本发明涉及多肽提取
技术领域：
，特别涉及一种动物睾丸提取物的制备方法。
背景技术：
：随着现代化生活节奏的加快，社会竞争日趋激烈，人际关系复杂紧张，人的心理失衡所致亚健康状态的情况日趋严重。亚健康状态是指无临床症状或症状感觉轻微，但已有潜在病理信息的机体状态，这是一类次等健康状态，界乎健康与疾病之间。世界卫生组织将机体无器质性病变，但是有一些功能改变的状态称为“第三状态”，即为亚健康状态。亚健康状态表现为一定时间的活力下降、功能和适应能力减退的症状。处于亚健康状态的人，如果及时进行疏导，会走出亚健康阴影，如果任其发展，则会转成疾病。亚健康高危人群中，糖尿病、高血压、肿瘤又是高危中的高危，如果不及时干预，会威胁人的生命，导致40岁就早亡的局面。根据病情的严重程度，亚健康状态包含着前后衔接的几个阶段：其中，与健康紧紧相邻的可称作“轻度心身失调”，它常以疲劳、失眠、胃口差、情绪不稳定等为主症，但是这些失调容易恢复，恢复了则与健康人并无不同，轻度心身失调状态人群约占总人群的25％～28％。这种失调若持续发展，可进入“潜临床”状态，此时已呈现出发展成某些疾病的高危倾向，潜伏着向某病发展的高度可能，潜临床状态人群超过总人群的1/3，且在40岁以上的人群中比例陡增。可见，以慢性疲劳为主要症状的亚健康问题是21世纪威胁人类健康的重大问题，且发生率呈逐年增加的趋势。因此，如何减少亚健康状态人群，增加健康状态人群成为近来国内外医学研究的热点。动物睾丸内含丰富的睾酮、动物蛋白和多肽，具有补肾壮阳、滋阴益精、抗疲劳、促进男性腺发育等的作用。睾酮又称睾丸素或睾丸酮，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。睾酮会影响许多身体系统和功能，包括：血生成，体内钙平衡，骨矿化作用，脂代谢，糖代谢和前列腺增长。它是主要的男性性激素及同化激素。不论是男性或女性，它对健康有着重要的影响，包括增强力量、免疫功能、对抗骨质疏松症等功效。养殖动物睾丸具有食材的的典型属性，与其它补肾药食同源原料相比，安全特性更高。目前公开的睾丸提取技术，多采用水提或酶辅助提取方法实现，提取产物未经精制。而且，由于睾酮不溶于水，现有的提取方法损失了90％以上的睾酮，造成活性成分的极大损失，提取效率和产物活性都比较低。因此需要提供一种收率高且活性成分含量高的睾丸提取物制备方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种动物睾丸提取物的制备方法。该制备方法获得活性多肽的含量高，且产率较高。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种动物睾丸提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤1：将动物睾丸匀浆，酶解提取，得到酶解粗提液和滤渣；步骤2：酶解粗提液经超滤得到超滤液，超滤液再经琼脂糖凝胶氢键吸附色谱方法去除高分子杂质，得到酶解提取精制液；滤渣采用乙醇提取浓缩，得到浓缩醇提液；步骤3：将酶解提取精制液与浓缩醇提液混合，冷冻干燥，得到动物睾丸提取物。在本发明提供的一些实施例中，动物睾丸选自猪、牛、马、羊、兔、狐狸中任意一种或几种动物的睾丸。作为优选，步骤1中酶解提取包括以下步骤：睾丸匀浆与水混合，调节pH至7.0～9.0；加入蛋白酶，37～50℃条件下酶解2～8小时，得到酶解液；酶解液升温至80～95℃，保温5～20分钟，使酶灭活；灭酶后的酶解液经过滤，得到酶解粗提液和滤渣。作为优选，蛋白酶为胰蛋白酶或碱性蛋白酶的一种或两种。作为优选，蛋白酶的添加量为睾丸匀浆重量的0.1％～0.5％。在本发明提供的一些实施例中，步骤1中酶解提取包括以下步骤：步骤1：睾丸匀浆与水1:1混合，调节pH至7.0～9.0。步骤2：加入蛋白酶，37～50℃条件下酶解2～8小时。蛋白酶，为胰蛋白酶或碱性蛋白酶的一种或两种，添加量为睾丸匀浆重量的0.1％-0.5％。步骤3：酶解液升温至80～95℃，保温5～20分钟，使酶灭活。