本发明涉及一种脱色的具有抗肿瘤活性的银杏外种皮提取物及其制剂的制备方法，属于中药制药技术领域。
背景技术：
银杏外种皮俗称白果衣，是白果最外层的肉质皮。江苏为银杏产区，外种皮资源极其丰富。银杏外种皮提取物（Ginkgo biloba exocarp extracts，GBEE）是本课题组从银杏的外种皮中提取的以多糖类化合物为主要成分的组合物，经研究发现GBEE具有显著的抗肿瘤作用，其胶囊制剂作为医院制剂在临床应用于恶性肿瘤患者多年，广受青睐，开发前景乐观。但GBEE与大多植物提取物类似，颜色偏深，制备口服液等剂型有可能影响患者的依从性（见施心建, 晏新连, 陈跃雪. 薄膜衣片颜色的选择依据[J]. 中国药业, 2007, 16(02):45-46）。故以往在制备GBEE固体制剂的过程中不得不加入多于原料药的白色赋形剂，使成品药物的颜色变浅。因此，如何对GBEE进行脱色处理，一直是本领域技术人员努力解决的技术难题。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有工艺的不足，提供一种脱色的具有抗肿瘤活性的银杏外种皮提取物及其制剂的制备方法。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现的，脱色的具有抗肿瘤活性的银杏外种皮提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将被乙醇浸泡过的干银杏外种皮置于煮提锅中常规加水煎煮 2 - 3 次并分别过滤，将滤液合并减压浓缩，得到浓缩液，将95-100 ％乙醇缓慢加入浓缩液中，使乙醇终浓度在 86 - 88%（V/V） ，边加边快速搅动，静置后将沉淀物再用高浓度乙醇洗涤数次后真空干燥或冷冻干燥，得GBEE粗粉；
（2）将GBEE粗粉配制成浓度为5-20mg/mL的水溶液，加入95-100%乙醇浸泡24h后的大孔吸附树脂，将溶液与树脂的混合物封口，置50-60℃水浴摇床，120-160r/min转速反应5-8h；
（3）反应结束后，过滤去除树脂，将滤液减压浓缩，向浓缩液中缓慢加入乙醇，使乙醇终浓度为60-80%（V/V），边加边快速搅动，静置沉淀6-10h；
（4）将沉淀物用高浓度乙醇洗涤1-2次后真空干燥或冷冻干燥，得到脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE。
步骤（1）中所述浓缩液的比重为 1.21 - 1.30。
步骤（2）中所述的大孔吸附树脂型号为D101、LX-60或LX-20，乙醇浸泡后需水洗至无醇味，GBEE粗粉：大孔吸附树脂的重量比为1：（8-15）（W/W）。
步骤（3）中所述的将滤液减压浓缩得到的浓缩液的比重为 1 .10 - 1 .20。
步骤（4）中所述的脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE，其水溶液（10mg/mL）在450nm下的OD值不高于0.200，其多糖含量与蛋白质含量之和大于80%，在10-320μg/ml剂量范围内其对HepG-2细胞的最高抑制率不低于65%。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的，脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE制剂的制备方法，将上述方法制备的脱色的GBEE干粉加入少量赋型剂或矫味剂和防腐剂，制成胶囊剂、片剂或口服液制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明具有科学性和可行性，工艺简单，实用性强，将GBEE粗粉制备成水溶液后，采用中性树脂吸附其中的小分子色素及无活性的游离物质，使最终提取物的颜色变浅，抗肿瘤效价提高，在无需使用大量白色赋形剂的条件下，所制备的片剂和口服液颜色柔和，观感佳，其多糖与蛋白质含量之和大于80%，抗肿瘤效果好。且树脂可回收再利用，经济实惠，适合工业化大生产。
1、颜色深浅测定
将脱色前和脱色后的GBEE干粉配制为10mg/ml,采用紫外-可见分光光度计于450nm处测定其水溶液的吸光度值（0D值），检测脱色效果。0D值越大，颜色越深。结果见表1。
表1脱色前后的GBEE水溶液OD值
表1结果显示，脱色后的GBEE水溶液0D值明显减小。
2、肽多糖含量的测定
采用苯酚硫酸法测多糖含量：精密称取无水葡萄糖标准品适量，用蒸馏水配成1mg /ml的葡萄糖标准液，再进一步稀释为不同浓度。精密量取浓度为30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml的葡萄糖标准溶液0.5ml于6支10ml具塞试管中，加入50mg/ml的重蒸酚溶液1ml，混合均匀后，加入5ml浓硫酸，混合均匀，沸水浴15min，冷水浴30min。用紫外分光光度计于490nm处测定吸光度，对葡萄糖溶液浓度和吸光度进行线性回归，建立回归方程。取脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE供试品溶液0.5ml，按上述操作测吸光度值，代入回归方程，计算出多糖含量。
