浓度，其中造模成功79只。将这些小鼠随机分成6组，分别为月季水提物组(4.5g/kg)、乙酸乙酯部位组(0.2g/kg)、正丁醇部位组(0.86g/kg)，水部位组(2.7g/kg)，阳性对照组（250mg/kg，二甲双胍），模型对照组，每组12只。采用灌胃法给药。连续灌胃20天，给药10天后测一次空腹血糖值，给药20天时，于末次给药前禁食12h，给药2h后眼眶取血测血糖。末次给药取血后，取小鼠脾、胸腺、双肾，测其相应指数。取胰腺，用4%福尔马林固定，脱水处理后，石蜡包埋，切片，染色后于显微镜下观察胰腺组织形态学变化。2.3结果与结论2.3.1月季花水提物各极性部位对糖尿病小鼠血糖水平的影响表2.1为月季花水煎煮提取物各极性部位对糖尿病模型小鼠血糖影响的测定结果。如表，模型组与空白对照组相比具有极显著差异(p＜0.01)，给药后阳性对照组与模型组相比具极显著差异(p＜0.01)，这说明实验制作的糖尿病模型是成功的。提取物组与模型组相比，给药10天后，血糖明显降低(p＜0.05)，给药20天后，血糖显著降低(p＜0.01)，说明提取物可明显降低糖尿病模型小鼠的空腹血糖值。水部位组在给药10天后血糖有所下降，给药20天血糖下降明显(p＜0.05)，说明，水部位有一定的降糖作用。正丁醇部位组给药10天血糖与模型组相比无变化，给药20天血糖有所下降，但不明显，说明乙酸乙酯部位的降血糖作用较弱。乙酸乙酯部位组给药10天后，与模型组相比血糖明显降低(p＜0.05)，给药20天后，血糖显著降低(p＜0.01)，说明月季花乙酸乙酯部位(0.2g/kg)具有好的降糖作用。表2.1月季花水提物各极性部位对糖尿病模型小鼠血糖的影响组别n剂量(g/kg)给药前血糖值（mmol/L）给药10天血值（mmol/L）给药20天血糖值（mmol/L）空白对照组1206.13±1.266.17±1.146.74±1.34模型对照组12024.43±3.15##24.27±5.35##25.23±5.57##阳性对照组120.2523.98±3.4922.67±2.195.18±3.90**总提物组124.524.29±5.1018.37±5.52*16.26±4.85**水部位组122.7523.05±5.3421.97±4.8520.07±4.35*正丁醇部位组120.8624.28±4.2624.66±5.1722.99±4.03乙酸乙酯部位组120.222.78±4.3119.50±4.29*18.68±4.85**注：##P＜0.01，与空白对照组相比；*P＜0.05，**P＜0.01，与模型对照组相比2.3.2月季花水提物各极性部位对糖尿病小鼠胰腺的影响表2.2为各组小鼠胰腺组织形态学特点的总结。月季花水提取各极性部位组相比，乙酸乙酯部位组的胰腺病变最少，状态最好，正丁醇部位组较差。表2.2各组小鼠胰腺的显微观察与空白组小鼠组别各组小鼠胰腺组织形态学特点空白组胰岛与周围外分泌腺界限清晰，胰岛细胞分布均匀，细胞核清晰。模型组胰腺内炎细胞较多，可见炎细胞浸润胰腺间质、间质脉管内、血管周围、血管内部、胰岛周围及胰岛内部；胰岛萎缩，胰岛B细胞减少，A细胞增多，部分胰岛细胞核分裂、脱颗粒，胞质透明，且可见凋亡细胞；胰腺大血管平滑肌增厚，血管周围结缔组织增生，毛细血管基底膜增厚，部分血管充血；腺泡出现萎缩或肥大。阳性对照组胰腺内炎细胞入侵血管周围及结缔组织；腺泡萎缩；胰岛边缘不太清晰，部分胰腺细胞空泡变性。月季花水提物组胰腺中部分腺泡萎缩；偶见毛细血管基底膜增厚；胰腺内仍可见炎细胞。乙酸乙酯部位组胰腺内炎细胞较少，部分胰岛细胞核增生。正丁醇部位组胰腺内大量炎细胞浸润；胰岛萎缩，胰岛细胞空泡变性严重，部分胰岛严重纤维化；胰腺间质血管充血。水部位组胰岛B细胞减少，细胞大小不一；毛细血管基底膜增厚；胰腺内可见少量炎细胞。