一种高持久性多效自交联流体凝胶及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种高持久性多效自交联流体凝胶及其制备方法与应用，属于天然生物医用材料领域。

背景技术：

由于老化、损伤和外伤、超重、一侧过度使用、关节或者相关的结构如骨骼、韧带和软骨等缺乏体育锻炼，可能会导致骨关节一系列的退行性疾病，对日常生活带来诸多不便。其中最常见的是骨关节炎(OA)。OA是目前美国中致残的主要原因，美国患者每年的相关治疗费用约5700美元。而目前全球内OA已经导致4300万人中度至重度残疾。我国膝关节关节炎患病率约为9.56％。对于OA目前没有根治的方法，通过注射黏弹性补充剂是缓解关节炎疼痛的重要方法。对于重度关节炎的手术中，也有应用黏弹性补充剂作为缓解患者术中疼痛的辅助手段。

目前市面上的关节黏弹性补充剂成分多为透明质酸。对透明质酸制品过敏或者患侧膝关节或关节周围有感染者，不能接受透明质酸类产品的注射治疗。对于鸟类蛋白、羽毛或鸡蛋制品过敏的患者，则应慎用提取自公鸡鸡冠的透明质酸产品，如Synvisc(欣维可)、Synvisc One、Hyalgan、3H玻璃酸钠和佰备。且透明质酸类黏弹性补充剂在体内留存时间较短，一般一个疗程内需要连续注射3～5针才能维持6个月的疗效，例如Euflexa、Hyalgan、和Supartz分别需要连续注射3次、5次、和3次才能维持26周的疗效，不仅给患者和医生带来诸多不便，同时也增加了患者就医成本。因此国外一些厂家通过选用高分子量的透明质酸或者通过交联的方式延长其在关节处的留存时间，以期达到更长的疗效。例如Gel one、Synvisc(欣维可)、Synvisc One中的透明质酸经过交联后，分别注射1针、3针和1针的疗效可达13周、26周和26周。

由于关节处存在透明质酸酶，因此要延长透明质酸类黏弹性补充剂的疗效，则需要对其分子量或者交联程度提出较高的要求，但同时也会大大增加注射顶推力，给注射带来困难。专利CN105131348A、CN103124558A和CN1326352A中制备的黏弹性补充剂包含两种组分，一是交联的透明质酸颗粒，起到延长制剂在体内留存时间的作用；另一种是未交联的透明质酸液体，起到减小注射阻力和增加制剂柔软度的作用。但是固液混悬的制剂形式，存在分散均匀性的问题，且颗粒会有堵塞注射器的风险，造成注射困难，或者需要使用直径更大的针头，给患者造成更大的创伤。

与透明质酸相比，壳聚糖无免疫原性，不会引起过敏反应；来源广泛，资源可再生，成本低；且结构与糖氨多糖近似，可参与蛋白多糖的代谢；其黏度与滑液近似，有良好的组织相容性；壳聚糖类可直接促进软骨增殖，减轻细胞损伤对关节内环境的干扰，从而达到保护和修复关节软骨，减缓关节退变的发生并缓解疼痛的作用，而透明质酸不能诱导软骨增殖；另外，壳聚糖类还具有一定的抗菌消炎作用。由于关节处没有降解壳聚糖及其衍生物的酶，因此其具有相对较好的耐酶解性能。

目前市面上基于几丁糖制备的黏弹性补充剂仅有一款。专利CN1306824A中介绍了水溶性医用几丁糖的制备及在防黏连和防治退变性关节炎中的应用。但该方法制备的几丁糖制剂及医用几丁糖黏弹性补充剂均未采用交联等方式，而其在体内仍存在自由基降解等，因此体内留存时间仍然有限，且组分为单一高分子组分，功能单一，注射初期虽能较好地发挥缓冲垫的作用，但促修复功能相对滞后。