步骤4：灭酶后的酶解液经300目纱布过滤，得到酶解粗提液和滤渣。作为优选，步骤2中超滤采用的超滤膜的截留分子量为10KD。作为优选，琼脂糖凝胶氢键吸附色谱为：采用具有亲和配基的琼脂糖凝胶为填料的亲和层析色谱；亲和配基为槲皮素配基、没食子酸配基、β-环糊精配基的一种。在本发明提供的一些实施例中，琼脂糖凝胶氢键吸附色谱方法具体为：用水调节超滤液的多肽含量为15～45mg/mL，采用5～8mL/min的流速上样吸附，上样量为柱体积的10～20％；依次用初始流动相洗脱2倍柱床体积，纯水洗脱2倍柱床体积，2％～9％乙酸线性梯度洗脱6～10倍柱床体积，最后用9％乙酸洗脱2倍柱床体积，洗脱流速10～30mL/min；收集吸光度为280nm、活性大于10％的洗脱峰，合并为酶解提取精制液。作为优选，初始流动相为乙醇、乙酸和水组成的溶液，乙醇在初始流动相中的体积百分浓度为20％-30％，乙酸在初始流动相中的体积百分浓度为2～5％。作为优选，乙醇提取浓缩包括以下步骤：(1)滤渣与乙醇水溶液按重量体积比1：(3～8)混合，50～100转/分钟搅拌提取1～3小时，所得提取液经离心，收集上清液；重复提取2～3次后，合并上清液；(2)所得上清液经减压浓缩至原体积的1/10～1/8，得到浓缩醇提液，回收乙醇；减压浓缩的浓缩压力为0.05～0.15MP，减压浓缩过程中控制上清液的温度不超过65℃。在本发明提供的一些实施例中，乙醇提取浓缩包括以下步骤：(1)滤渣与95％乙醇按重量体积比1：3～8混合，50～100转/分钟搅拌提取1～3小时。提取物经3000转/分钟离心10～20分钟，收集上清液。重复提取2～3次后，合并离心上清液。(2)离心上清液经减压浓缩，至体积为原来的1/10～1/8，得到浓缩醇提液，回收乙醇。在本发明提供的实施例中，动物睾丸提取物的制备包括以下具体步骤：(1)动物睾丸剥离附睾脂肪，清洗除去表面少量血污后，胶体磨磨碎，得到睾丸匀浆。(2)睾丸匀浆与水按重量体积比1：1混合，调节混合液的pH值至7.0～9.0。(3)加入按睾丸匀浆重量的0.1％～0.5％加入蛋白酶，37～50℃酶解2～8小时。(4)酶解液升温至80～95℃，保温5～20分钟，使酶灭活。(5)灭酶后的酶解液用300目纱布过滤，得到酶解粗提液和滤渣。(6)步骤(5)所得酶解粗提液经10KD超滤膜超滤，得到超滤液。(7)步骤(6)所得超滤液经琼脂糖凝胶亲和层析，收集合并，得到酶解精制液。(8)步骤(5)所得滤渣与95％乙醇按重量体积比1：3～8混合，50～100转/分钟搅拌提取1～3小时。提取物经3000转/分钟离心10～20分钟，收集上清液。重复提取2～3次后，合并离心上清液。(9)醇提上清液在0.05～0.15MP，温度不超过65℃条件下减压浓缩，回收乙醇，使醇提上清液体积浓缩至原来的1/10～1/8，得到浓缩醇提液。(10)步骤(7)得到的酶解提取精制液与浓缩醇提液混合，冷冻干燥，粉碎混匀，得到富含睾酮和活性肽的动物睾丸提取物。在本发明提供的实施例中，为提高提取物的生物活性，采用含亲和配基的琼脂糖凝胶层析色谱富集酶解提取超滤液中的活性肽类。琼脂糖凝胶亲和层析色谱是按下述步骤实现的：(1)琼脂糖凝胶溶胀：含有亲和配基的琼脂糖凝胶与蒸馏水按1:10的重量体积比混合，60℃加热2h后，室温静止22h；亲和配基为槲皮素配基、没食子酸配基、β-环糊精配基的一种；(2)装柱：溶胀后的琼脂糖凝胶装入中空玻璃管柱，用蒸馏水冲洗5～10倍柱床体积，冲洗流速为50～80mL/min；(3)平衡：用2～5倍柱床体积的初始流动相冲洗层析柱，流速为15～30mL/min。初始流动相为乙醇、乙酸和水组成的溶液，乙醇浓度为20％-30％，乙酸浓度为2％～5％；(4)上样：用水调节睾丸酶解提取超滤液的多肽含量为15～45mg/mL，采用5～8mL/min流速连续上样，上样体积为柱床体积的10％～20％；(5)洗脱：依次用初始流动相洗脱2倍柱床体积，纯水洗脱2倍柱床体积，2％～9％乙酸线性梯度洗脱6～10倍柱床体积，最后用9％乙酸洗脱2倍柱床体积，洗脱流速10～30mL/min；(6)收集：收集吸光度为280nm、活性大于10％的脱峰，合并为酶解提取精制液。