2.4结论月季花水提物各极性部位的剂量按各极性部位在总提物中的含量设计，如正丁醇部位和水部位在水提物中的含量分别为19.2%，58.2%，则正丁醇部位组和水部位组的给药剂量分别为0.86g/kg和2.75g/kg。乙酸乙酯部位在浸膏中的含量为21.2%，其给药剂量理应为0.95g/kg，但在预实验中发现，月季花乙酸乙酯部位最低在2g/kg剂量下单次给药就能使正常小鼠死亡，根据动物实验剂量设计原则，采用LD50的1/10剂量(0.2g/kg.bw)给药。给药后血糖测定结果发现，乙酸乙酯部位在0.2g/kg.bw剂量时就能明显降低糖尿病小鼠的血糖水平，水部位在2.75g/kg剂量下也有降血糖作用，推测乙酸乙酯部位与水部位能够协同降低血糖。在对各组小鼠胰腺组织形态学观察中也发现，乙酸乙酯部位组的胰腺病变较少，状态较好，水部位组的小鼠胰腺病变也较少，而正丁醇部位组的病变较多，说明乙酸乙酯部位和水部位能够修复受损的胰腺，但其具体作用机制还需进一步试验。其中，乙酸乙酯部位组小鼠胰腺与其他组相比最明显的特点是炎细胞浸染较少，推测，乙酸乙酯部位具有较好的消炎作用，这也有可能是其降血糖作用的一个有效机制。通过实验确证了月季花的降血糖功效：通过用四氧嘧啶制作的实验性糖尿病模型对月季花的提取方法进行了筛选，结果表明本发明方法提取得到的月季花提取物的降血糖活性最好，在6g/kg.bw剂量时有极显著的降糖效果；在6g/kg.bw剂量下，对月季花水煎煮提取物对正常小鼠的糖耐量及空腹血糖的影响进行了试验，结果表明月季花水提物能够增强小鼠糖耐量，降低正常小鼠的餐后血糖，使其维持较为平稳的状态，但对其空腹血糖无明显影响。本发明首次对月季花不同极性部位降血糖活性进行了试验，试验发现，乙酸乙酯部位的降血糖活性最强，说明乙酸乙酯部位为月季花水提取主要的降血糖活性部位。二、本发明月季花提取物体外抗菌活性的试验3.1实验材料3.1.1实验菌株3.1.2实验用主要试剂蛋白胨BR北京奥博星生物技术有限公司酵母膏BR北京奥博星生物技术有限公司琼脂粉BR创生生物氯化钠AR天津市福晨化学试剂厂医用酒精新乡市三伟消毒制剂有限公司生理盐水超纯水3.1.3实验用主要仪器双人单面超净化工作台苏州安泰空气技术有限公司立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂分析天平奥豪斯仪器有限公司恒温培养箱上海福玛实验设备游标卡尺(0-200mm)中国上海冰箱海信集团有限公司打孔器PaoShenEnterprisesCo.,Ltd定性滤纸杭州新华纸业有限公司微量移液器大龙接种环涂布棒3.2实验方法本实验采用传统的纸片扩散法，通过测定抑菌圈的大小反映药物抗菌活性的强弱。3.2.1月季花水提物不同极性部位抗菌活性的试验3.2.1.1实验材料的制备培养基的制备称取蛋白胨2g、酵母膏1g、NaCl颗粒2g于三角瓶中，加入200mL超纯水溶解，用2%NaOH溶液调pH至7.5左右，加琼脂粉4g，放于高压锅中在121℃下灭菌25分钟，在超净工作台中趁热将灭菌过的培养基倒入无菌培养皿中，待其凝固，备用。滤纸片的制备用打孔器将滤纸打成直径为6mm的圆形滤纸片，放于平皿中在高压锅中灭菌(121℃，25min)，备用。样品的制备将月季花水煎煮提取物的三个极性部位（乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位）分别取出适量，用超纯水配成100mg/mL溶液，用0.45µm滤膜过滤除菌，置于无菌EP管中备用。供试菌株的活化将保存菌种置于37℃恒温箱中复活16h，用接种环取供试菌株适量，平板划线接种2次，备用。菌悬液的制备用生理盐水将已活化的菌种分散，吸取少量于装有9mL灭过菌的超纯水的试管中混合均匀，取该混合均匀的菌悬液适量于另一灭过菌的试管中，加灭菌的超纯水混匀，稀释到所需的浓度（0.5麦氏比浊度），备用。