多硫酸木聚糖，又名多硫酸戊聚糖(PPS)，来自于水青冈树，主要结构是半纤维素，平均分子量接近7500D。PPS可使滑膜细胞合成高分子量的透明质酸正常化，并抑制补体活化及白细胞核滑膜细胞的促炎性介质的释放，从而保护滑膜细胞，降低滑膜炎症。PPS还可促进软骨合成蛋白聚糖，强力抑制分解代谢。临床研究表明，对OA患者应用PPS，OA临床症状在治疗1个月后有明显改善，滑液黏弹性升高。

硫酸软骨素是构成软骨的重要成分之一，分子量相对较低，更容易被吸收进软骨，可直接参与软骨的构建，加速软骨的再生和修复，且具有一定的止痛作用。因此将硫酸软骨素和多硫酸木聚糖与羧甲基壳聚糖进行复配制备关节用黏弹性补充剂，可以起到协同增效的作用，提高产品在注射全周期内的吸收修复效果，并赋予产品一定的止痛功能并增加产品润滑性。

交联是目前提高黏弹性补充剂疗效的常用方法。但目前使用的交联剂多为化学交联剂。例如，DVS、BDDE、环氧氯丙烷等交联剂毒性大，生物相容性欠佳，产物中存在交联剂残留的风险。EDC或者氨基酸类作为交联剂时，虽然生物相容性较好，但是成本较高。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高持久性多效自交联流体凝胶及其制备方法与应用，本发明流体凝胶具有均相、高持久性、多效的特点；制备方法简单，采用物理自交联反应；应用具有生物安全性。

本发明提供的流体凝胶的制备方法，包括如下步骤：1)将水溶性壳聚糖置于水中溶解，得到水溶性壳聚糖水溶液；然后过滤，收集滤液；

2)将所述滤液进行反复冻融，得到高持久性自交联流体凝胶；

3)将所述高持久性自交联流体凝胶与功能调节剂混合，即得到所述流体凝胶。

本发明中，步骤1)所述水优选纯化水。

上述的制备方法中，所述水溶性壳聚糖为羧甲基壳聚糖和/或羟丙基壳聚糖；

所述水溶性壳聚糖的分子量可为10万～40万，具体可为10万、20万、30或10万～30万；

所述水溶性壳聚糖水溶液的浓度可为10～40mg/mL，具体可为10mg/ml、25mg/ml、40mg/ml、10～25mg/mL或25～40mg/mL。

本发明中，所述羧甲基壳聚糖羧化度可为80％～100％，具体可为82％；所述羟丙基壳聚糖的取代度可为0.4～1，具体可为0.6或0.4～0.6。

上述的制备方法中，步骤1)中，所述溶解的温度为10～80℃，具体可为30℃、50℃、65℃、30～50℃、50～65℃或30～65℃。

本发明中，步骤1)中过滤采用本领域常规的过滤方法。上述的制备方法中，步骤2)中，所述反复冻融包括如下步骤：先于-20℃～-40℃冷冻12～72h；再于0℃～30℃下解冻1～5h；所述反复冻融的次数为1～10次。

所述反复冻融具体包括如下1-4中任一种操作步骤：

1、置于-20℃冰箱中冷冻24h后，于10℃下解冻4h，如此反复冻融2次；

2、置于-30℃冰箱中冷冻36h后，于25℃下解冻3h，如此反复冻融6次；

3、置于-40℃冰箱中冷冻48h后，于20℃下解冻3h，如此反复冻融8次；

4、置于-20℃～-40℃冰箱中冷冻24～48h后，于10～25℃下解冻3～4h，如此反复冻融2～8次。

上述的制备方法中，制备所述功能调节剂包括如下步骤：将硫酸软骨素和多硫酸木聚糖溶解在pH缓冲液中制成。

上述的制备方法中，所述功能调节剂包括如下浓度的组份，单位以mg/ml计：

所述功能调节剂具体包括如下浓度的组份：

上述的制备方法中，所述硫酸软骨素的分子量为4000～8000道尔顿，具体可为4000道尔顿、5000道尔顿、6000道尔顿、4000～5000道尔顿、5000～6000道尔顿或4000～6000道尔顿；