在本发明中使用过的琼脂糖凝胶亲和吸附层析柱，可经初始流动相再次平衡后，可重新使用。本发明提供了一种动物睾丸提取物的制备方法。该动物睾丸提取物的制备方法包括：步骤1：将动物睾丸匀浆，酶解提取，得到酶解粗提液和滤渣；步骤2：酶解粗提液经超滤得到超滤液，超滤液再经琼脂糖凝胶氢键吸附色谱方法去除高分子杂质，得到酶解提取精制液；滤渣采用乙醇提取浓缩，得到浓缩醇提液；步骤3：将酶解提取精制液与浓缩醇提液混合，冷冻干燥，得到动物睾丸提取物。本发明具有的有益效果为：1、睾丸提取制备工艺中采用工具酶提取、过滤、超滤、琼脂糖氢键吸附色谱分离纯化相结合的方法，使提取物中小分子多肽类活性物质得到富集；2、通过滤渣醇提，回收了滤渣中不溶于水的睾酮，不仅减少了睾丸中活性成分的损失，还提高了提取物的活性成分含量；3、该制备工艺得到的提取物产品纯度高，杂质少，安全性好，质量稳定；4、睾丸提取物的制备工艺不涉及过多化学试剂，溶剂易于回收安全有效，经济实用性好。具体实施方式本发明公开了一种动物睾丸提取物的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。各项指标的具体检测方法：A.多肽含量：采用福林酚测定法检测多肽含量。所用试剂和具体操作法如下：试剂：碱性铜试液取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400mL使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50mL使溶解，另取硫酸酮0.25g，加水30mL使溶解，将两液混合，作为乙液。临用前，合并两液，并加水至500mL。操作法：(1)对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1mL含0.3mg的溶液。(2)供试品溶液的制备照各药品项下的方法制备。(3)标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mL，分别置具塞试管中，各加水至1.0mL，再分别加入碱性铜试液1.0mL，摇匀，各加入福林酚试液(1→16)4.0mL，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴中10分钟，在650nm的波长处测定吸收度；同时以0号管作为空白。以吸收度与相应的对照品溶液浓度计算回归方程。(4)测定法精密量取供试品溶液1.0mL，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入碱性铜试液”起，依法测定，由回归方程计算供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，即为多肽含量。B.睾酮：液相色谱-串联质谱法测定样品中的睾酮含量(参照食品国家标准GB/T20758《牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量的测定液相色谱-串联质谱法测定》)C.总氮：半微量法测定样品中的总氮(参照中国药典2010版二部附录ⅦD)。D.脂肪含量：利用酸水解法测定脂肪含量。精确称取样品1.0g左右，放入50ml大试管中，加入8ml的水用玻璃棒充分搅匀，加10ml盐酸，混匀后于70～80℃水浴，每隔10min左右搅匀一次直至脂肪游离为止，约需40～50min。取出静止冷却后，加入10ml乙醇，混合，冷却后将混合物移入100ml具塞筒中，用25ml乙醚分次冲洗试管，洗液一并倒入具塞筒中，加塞震摇1min，将塞子慢慢转松放气后再塞好，静止15min，小心开塞，用石油醚-乙醚等量混合液冲洗塞及筒中附着的脂肪，静止10～20min，待上清液体清晰，吸出上清于已恒重的锥形瓶中，再加5ml乙醚于具塞筒内震摇，静置后仍将上层乙醚吸出放入锥形瓶。将锥形瓶水浴蒸干，置105℃烘箱干燥2h，称重。