采用考马斯亮蓝法测蛋白质含量：精密称取牛血清白蛋白标准品适量，用蒸馏水配成100μg/ml的蛋白标准溶液，再进一步稀释为不同浓度。精密量取浓度为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml蛋白标准溶液0.5ml分别于5支10ml具塞试管，再加入2.5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀后，放置5～10min，待其充分反应后，用紫外分光光度计于595nm处测定吸光度，对牛血清白蛋白溶液浓度和吸光度进行线性回归，建立回归方程。取脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE供试品溶液0.5ml，按上述操作测吸光度值，代入回归方程，计算出蛋白质含量。
肽多糖含量%=(多糖含量+蛋白质含量)%。
采用该方法制备的脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE其中多糖含量为58%、蛋白质含量为24%，肽多糖总含量为58%+24%=82%。
3、药效研究
取处于对数生长期的人肝癌HepG-2细胞，用胰蛋白酶消化、Hank’s液洗涤后用含10%小牛血清RPMI1640培养液调整细胞至1×105/ml。向96孔培养板各孔中分别加入上述细胞悬液100μl，在5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养24h后，加入用含10%小牛血清RPMI1640培养液配制的不同浓度的脱色的银杏外种皮提取物各 100μl，每个浓度设6个复孔，培养48h。培养结束前4h加入MTT（终浓度5mg/ml），继续培养4h后弃去培养液，加入酸化异丙醇，振荡10min，用酶标仪于570nm处测定各孔的OD值。按公式“抑制率=(1-药物孔OD值/对照孔OD值)×100%”，计算脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE体外对HepG-2细胞增殖的抑制率。结果见表2。
表2 脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE体外对HepG-2细胞的抑制作用
表2结果显示，脱色的GBEE在10-320μg/ml剂量下对Hepg-2肿瘤细胞具有直接抑制作用，而且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强。经SPSS软件统计，其IC50为53.3μg/ml。
具体实施方式
实施例1
取被乙醇浸泡过的干银杏外种皮 100 千克按料液比为1:8置于煮提锅中加水常规煎煮1 小时，过滤后继续加水重复上述煎煮方法 1 次并过滤，将 2 次的滤液合并，于 70℃ 减压浓缩至比重为 1.21 ，将95-100 ％的乙醇缓慢加入浓缩液中，使乙醇终浓度在86 %（V/V），边加边快速搅动，静置 6 小时后将沉淀物离心甩干，再用高浓度乙醇（体积浓度98%以上）洗涤 2 次后真空干燥或冷冻干燥，此即GBEE粗粉；称取此GBEE粗粉100g，配制成10mg/mL的水溶液，按1:8（W/W）加入D101大孔吸附树脂，将溶液与树脂的混合物封口后置55℃水浴摇床，120r/min转速反应6h；反应结束后，过滤去除树脂，将滤液减压浓缩至比重为1.10，向浓缩液中缓慢加入乙醇，使乙醇终浓度为60%（V/V），边加边快速搅动，静置沉淀6h；将沉淀物用高浓度乙醇洗涤数次后真空干燥或冷冻干燥，得到脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE。采用紫外-可见分光光度计于450nm处测定其水溶液（10mg/mL）的0D值，结果显示，GBEE粗粉水溶液的OD值为0.544，脱色的GBEE水溶液的OD值为0.156，颜色明显变浅。采用苯酚硫酸法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量，结果分别为57%及24%，肽多糖总含量为81%。采用MTT法体外检测对HepG-2细胞增殖的影响，接种细胞24h后加入脱色的GBEE继续培养48h检测。结果显示，脱色的GBEE终浓度在320μg/ml ，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制HepG-2细胞生长，且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强，抑制率（%）分别为70，63，54，46，35及29，IC50为52.8μg/ml。取脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE干粉150g，加入赋型剂50g，拌匀，按每粒200mg装入空心胶囊，制成胶囊剂。
