本发明属于中药领域，涉及灵芝孢子粉糖肽提取物及其制备方法与用途。
背景技术：
白细胞减少症(简称白减)是由多种病因引起的一组综合症。白细胞减少症以周围白细胞总数持续低于4.0×109/L为主要诊断依据，是目前临床内科常见的一种疾病，根据其发病原因可分为原因不明性和继发性两种。继发于肿瘤化疗、放疗后的白细胞减少症有别于继发于其它感染性疾病(如：伤寒、副伤寒、黄热病等)，这一严重毒副作用的发生常使肿瘤的放、化疗被迫停止。近年来国内许多医疗单位充分发挥中医药的特长与优势，将中医药与化、放疗综合应用，在防治恶性肿瘤化、放疗中的毒副反应方面取得了一定的疗效和进展。尤其是近年来在防治白细胞减少症方面的研究十分活跃。
近年来，恶性肿瘤的发病率逐年增高，成为威胁人类身体健康的常见病。目前恶性肿瘤主要采取手术、化疗、放疗、生物治疗等综合治疗。化疗在其中占优举足轻重的位置，但其毒副作用强烈，用于肿瘤细胞与正常细胞间缺少根本性的代谢差异，所有的化疗药物都不能完全避免对正常细胞如骨髓造血细胞、消化道黏膜上皮细胞等的损害。因为化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，极易导致病人状况的恶化甚至死亡。化疗的毒副作用主要表现是对骨髓造血功能的抑制，骨髓是人体免疫中枢之一，骨髓受抑制，造成白细胞减少，抗病能力随之下降，严重时红细胞、血小板也同时下降。纠正化疗后白细胞减少以往常用西药生白药碳酸锂、利血生、肌苷、维生素B4等治疗，药物种类虽多，但疗效不太满意，而利血生、维生素B等促核酸代谢物升白作用同时也有促进肿瘤生长作用。输注白细胞治疗，一方面价格较高，患者难以承受；另一方面在患者体内因排异活动存活时间短，而且有促进癌肿复发转移的可能。目前已广泛应用集落细胞刺激因子(G-CSF)以预防和治疗化疗药物所引起的白细胞减少症，疗效较好；还可以采用病人自体骨髓移植，但这些疗法有较高的医疗与经济条件的要求，临床上难以广泛应用。
近年来的研究表明，中医药升高白细胞具有独特的优势，弥补了西医疗法的不足。中药能扶正固本，减毒增效；疗效稳定、持久；提高机体免疫功能，调动机体抗癌能力；加强机体对化疗药物的敏感性，有利于化疗的顺利完成；减轻经济负担，尽可能虽短住院天数；延长生存期，提高生存质量。
灵芝孢子是灵芝发育后期释放出来的担孢子，其所含的化学成份与灵芝子实体相比，蛋白质、氨基酸含量高于灵芝，多糖肽、腺嘌呤核苷、有机锗、酸性B葡聚糖等成份不仅含量高于灵芝子实体，且在种类和结构上均存在差异。现代医学研究证明，灵芝孢子粉具有抗肿瘤、抗炎、保护肝脏、降低胆固醇、降血糖、抗辐射、增强免疫力功能和抗病毒作用。临床观察显示灵芝孢子粉能减轻恶性肿瘤放化疗的毒副反应，改善临床症状，改善患者生活质量，帮助肿瘤患者顺利完成放化疗，延长生存期提高了临床疗效。
技术实现要素：
本发明的首要目的是提供灵芝孢子粉糖肽提取物的制备方法，以操作简便、绿色安全、成本低、提取效果好、不破坏提取物结构、溶剂可以回收重复利用、易实现工业化生产。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其依次包括浓醇提取、稀醇提取、合并浓醇提取液与稀醇提取液的乙醚脱脂、除杂脱色、树脂纯化步骤，
其中浓醇提取步骤是将灵芝孢子粉用85-95％乙醇(乙醇浓度为体积百分比浓度，以下相同)70-100℃下加热回流提取2-5次，合并提取液；
稀醇提取步骤是将浓醇提取完毕的灵芝孢子粉药渣用55-65％乙醇80-100℃下加热回流提取1-5次，合并提取液，95％乙醇沉淀后取上清。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中浓醇提取步骤中每次提取时85-95％乙醇的量(L)为灵芝孢子粉量(kg)的2-10倍。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中浓醇提取步骤中每次提取时间为0.5-3小时。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中浓醇提取步骤中进一步将合并提取液减压浓缩至无醇味。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中稀醇提取步骤中每次提取时55-65％乙醇的量(L)为灵芝孢子粉药渣量(kg)的3-10倍。