E.活性：采用T细胞活性检测(脱E受体法)。①脱E受体胸腺T细胞悬液的制备：取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，经100目筛过滤，每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，加入少量Hank’s液打匀，将此溶液加入已具有1/3滤液量的分离液的离心管中，以每分钟2000转离心20分钟，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入适量Hank’s液，混匀，45℃恒温水浴保温30分钟(每隔5分钟振摇一次)。以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，再加入适量Hank’s液，混匀后，置45℃恒温水浴保温30分钟，取出后以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清夜。用Hank’s洗涤三次(操作同前)，最后用Hank’s液适当稀释并计数，使最终浓度为每1ml中(3×106)～(5×106)个细胞。②绵羊红血球悬液的制备：取适量羊血，用Hank’s液洗三次(同前)。弃去上清液，加适量Hank’s液稀释并计数，使最终浓度为脱E受体胸腺T细胞悬液浓度的8～10倍。③供试品溶液的制备：取供试品，用Hank’s液配制成每1ml中含1mg的溶液。④测定：取小试管6支，其中3支各加Hank’s液0.1ml作对照管，另3支各加供试品溶液0.1ml作测定管，每管中各加脱E受体胸腺T细胞悬液0.2ml，37℃保温1小时后，加入绵羊红血球悬液0.2ml，摇匀，以每分钟500转离心3分钟，放入4℃冰箱过夜，次日取出，弃去上清夜，每管中各加入固定液一滴，轻轻摇匀，静置10分钟，加入染色液2滴并摇匀，静置15分钟后开始计数，显微镜视野中淡蓝色的较大的细胞为淋巴细胞，共数计数板16个大方格上所有淋巴细胞的个数(不少于200个)，统计其中的E玫瑰花结形成的细胞数(结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞)，求得结花百分率，取平均值。即为供试品管或对照管的平均值。样品活力＝供试品测定管E玫瑰花结百分率—对照管E玫瑰花结百分率。本发明提供的动物睾丸提取物的制备方法中所用材料、试剂或仪器均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1不同配基琼脂糖凝胶吸附色谱分离效果比较1、羊睾丸酶解提取精制液的制备(1)取新鲜冷冻的兔睾丸5kg，去除脂肪且冲洗干净，得净重3.86Kg。加入等重量纯化水，常温下匀浆2次。(2)将匀浆液调节pH至9.0，加入3.8g(0.1％)碱性蛋白酶，50℃进行酶解温度3小时。反应完之后95℃变性5min以终止酶解反应，冷却至室温。(3)调节酶解液pH至7.5，加入7.6g(0.2％)胰蛋白酶，37℃酶解2小时后，升温至85℃，保持15分钟，300目无纺布过滤，得酶解粗提液和滤渣1.6kg。(4)上述羊睾丸酶解粗提液用10KD超滤膜超滤澄清，得到微黄色澄清透明溶液5.66升，多肽含量为46.95mg/L。2、层析柱准备1)凝胶溶胀含槲皮素配基、没食子酸配基和β-环糊精配基的琼脂糖凝胶分别与蒸馏水按1:10的重量体积比混合，60℃加热2h后，室温静止22h。2)装柱溶胀后的琼脂糖凝胶装入中空玻璃管柱，用蒸馏水冲洗10倍柱床体积，冲洗流速为50mL/min。3)平衡用5倍柱床体积的初始流动相冲洗层析柱，冲洗流速为25mL/min。始流动相为乙醇-乙酸水溶液，乙醇浓度为25％，乙酸浓度为3％。按上述方法，准备好实验型槲皮素配基琼脂糖凝胶亲和层析柱、没食子酸配基琼脂糖凝胶亲和层析柱和β-环糊精配基琼脂糖凝胶亲和层析柱各1根。层析柱直径1.5cm，高60cm。3、上样用水调节羊睾丸酶解超滤液的多肽含量为15mg/mL，用蠕动泵连续上样，上样流速为8mL/min。