3.2.1.2抗菌实验取100µL制备好的菌悬液于培养基上，用接种环将其涂布均匀。取灭过菌的滤纸片，使其在药液中充分浸润，滤去多余药液，轻放于该培养基上，使其与培养基贴合。每个平皿中等距离放6个样品，每个菌株重复3次，超纯水和5%DMSO为空白对照。37℃恒温箱中培养16h（真菌培养24h）后取出，用游标卡尺测抑菌圈直径。3.2.2有效部位最小抑菌浓度的初步测定用灭过菌的超纯水将筛选出的有效部位稀释成50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625mg/mL浓度的供试液。取灭过菌的滤纸片在药液中充分浸润，滤去多余药液，轻放于培养基上，使其与培养基贴合。每个平皿中等距离放6个样品，每个菌株重复3次。放于37℃恒温箱中培养16小时（真菌培养24小时）后取出观察抑菌情况，以产生抑菌圈的最低药物浓度作为该药物对该菌株的最小抑菌浓度(MIC)。3.3实验结果与结论3.3.1月季花水提物抗菌活性有效部位筛选的试验结果月季花水煎煮提取物三个极性部位在100mg/kg浓度时产生的抑菌圈直径如表3.1。乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌及白色念珠菌都有抑制作用；正丁醇部位只对金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌有抑制作用；水部位只对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。说明乙酸乙酯部位是月季花抗菌活性的主要有效部位。乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌的抑制作用最好，抑菌圈直径达到23.82mm，敏感度最高。表3.1月季花水提物各极性部位抗菌活性测定结果月季花对金黄色葡萄球菌及藤黄微球菌的抑制作用都比对大肠杆菌、铜绿假单胞菌及真菌好，说明月季花对阳性菌有更好的抑制作用。3.4结论本试验首次对月季花抗菌活性的有效部位进行了考察。用两种革兰氏阳性菌、两种革兰氏阴性菌及一种真菌对月季花水提物各极性部位的抗菌活性进行检测，试验发现，在这三个极性部位中，乙酸乙酯部位对各个菌株的抑制作用最好，认为乙酸乙酯部位为月季花抗菌活性的主要部位。三、月季花水提物对肺癌细胞抑制作用的试验4.1实验材料4.1.1实验用细胞人肺癌细胞株A549中国科学院上海细胞库4.1.2实验用主要试剂4.1.3实验用主要仪器恒温水浴箱江苏金坛中大仪器厂水套式CO2培养箱力康发展有限公司高压蒸汽灭菌器HIRAYAMA恒温振荡器国华精密可调微量移液器Eppendof电子天平上海精科天平公司倒置生物显微镜奥林巴斯全自动酶标仪Bio-Rad公司高速低温离心机日本日立公司冰箱海尔超低温冰箱日本磷酸缓冲溶液(PBS)的配制：称取NaCl，1.6g；KCl，0.04g；Na2HPO4，0.696g；KH2PO4，0.04g，于200mL超纯水中溶解，调pH至7.35，高压蒸汽灭菌避光保存于4℃环境下，备用。MTT溶液配制：称取MTT25mg加入50mLPBS溶液溶解，用0.22µm微孔滤膜过滤除菌，避光保存于4℃环境下，现用现配。0.25%胰蛋白酶称取125mg胰蛋白酶粉末于50mLPBS缓冲溶液中，调pH至7.4，过滤除菌后分装，在-20℃环境下保存备用。0.04%台盼蓝溶液的制备：取0.02g台盼蓝粉末于50mL超纯水中，过滤除菌后分装，在4℃环境下保存备用。4.2实验方法本实验采用MTT法测定月季花水煎煮提取物各极性部位对肺癌A549细胞的抑制作用。MTT测定法的原理[76]：活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色甲臢，死细胞中该酶消失，MTT不被还原，用DMSO溶解甲臢后可用酶标仪在参考波长450nm，检测波长570nm处检测吸光度，吸光度与活细胞数成正比。