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中稀醇提取步骤中每次提取时间为0.5-3小时。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中稀醇提取步骤中进一步将合并提取液减压浓缩至体积(L)为孢子粉质量(kg)的0.05-2倍后再进行95％乙醇沉淀。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中稀醇提取步骤中95％乙醇沉淀时95％乙醇的量(L)为灵芝孢子粉药渣量(kg)的2-12倍。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中稀醇提取步骤中95％乙醇沉淀时加入95％乙醇后静置4-48小时，抽滤，滤渣弃去取上清。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中稀醇提取步骤中进一步将上清浓缩至无醇味。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中合并浓醇提取液与稀醇提取液的乙醚脱脂步骤是合并浓醇提取液和稀醇提取液，加水配制成药液，向药液中加入乙醚进行萃取，共萃取5～12次，合并水层除乙醚后加水得药液。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中合并浓醇提取液与稀醇提取液的乙醚脱脂步骤中加水配制成药液时药液体积(L)为孢子粉质量(kg)的0.05-2倍。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中合并浓醇提取液与稀醇提取液的乙醚脱脂步骤中每次萃取时乙醚加入量
(L)为药液体积(L)的0.1-2倍。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中合并浓醇提取液与稀醇提取液的乙醚脱脂步骤中合并水层除乙醚后加水所得药液的体积(L)为孢子粉质量(kg)的0.05-2倍。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中除杂脱色步骤是在乙醚脱脂后的药液中先后加入SM-A天然硅胶溶液、SM-B葡聚糖溶液进行脱脂，离心后取上清。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中除杂脱色步骤中的操作温度为30-90℃。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中除杂脱色步骤中SM-A天然硅胶溶液的浓度为0.5-5％(m/v)，其加入后保温放置半小时。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中SM-A天然硅胶溶液的具体配制方法为：
配制量：灵芝孢子粉(投料量):硅胶SM-A:纯化水＝1kg:1g:50mL，
将SM-A用80-90℃纯化水配制成2％(g/ml)的溶液，放置烧杯中，边加入边搅拌，直至所有SM-A固体粉末分散到水溶液中形成均匀无颗粒状的白色胶体混悬溶液。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中除杂脱色步骤中SM-B天然硅胶溶液的浓度为0.5-4％(m/v)。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中SM-B葡聚糖溶液的配制具体方法为：
配制量：灵芝孢子粉(投料量):SM-B:纯化水:冰醋酸＝1kg:0.0167g:1.67mL:0.0167mL，
用烧杯将SM-B溶解在50-60℃的1％(ml/ml)冰醋酸溶液中，配制成含SM-B为1％(g/ml)的浓度，边加入边搅拌。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中除杂脱色步骤中进一步将上清浓缩至药液体积(L)为孢子粉质量(kg)的0.05-2倍。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中树脂纯化步骤是将上清上HP-20大孔树脂后先后以水、10-20％乙醇、95％乙醇冲洗，收集10-20％乙醇冲洗所得洗脱液，减压浓缩除乙醇。