上述三根层析柱上样体积为20mL，为柱床体积的18.8％。4、洗脱先用初始流动相，15mL/min洗脱2倍柱床体积；再蒸馏水10mL/min洗脱2倍柱床体积；再用8倍柱床体积的乙酸溶液进行线性梯度洗脱。线性梯度洗脱期间，乙酸浓度逐步从2％升高9％，乙酸线性梯度流速逐步从15mL/min升高到30mL/min。最后用9％乙酸溶液，30mL/min洗脱2倍柱床体积。5、收集收集吸光度为280nm、活性大于10％的洗脱峰，合并为羊睾丸酶解提取精制液。6、结果检测计算检测酶解提取精制液的体积，检测其活性指数，结果见下表1。表1不同方法检测酶解提取精制液的活性结果方法精制液体积(mL)活性(％)槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附层析15.520.2没食子酸配基琼脂糖凝胶氢键吸附层析16.315.4B-环糊精配基琼脂糖凝胶氢键吸附层析12.912.8比较后发现，三种配基琼脂糖凝胶的分离能力依次为：槲皮素配基＞没食子酸配基＞β环糊精配基，因此，优选槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱进行活性肽分离。实施例2乳猪睾丸酶解提取1、乳猪睾丸酶解提取精制液的制备(1)取新鲜冷冻的乳猪睾丸4.2kg，去除脂肪且冲洗干净，得净重3.1Kg，加入等重量蒸馏水，常温下匀浆2次。(2)将匀浆液调节pH至7.5后，加入9g(0.3％)胰蛋白酶，37℃酶解时间3h后，升温至90℃，保温10min使酶变性，冷却至室温，300目无纺布过滤，得乳猪睾丸酶解粗提液和滤渣1.3kg。(3)上述酶解粗提液用10KD超滤膜超滤澄清，得到微黄色澄清透明溶液4.83升，多肽含量为36.35mg/mL。(4)上述超滤液经槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附层析色谱分离纯化，得到酶解提取精制液3.6L，多肽含量为9.63mg/mL，活性为25.8％。步骤(4)中槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱层析纯化乳猪睾丸酶解液试验具体为：层析柱准备(1)凝胶溶胀含槲皮素配基的琼脂糖凝胶与蒸馏水按1:10的重量体积比混合，60℃加热2h后，室温静止22h。(2)装柱溶胀后的琼脂糖凝胶装入不锈钢层析柱，用蒸馏水冲洗5倍柱床体积，冲洗流速为75mL/min。(3)平衡用2倍柱床体积的初始流动相冲洗层析柱，冲洗流速为15mL/min。始流动相为乙醇-乙酸水溶液，乙醇浓度为20％，乙酸浓度为2％。参照上述方法，准备好直径20cm，高145cm的层析柱，柱床体积为45.53L。上样用水调节乳猪睾丸酶解超滤液的多肽含量为15mg/mL，用蠕动泵连续上样，上样流速为8mL/min。洗脱先用初始流动相，15mL/min洗脱2倍柱床体积；再蒸馏水10mL/min洗脱2倍柱床体积；再用8倍柱床体积的乙酸溶液进行线性梯度洗脱。线性梯度洗脱期间，乙酸浓度逐步从2％升高9％，乙酸线性梯度流速逐步从15mL/min升高到30mL/min。最后用9％乙酸溶液，30mL/min洗脱2倍柱床体积。收集收集吸光度为280nm、活性大于10％的洗脱峰，合并为酶解提取精制液，体积为3.6L。经检测，乳猪睾丸酶解提取精制液的活性为25.8％，多肽含量为9.63mg/mL。2、乳猪睾丸醇提浓缩液的制备(1)乳猪睾丸酶解滤渣1.3kg与6.5L95％乙醇混合,75转/分搅拌提取2h后，3000转/分离心15min，得上清液5.9L；(2)第1次离心沉淀与4L95％酒精酒精混合，100转/分搅拌提取2h后，3000转/分离心15min，得上清液3.6L；(3)合并2次离心得到的上清液，于0.1MPa，60℃减压浓缩至体积约为1L的混悬液，睾酮含量为86.15mg/L。3、乳猪睾丸提取物的制备3.6L酶解提取精制液与1L混合，冷冻干燥，得乳猪睾丸提取物138.65g。