所述多硫酸木聚糖的分子量为6000～8000道尔顿，具体可为6000道尔顿、7000道尔顿、8000道尔顿、6000～7000道尔顿或7000～8000道尔顿。

上述的制备方法中，所述高持久性自交联流体凝胶与功能调节剂的体积比为1:1。

本发明还提供了上述的制备方法制备得到的所述流体凝胶。

本发明进一步提供了所述流体凝胶制备治疗关节软骨修复材料中的应用；具体可制备治疗关节炎修复材料。

本发明具有以下优点：

1、本发明选用水溶性壳聚糖衍生物为黏弹性补充剂的主要功能成分，具有相对较好的耐酶性；自交联制备则进一步延长其体内留存时间，使其能发挥长效的隔离、润滑和缓冲外力的作用。

2、本发明通过交联法进一步延长其疗效时，对交联程度要求不高，且本发明制备的凝胶为均相流体凝胶，因此可以显著降低注射顶推力，不存在颗粒堵塞针头的风险，且使用较小针头即可顺利完成注射给药过程，明显降低注射产生的疼痛并减小对机体部位的损伤。

3、本发明能有效降低感染的机会、促进蛋白聚糖的合成，抑制分解代谢和滑膜炎症。采用相对分子质量较低的硫酸软骨素和多硫酸木聚糖，具有快吸收快修复的特点，在注射初期即可迅速发挥促修复的功能。随着硫酸软骨素和多硫酸木聚糖的逐渐消耗，大分子的水溶性壳聚糖逐渐降解成氨基多糖继续参与软骨合成和滑膜修复，且水溶性壳聚糖具有一定的抗菌消炎功能。本发明中三者协同作用保证了注射全周期内关节炎修复的及时性、有效性、持久性和多效性。

4、本发明的凝胶未使用交联剂，生物安全性好，仅通过反复冻融法使高分子间形成以强氢键和结晶区为物理交联点的三维凝胶网络结构。本发明制备方法绿色环保，简单易行。

附图说明

图1为本发明流体凝胶的注射图。

图2为本发明实施例3流体凝胶植入4周后关节滑膜的病理切片图；其中图2(a)为关节炎造模后的软骨病理切片图，图2(b)为本发明实施例3流体凝胶植入4周后关节软骨的病理切片图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、流体凝胶的制备

1)将羧甲基壳聚糖置于30℃纯化水中搅拌充分溶解后用G3砂芯漏斗过滤收集滤液，羧甲基壳聚糖的分子量、羧化度、浓度分别为10万、82％和10mg/ml；2)将步骤1)的羧甲基壳聚糖水溶液置于-20℃冰箱中冷冻24h后，于10℃下解冻4h，如此反复冻融2次，得到高持久性自交联流体凝胶；3)将硫酸软骨素和多硫酸木聚糖溶解在pH缓冲液中，硫酸软骨素浓度和分子量分别为20mg/ml和4000道尔顿，多硫酸木聚糖浓度和分子量分别为30mg/ml和6000道尔顿，NaH₂PO₄ 6.28mg/ml，Na₂HPO₄ 11.6mg/ml，NaCl9.4mg/ml；4)将步骤2)的凝胶与步骤3)的溶液按等体积比为1:1进行混合并均质，即得到本发明流体凝胶(又称均相的高持久性多效自交联流体凝胶)。

实施例2、流体凝胶的制备

1)将羟丙基壳聚糖置于50℃纯化水中搅拌充分溶解后用G3砂芯漏斗过滤收集滤液，羟丙基壳聚糖的分子量、取代度、浓度分别为20万、0.6和25mg/ml；2)将步骤1)的羟丙基壳聚糖水溶液置于-30℃冰箱中冷冻36h后，于25℃下解冻3h，如此反复冻融6次，得到高持久性自交联流体凝胶；3)将硫酸软骨素和多硫酸木聚糖溶解在pH缓冲液中，硫酸软骨素浓度和分子量分别为50mg/ml和5000道尔顿，多硫酸木聚糖浓度和分子量分别为60mg/ml和7000道尔顿，NaH₂PO₄ 6.28mg/ml，Na₂HPO₄ 11.6mg/ml，NaCl 9.4mg/ml；4)将步骤2)的凝胶与步骤3)的溶液按等体积比为1:1进行混合并均质，即得到本发明流体凝胶。