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中树脂纯化步骤中水、10-20％乙醇、95％乙醇冲洗的体积各为1-7BV(BV为树脂体积量)，冲洗流速均为0.5-4BV/小时。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中树脂纯化步骤中进一步将减压浓缩除乙醇的洗脱液进行干燥处理，得孢子粉糖肽(1)。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其是将经浓醇提取、稀醇提取后残留的灵芝孢子粉药渣进一步进行包括水提取、醇沉淀和精制步骤的处理，其中水提取步骤是将浓醇和稀醇提取过的灵芝孢子粉药渣加水后80-100℃加热回流提取1-5次，合并提取液。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中水提取步骤中每次水的加入量(L)为灵芝孢子粉药渣量(kg)的3-12倍。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中水提取步骤中每次水提取的时间为0.5-3小时。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中水提取步骤中进一步将合并提取液浓缩至体积(L)为孢子粉质量(kg)的0.05-3倍。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中醇沉淀步骤是在合并水提取液中加入1-8倍量的乙醇沉淀，干燥沉淀。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中醇沉淀步骤的沉淀时间为8-60小时
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中精制步骤是将醇沉淀物加水后制成糖肽溶液，加氯仿-正丁醇溶液沉淀6-15次，每次取上清而弃沉淀，干燥最后得上清，即为孢子粉糖肽(2)。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中精制步骤中加入氯仿-正丁醇溶液中氯仿与正丁醇的体积比为4:1。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中精制步骤中每次加入氯仿-正丁醇溶液的体积为糖肽溶液体积的0.1-0.6倍。
在一种优选的实施方案中，本发明提供灵芝孢子粉糖肽的制备方法，其中精制步骤中每次沉淀时间为10-30分钟。
本发明的第二个目的是提供灵芝孢子粉糖肽提取物，其是根据前述方法制备，在用于升高白细胞时有更好的效果。
本发明的第三个目的是提供根据本发明的方法制备获得的灵芝孢子粉糖肽提取物在制备升高白细胞药物中的用途。
利用如上基础的实施方案和优选的实施方案制备灵芝孢子粉糖肽，具有如下优点：
1、本发明采用浓醇稀醇提取、乙醚脱脂、水提、醇沉等操作获得孢子粉糖肽(1)和(2)，整个方法具有设备简单易操作、生产成本低、提取效果好、可工业化生产、溶剂可回收重复利用等优势。
2、本发明采用硅胶和葡聚糖溶液进行除杂脱色，与活性炭脱色相比较，具有不会破坏糖肽结构、容易过滤，脱色完全、得率高的优点，而且方法简单易行、绿色安全、便于实验室和工业化生产。孢子粉多糖溶液经活性炭脱色，糖肽得率0.13％(糖肽得率为所得糖肽与投料生药的重量比值，以下相同)，经硅胶和葡聚糖溶液除杂脱色，糖肽得率0.22％。
3、本发明采用HP-20大孔树脂吸附药液，先用水洗脱去除单糖、极性杂质和大部分色素，再用15％乙醇洗脱获得孢子粉糖肽(1)，得率为0.22％，多糖含量19.18％，酸水解氨基酸含量18.87mg/100mg。
4、醇提后孢子粉用水提醇沉工艺处理，经过精制能得到纯度高的孢子粉糖肽(2)，其得率能达到1.55％，多糖含量达到71.49％，酸水解氨基酸含量4.52mg/100mg。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
实施例1：灵芝孢子粉糖肽的提取方法一
将过80目筛的灵芝孢子粉1kg置圆底烧瓶中，加入5倍量95％乙醇，加热80℃，回流提取第一遍，提取时间为2小时，抽滤，得提取液1，药渣加入4倍量95％乙醇，加热80℃，回流提取第二、三遍，提取时间为1小时，抽滤，得提取液2、3，合并提取液1、2、3，减压浓缩至无醇味，得浓醇提取浓缩液。