实施例3大猪睾丸的酶解提取1、大猪睾丸酶解提取精制液的制备(1)取新鲜冷冻的大猪睾丸10kg，去除脂肪且冲洗干净，得净重7.86Kg。加入等重量蒸馏水，常温下匀浆2次。(2)将匀浆液调节pH至8.5后，加入31.4g(0.4％)碱性蛋白酶进行反应，酶解温度为50℃，酶解时间为5h。反应完之后85℃变性15min以终止酶解反应。变性后冷却至室温，300目无纺布过滤，得酶解粗提液和3.2kg滤渣。(3)上述大猪睾丸酶解粗提液用10KD超滤膜超滤澄清，得到微黄色澄清透明溶液11.26升，多肽含量为48.09mg/L。(4)上述超滤液经槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱层析分离纯化，得到大猪酶解提取精制液7.3L，多肽含量为11.63mg/mL，活性为21.6％。步骤(4)中槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱层析纯化大猪睾丸酶解液试验具体为：层析柱准备采用制备过乳猪睾丸酶解精制液的槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附层析柱，用5倍柱床体积的初始流动相冲洗层析柱，冲洗流速为30mL/min。始流动相为乙醇-乙酸水溶液，乙醇浓度为30％，乙酸浓度为5％。上样用水调节大猪睾丸酶解超滤液的多肽含量为45mg/mL，用蠕动泵连续上样，上样流速为5mL/min。洗脱先用初始流动相，15mL/min洗脱2倍柱床体积；再蒸馏水10mL/min洗脱2倍柱床体积；再用6倍柱床体积的乙酸溶液进行线性梯度洗脱。线性梯度洗脱期间，乙酸浓度逐步从2％升高9％，乙酸线性梯度流速逐步从15mL/min升高到30mL/min。最后用9％乙酸溶液，30mL/min洗脱2倍柱床体积。收集收集吸光度为280nm、活性大于10％的洗脱峰，合并为酶解提取精制液，体积为7.3L。2、大猪睾丸醇提浓缩液的制备(1)上述3.2kg滤渣与16L95％乙醇混合，75转/分搅拌提取3小时，3000转/分离心15min，得上清液14.8L；(2)第1次离心沉淀与10L95％乙醇混合，50转/分搅拌提取3小时，3000转/分离心20min，得上清液9.1L；(3)两次离心所得上清液合并，0.05MPa，60℃减压浓缩至体积约为2.5L混悬液，检测睾酮含量为199.37mg/L。3、大猪睾丸提取物的制备上述7.3L大猪酶解提取精制液与2.5L醇提浓缩液混合，冷冻干燥，得大猪睾丸提取物265.29g。实施例4牛睾丸的酶解提取1、牛睾丸酶解提取精制液的制备(1)取10kg新鲜冷冻的牛睾丸，去除脂肪且冲洗干净，得净重8.16Kg。加入等重量蒸馏水，常温下匀浆2次。(2)将匀浆液调节pH至9.0后，加入24.5g(0.3％)碱性蛋白酶50℃酶解3小时后，80℃灭酶20分钟，冷却至室温。(3)冷却后的酶解液调pH至7.5，加入胰蛋白酶16.3g(0.2％)继续酶解5小时，之后90℃变性10min以终止酶解反应，变性后冷却至室温，300目无纺布过滤，得酶解粗提液和滤渣3.6kg。(4)上述牛睾丸酶解粗提液用10KD超滤膜超滤澄清，得到微黄色澄清透明溶液12.10升，多肽含量为54.78mg/L。(5)上述超滤液经槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱层析分离纯化，得到酶解提取精制液8.2L，多肽含量为12.56mg/mL，活性为18.2％。步骤(5)中槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱层析纯化牛睾丸酶解液试验具体为：层析柱准备采用制备过大猪睾丸酶解精制液的槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附层析柱，用4倍柱床体积的初始流动相冲洗层析柱，冲洗流速为25mL/min。始流动相为乙醇-乙酸水溶液，乙醇浓度为25％，乙酸浓度为3.5％。