一般，单个化合物样品的IC50小于10µg/mL，提取物或浸膏样品的IC50小于50µg/mL，认为该样品在体外对该肿瘤细胞有杀伤活性[76]。4.2.1肺癌细胞的培养细胞的传代将肺癌A549细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37℃、5%C02饱和湿度培养箱中进行培养。当细胞的汇合度达到90%时，弃去上清液，加入PBS溶液洗涤2次；加入0.25%的胰蛋白酶溶液，37℃下消化1min左右，出现细胞收缩，细胞间隙变大时，将胰蛋白酶溶液倒掉，加入5mL细胞培养液，用吸管轻轻吹打，使贴壁细胞悬浮。按1:2或1:3比例每2~3天传代培养一次。单细胞悬液的制备取培养3~4天处于生长对数期的细胞一瓶，用0.25%胰蛋白酶消化，使贴壁细胞脱落，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，轻轻吹打细胞使之成单细胞悬液，待其充分混匀后，与0.04%台盼蓝1:1混合染色后在倒置显微镜下作细胞计数。4.2.2MTT法测月季花水提物不同极性部位对肺癌A549细胞的生长抑制作用取对数生长期的人肺癌A549单细胞悬液，用培养基稀释调配成5×104个/mL的细胞悬液。取96孔板，每孔加细胞悬液100µL，于37℃、5%C02恒温箱中培养24小时。培养24小时后取出弃去原培养液，加入新鲜培养基和药液，使药液最终浓度为200、40、8、1.6、0.32µg/mL，每个浓度重复平行6孔。空白对照为含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，阴性对照只加等体积培养液不加药液，阳性对照为终浓度为16.7µmol/L的顺铂注射液溶液。将加好样的96孔板置于37℃、5%C02饱和湿度的恒温箱中培养72小时。取出，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20µL继续培养4小时，使MTT还原为甲臢。4小时后，取出弃去上清液，每孔加DMSO溶液150µL溶解甲臢，于水平摇床上在37℃摇匀，用酶标仪在570nm下测吸光度(A)值。癌细胞抑制率(%)=（阴性对照组平均A值－给药组平均A值）/（阴性对照组平均A值－空白组平均A值）×100%4.3结果与结论月季花水煎煮提取物各极性部位在各浓度(200、40、8、1.6、0.32µg/mL)下对肺癌A549细胞抑制作用的测定结果如表4.1。乙酸乙酯部位的IC50为15.23µg/mL，小于50µg/mL，正丁醇部位和水部位的IC50都大于50µg/mL。说明乙酸乙酯部位对肺癌A549有很好的杀伤作用，而正丁醇部位和水部位无此功效。表4.1月季花水提物各极性部位对肺癌A549细胞抑制作用的测定结果从中可看到乙酸乙酯部位对肺癌细胞的抑制作用明显比正丁醇部位和水部位的好。4.5结论本发明首次对月季花抗癌作用的活性部位进行了试验。通过对肺癌A549细胞体外抑制作用的试验发现，月季花水提取物各极性部位中乙酸乙酯部位对其抑制作用最好，其IC50可达15.23µg/mL。本发明生产工艺简单，节能环保，提高月季花资源整体利用率，生产成本低，易于工业化生产，并明确其中乙酸乙酯部位是具有降血糖、抗癌和抗菌活性的有效物质群，疗效确切可靠，安全无副作用，对糖尿病患者、癌症患者等人群的身体机能有显著效果，是糖尿病（中医称为消渴病）、癌症等疾病的保健和食疗康复问题上的创新，为月季花深层次开发提供了科学依据，也为月季花的综合开发利用奠定了坚实基础，经济和社会效益巨大。当前第1页1 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