实施例3、流体凝胶的制备

1)将羧甲基壳聚糖置于65℃纯化水中搅拌充分溶解后用G3砂芯漏斗过滤收集滤液，羧甲基壳聚糖的分子量、羧化度、浓度分别为30万、90％和40mg/ml；2)将步骤1)的羧甲基壳聚糖水溶液置于-40℃冰箱中冷冻48h后，于20℃下解冻3h，如此反复冻融8次，得到高持久性自交联流体凝胶；3)将硫酸软骨素和多硫酸木聚糖溶解在pH缓冲液中，硫酸软骨素浓度和分子量分别为80mg/ml和6000道尔顿，多硫酸木聚糖浓度和分子量分别为60mg/ml和8000道尔顿，NaH₂PO₄ 6.28mg/ml，Na₂HPO₄ 11.6mg/ml，NaCl 9.4mg/ml；4)将步骤2)的凝胶与步骤3)的溶液按等体积比为1:1进行混合并均质，得到本发明流体凝胶。

实施例4、应用

1、推挤力实验

将各样品平衡至室温，注入5ml针管中，安装25G注射头，推挤针头前端少量的空气后，于万能材料试验机中在推挤速度为30mm/min的推动速度下进行测试，对照品选用某关节注射用医用几丁糖和Gel 结果如下：

表1高持久性多效自交联流体凝胶的推挤力测试结果

由表1可知，本发明实施例样品的推挤力与市面上玻璃酸钠注射液相当甚至更小，且远小于Gel 的推挤力。这说明本安发明样品更易注射。

2、粘度测试

采用旋转式粘度计，在剪切速率不小于0.25Hz、(25±0.1)℃条件下分别对实施例一、二、三的3个样品进行测试，对照品选用Gel 粘度结果如下：

表2高持久性多效自交联流体凝胶的粘度测试结果

由表2可知，本发明实施例样品的粘度均较Gel 小，这有利于降低注射时的顶推力，使产品更易注射。

3、细胞毒性实验

表3高持久性多效自交联流体凝胶的细胞毒性测试结果

取试验液，按照GB/T16886.5规定的方法试验和按GB/T14233.2-2005规定评级，结果表明本发明制备的样品细胞毒性符合要求。

4、抑菌性实验

采用生长速率法测定样品对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。将0.5ml样品加入至细菌培养基中混合均匀，以纯化水为阴性对照，以Gel 为阳性对照，测定样品对金黄色葡萄球菌的抑制效果。将培养基均匀加入至2个直径为9cm的培养基中，待完全凝固后，在每个培养基中接种2块直径为5mm的菌饼。在25℃下培养48h后，测量菌落直径，计算样品的抑菌率。

表4高持久性多效自交联流体凝胶的抑菌性实验结果

由表2可知，本发明制备的样品抑菌率可以达到70％-80％，这对于防止关节炎注射过程中的感染等具有重要意义。

5、关节炎治疗效果评价

取健康新西兰兔72只，随机分为12组，通过关节腔内注入木瓜蛋白酶溶液造成骨关节病变模型。造模后，试验组关节腔注射本发明实施例1、2、3分别为0.3ml，阴性对照组关节上腔注射生理盐水0.3ml，阳性对照关节注射用医用几丁糖，同样注射0.3ml。在给药后第1、2、3、4周处死，并进行病理学观察，记录病理积分。结果如表5和图2所示。

表5高持久性多效自交联流体凝胶的关节炎治疗效果

对各试验组结果进行统计学分析表明：注射黏弹性补充剂的实验组与阴性对照组有显著差异。1周时，本发明实施例3和对照品1对兔关节炎具有明显的改善作用；而在2～4周时，本发明实施例3的样品对兔关节炎具有更持久的缓解和修复作用；而对照品1对兔关节炎的缓解修复作用较短，因此在实际应用中需要每周注射一次，连续注射3～5次以保持相对较长的疗效。

由图2可知注射本发明的黏弹性补充剂后4周，软骨细胞增殖明显，滑膜上皮细胞点状增生，并有轻度血管增生，血运较好，恢复情况良好。