上样用水调节牛睾丸酶解超滤液的多肽含量为40mg/mL，用蠕动泵连续上样，上样流速为6mL/min。洗脱先用初始流动相，15mL/min洗脱2倍柱床体积；再蒸馏水10mL/min洗脱2倍柱床体积；再用6倍柱床体积的乙酸溶液进行线性梯度洗脱。线性梯度洗脱期间，乙酸浓度逐步从2％升高9％，乙酸线性梯度流速逐步从15mL/min升高到30mL/min。最后用9％乙酸溶液，30mL/min洗脱2倍柱床体积。收集收集吸光度为280nm、活性大于10％的洗脱峰，合并为酶解提取精制液。由于牛酶解超滤液体积较大，上述上样、洗脱分2次完成，第一次上样体积为10L，洗脱完成后，收集5.1L酶解提取精制液。再用4倍柱床体积的流动相(乙醇-乙酸水溶液，乙醇浓度为25％，乙酸浓度为5％)，30mL/min重新平衡层析柱后，再次上样6.6L，洗脱后，收集到3.1升酶解提取精制液，两次精制液合并使用。经检测，牛睾丸酶解提取精制液的活性为18.2％，多肽含量为12.56mg/mL。2、牛睾丸醇提浓缩液的制备(1)牛睾丸酶解滤渣3.6kg与18L95％酒精混合,100转/分搅拌提取3h后，3000转/分离心20min，得上清液16.7L；(2)第1次离心沉淀与12L95％酒精混合，75转/分搅拌提取2h后，3000转/分离心15min，得上清液11.2L；(3)第2次离心沉淀与12L95％酒精混合，50转/分搅拌提取1h后，3000转/分离心10min，得上清液10.5L；(4)合并3次离心得到的上清液，于0.05MPa，65℃减压浓缩至体积约为3.9L混悬液，睾酮含量为251.60mg/L。3、牛睾丸提取物的制备8.2L酶解提取精制液与3.9L醇提浓缩液混合，冷冻干燥，得牛睾丸提取物484.55g。实施例5兔睾丸的酶解提取1、兔睾丸酶解提取精制液的制备(1)取新鲜冷冻的兔睾丸3kg，去除脂肪且冲洗干净，得净重1.95Kg。加入等重量蒸馏水，常温下匀浆2次。(2)匀浆液调节pH至7.5，加入1.95g(0.1％)胰蛋白酶，40℃酶解2小时，升温80℃后保持20min以终止酶解反应，冷却至室温，300目无纺布过滤，得酶解粗提液和滤渣0.8kg。(3)上述兔睾丸酶解粗提液用10KD超滤膜超滤澄清，得到微黄色澄清透明溶液2.6升，多肽含量为29.75mg/L。(4)上述超滤液用槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱层析分离纯化，得到酶解提取精制液1.9L，多肽含量为7.13mg/mL，活性为22.5％。步骤(4)中槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱层析纯化兔睾丸酶解液试验具体为：层析柱准备采用制备过牛睾丸酶解精制液的槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附层析柱，用3倍柱床体积的初始流动相冲洗层析柱，冲洗流速为20mL/min。始流动相为乙醇-乙酸水溶液，乙醇浓度为25％，乙酸浓度为2.5％。上样用水调节兔睾丸酶解超滤液的多肽含量为25mg/mL，用蠕动泵连续上样，上样流速为7.5mL/min。洗脱先用初始流动相，15mL/min洗脱2倍柱床体积；再蒸馏水10mL/min洗脱2倍柱床体积；再用8倍柱床体积的乙酸溶液进行线性梯度洗脱。线性梯度洗脱期间，乙酸浓度逐步从2％升高9％，乙酸线性梯度流速逐步从15mL/min升高到30mL/min。最后用9％乙酸溶液，30mL/min洗脱2倍柱床体积。收集收集吸光度为280nm、活性大于10％的洗脱峰，合并为酶解提取精制液。2、兔睾丸醇提浓缩液的制备(1)兔睾丸酶解滤渣0.8kg与6.4L95％乙醇混合,50转/分搅拌提取1h后，3000转/分离心10min，得上清液5.1L；(2)第1次离心沉淀与4L95％酒精混合，75转/分搅拌提取1h后，3000转/分离心20min，得上清液3.3L；(3)合并2次离心得到的上清液，于0.1MPa，65℃减压浓缩至体积约为1L的混悬液，睾酮含量为148.38mg/L。