实施例2
取被乙醇浸泡过的干银杏外种皮 200 千克按料液比为1:10置于煮提锅中加水常规煎煮0.5 小时，过滤后继续加水重复上述煎煮方法 2次并过滤，将 3 次的滤液合并，于 70℃ 减压浓缩至比重为 1.30 ，将98％的乙醇缓慢加入浓缩液中，使乙醇终浓度在87%（V/V） ，边加边快速搅动，静置 6 小时后将沉淀物离心甩干，再用高浓度乙醇洗涤数次后真空干燥或冷冻干燥，此即GBEE粗粉；称取此GBEE粗粉150g，配制成5mg/mL的水溶液，按1:10（W/W）加入LX-20大孔吸附树脂，将溶液与树脂的混合物封口后置50℃水浴摇床，130r/min转速反应8h；反应结束后，过滤去除树脂，将滤液减压浓缩至比重为1.15，向浓缩液中缓慢加入乙醇，使乙醇终浓度为70%（V/V），边加边快速搅动，静置沉淀8h；将沉淀物用高浓度乙醇洗涤数次后真空干燥或冷冻干燥，得到脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE。采用紫外-可见分光光度计于450nm处测定其水溶液（10mg/mL）的0D值，结果显示，GBEE粗粉水溶液的OD值为0.546，脱色的GBEE水溶液的OD值为0.152，颜色明显变浅。采用苯酚硫酸法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量，结果分别为59%及23%，肽多糖总含量为82%。采用MTT法体外检测对HepG-2细胞增殖的影响，接种细胞24h后加入脱色的GBEE继续培养48h检测。结果显示，脱色的GBEE终浓度在320μg/ml ，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制HepG-2细胞生长，且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强，抑制率（%）分别为72，64，54，43，36及30，IC50为52.1μg/ml。取脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE干粉300g，加入赋型剂100g，拌匀，按每片 100mg制成片剂。
实施例3
取被乙醇浸泡过的的干银杏外种皮 100 千克按料液比为1:12置于煮提锅中加水常规煎煮1小时，过滤后继续加水重复上述煎煮方法 2 次并过滤，将 3 次的滤液合并，于 70℃ 减压浓缩至比重为 1.25，将95 ％的乙醇缓慢加入浓缩液中，使乙醇终浓度在88%（V/V），边加边快速搅动，静置 6 小时后将沉淀物离心甩干，再用高浓度乙醇洗涤数次后真空干燥或冷冻干燥，此即GBEE粗粉；称取此GBEE粗粉200g，配制成20mg/mL的水溶液，按1:15（W/W）加入LX-60大孔吸附树脂，将溶液与树脂的混合物封口后置60℃水浴摇床，160r/min转速反应5h；反应结束后，过滤去除树脂，将滤液减压浓缩至比重为1.20，向浓缩液中缓慢加入乙醇，使乙醇终浓度为80%（V/V），边加边快速搅动，静置沉淀10h；将沉淀物用高浓度乙醇洗涤数次后真空干燥或冷冻干燥，得到脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE。采用紫外-可见分光光度计于450nm处测定其水溶液（10mg/mL）的0D值，结果显示，GBEE粗粉水溶液的OD值为0.551，脱色的GBEE水溶液的OD值为0.159，颜色明显变浅。采用苯酚硫酸法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量，结果分别为57%及24%，肽多糖总含量为81%。采用MTT法体外检测对HepG-2细胞增殖的影响，接种细胞24h后加入脱色的GBEE继续培养48h检测。结果显示，脱色的GBEE终浓度在320μg/ml ，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制HepG-2细胞生长，且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强，抑制率（%）分别为69，61，52，44，34及27，IC50为53.1μg/ml。取脱色的具有抗肿瘤活性的GBEE干粉100g溶解于纯净水中，按药物质量要求加入适量矫味剂和防腐剂，摇匀，按10ml规格装瓶，制成口服液制剂。