3、兔睾丸提取物的制备1.9L酶解提取精制液与1L醇提浓缩液混合，冷冻干燥，得兔睾丸提取物102.57g。实施例6羊睾丸的酶解提取1、羊睾丸酶解提取精制液的制备(1)取新鲜冷冻的兔睾丸5kg，去除脂肪且冲洗干净，得净重3.86Kg。加入等重量纯化水，常温下匀浆2次。(2)将匀浆液调节pH至9.0，加入3.8g(0.1％)碱性蛋白酶，50℃进行酶解温度3小时。反应完之后95℃变性5min以终止酶解反应，冷却至室温。(3)调节酶解液pH至7.5，加入7.6g(0.2％)胰蛋白酶，37℃酶解2小时后，升温至85℃，保持15分钟，300目无纺布过滤，得酶解粗提液和滤渣1.6kg。(4)上述羊睾丸酶解粗提液用10KD超滤膜超滤澄清，得到微黄色澄清透明溶液5.66升，多肽含量为46.95mg/L。(5)上述超滤液用槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱层析分离纯化，得到酶解提取精制液4.5L，多肽含量为10.63mg/mL，活性为22.3％。步骤(5)中槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附色谱层析纯化兔睾丸酶解液试验具体为：采用制备过兔睾丸酶解精制液的槲皮素配基琼脂糖凝胶氢键吸附层析柱，用3.5倍柱床体积的初始流动相冲洗层析柱，冲洗流速为20mL/min。始流动相为乙醇-乙酸水溶液，乙醇浓度为25％，乙酸浓度为3％。上样用水调节羊睾丸酶解超滤液的多肽含量为30mg/mL，用蠕动泵连续上样，上样流速为6.5mL/min。洗脱先用初始流动相，15mL/min洗脱2倍柱床体积；再蒸馏水10mL/min洗脱2倍柱床体积；再用10倍柱床体积的乙酸溶液进行线性梯度洗脱。线性梯度洗脱期间，乙酸浓度逐步从2％升高9％，乙酸线性梯度流速逐步从15mL/min升高到30mL/min。最后用9％乙酸溶液，30mL/min洗脱2倍柱床体积。收集收集吸光度为280nm、活性大于10％的洗脱峰，合并为酶解提取精制液，体积为4.5L。2、羊睾丸醇提浓缩液的制备(1)羊睾丸酶解滤渣1.6kg与8L95％酒精混合,100转/分搅拌提取3h后，3000转/分离心20min，得上清液6.9L；(2)第1次离心沉淀与5L95％酒精混合，75转/分搅拌提取2h后，3000转/分离心15min，得上清液4.2L；(3)第2次离心沉淀与5L95％酒精混合，50转/分搅拌提取12h后，3000转/分离心10min，得上清液4.1L；(4)合并3次离心得到的上清液，于0.1MPa，60℃减压浓缩至体积约为1.9L混悬液。检测睾酮含量为203.91mg/L。3、羊睾丸提取物的制备上述4.5L酶解提取精制液与1.8L醇提浓缩液混合，冷冻干燥，得羊睾丸提取物201.73g。对比例1羊睾丸提取液制备方法取新鲜羊睾丸，经组织捣碎机捣碎，加入三蒸水后反复冻融，用低温超速离心机离心，上清液经中空纤维超滤装置过柱，在无菌条件下过滤，封装成无色透明羊睾丸提取液。对比例2牛睾丸颗粒物制备方法选取新鲜健康的牛睾丸，纯化水洗3遍以上，至干净为止；将初洗净的牛睾丸放置于pH为7.0的缓冲生理盐水中浸泡，快速去除血水和其他附着物；将去除血水的牛睾丸切碎成8cm的小块，向牛睾丸小块中加入为牛睾丸重量2倍的蒸馏水，并加入牛睾丸重量2％的木瓜蛋白酶，调节pH为3在15℃酶解4h；去掉上清液，再将酶解后的牛睾丸小颗粒块过100目筛过滤，留取筛上固体物质，备用。试验例对比试验将实施例2-6和对比例1-2所获产品进行检测，检测结果见表2：表2各项指标检测结果对比上表试验数据可知，对比例1和对比例2的脂肪含量明显高于实施例2～6，睾酮含量(对比例1未检出睾酮含量)、多肽含量、产品活性明显低于实施例2～6。由此可知本专利制备方法能使睾丸分解的更加彻底，产生更多高价值的小分子，同时处理后的产品中杂质减少，产品纯度提高，产品活性也明显提高。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3