继续向灵芝孢子粉药渣中加入4倍量60％乙醇，加热90℃，回流提取3次，每次1小时。抽滤，得提取液4、5、6，合并提取液4、5、6，减压浓缩得300ml药液，加入7倍量(2.1L)95％乙醇进行醇沉，搅拌均匀，静置24小时。抽滤，滤渣弃去，滤过的醇沉液减压浓缩至无醇味，得稀醇提取浓缩液。
合并浓醇提取浓缩液和稀醇提取浓缩液，减压浓缩至400ml药液，向药液中加入250ml乙醚，进行萃取，共萃取8次，脱脂后的药液(水层)加热蒸至无乙醚味，加入纯化水配制成400ml的药液。
水浴加热药液，药液温度控制在50-60℃。先将2％SM-A天然硅胶溶液50ml加入到上述药液中，搅拌均匀，保温放置半小时；再将1％SM-B葡聚糖溶液1.67ml缓慢加入药液中，边加边搅拌，放置至室温，待药液沉淀完全，离心机离心，转速控制在3000转左右，每次20分钟，沉淀物舍弃，取上清液，减压浓缩至100ml。
取除杂脱色的药液，用HP-20大孔树脂吸附至饱和，先用5BV的水以2BV/小时的流速冲洗，得A部分洗脱液；再用5BV的15％的乙醇以2BV/小时的流速冲洗，得B部分洗脱液；接着再用5BV的95％乙醇以3BV/小时的流速冲洗，得C部分洗脱液；三份洗脱液分别在-0.09MPa、70℃条件下，减压浓缩回收乙醇，B部分(15％乙醇洗脱部分)干燥得2.2g灵芝孢子粉糖肽(1)，得率为0.22％，多糖含量19.18％，酸水解氨基酸含量18.87mg/100mg。
将浓醇和稀醇提取过的灵芝孢子粉药渣风干，向风干后的药渣中加入8倍量的纯化水，加热100℃，回流提取3次，每次2小时。抽滤，合并水提取液；静置、过滤、减压浓缩0.5L。向水提取浓缩液中加入5倍量的乙醇沉淀糖肽，搅拌均匀，静置24小时。抽滤，滤出糖肽后干燥得粗孢子粉糖肽，加纯化水配制成500ml溶液，加入125ml的氯仿-正丁醇(4:1)振摇20分钟，离心除去沉淀，上层溶液同法操作12次得精制的灵芝孢子粉糖肽溶液，干燥得15.5g灵芝孢子粉糖肽(2)，得率1.55％，多糖含量为71.49％，酸水解氨基酸含量4.52mg/100mg。
实施例2：灵芝孢子粉糖肽的提取方法二
将过80目筛的灵芝孢子粉1kg置圆底烧瓶中，加入6倍量95％乙醇，加热80℃，回流提取第一遍，提取时间为2小时，抽滤，得提取液1，药渣加入5倍量95％乙醇，加热80℃，回流提取第二、三遍，提取时间为1.5小时，抽滤，得提取液2、3，合并提取液1、2、3，减压浓缩至无醇味，得浓醇提取浓缩液。
继续向灵芝孢子粉药渣中加入5倍量60％乙醇，加热90℃，回流提取3次，每次1.5小时。抽滤，得提取液4、5、6，合并提取液4、5、6，减压浓缩得300ml药液，加入8倍量(2.4L)95％乙醇进行醇沉，搅拌均匀，静置24小时。抽滤，滤渣弃去，滤过的醇沉液减压浓缩至无醇味，得稀醇提取浓缩液。
合并浓醇提取浓缩液和稀醇提取浓缩液，减压浓缩至400ml药液，向药液中加入250ml乙醚，进行萃取，共萃取8次，脱脂后的药液(水层)加热蒸至无乙醚味，加入纯化水配制成400ml的药液。
水浴加热药液，药液温度控制在50-60℃。先将2％SM-A天然硅胶溶液50ml加入到上述药液中，搅拌均匀，保温放置半小时；再将1％SM-B葡聚糖溶液1.67ml缓慢加入药液中，边加边搅拌，放置至室温，待药液沉淀完全，离心机离心，转速控制在3000转左右，每次20分钟，沉淀物舍弃，取上清液，减压浓缩至100ml。
取除杂脱色的药液，用HP-20大孔树脂吸附至饱和，先用4BV的水以2BV/小时的流速冲洗，得A部分洗脱液；再用5BV的15％的乙醇以2BV/小时的流速冲洗，得B部分洗脱液；接着再用4BV的95％乙醇以3BV/小时的流速冲洗，得C部分洗脱液；三份洗脱液分别在-0.09MPa、70℃条件下，减压浓缩回收乙醇，B部分(15％乙醇洗脱部分)干燥得1.92g灵芝孢子粉糖肽(1)，得率0.192％，多糖含量为19.04％，酸水解氨基酸含量17.85mg/100mg。
将浓醇和稀醇提取过的灵芝孢子粉药渣风干，向风干后的药渣中加入6倍量的纯化水，加热100℃，回流提取3次，每次1.5小时。抽滤，合并水提取液；静置、过滤、减压浓缩0.5L。向水提取浓缩液中加入5倍量的乙醇沉淀糖肽，搅拌均匀，静置24小时。抽滤，滤出糖肽后干燥得粗孢子粉糖肽，加纯化水配制成0.5L溶液，加入150ml的氯仿-正丁醇(4:1)振摇20分钟，离心除去沉淀，上层溶液同法操作10次得精制的灵芝孢子粉糖肽溶液，干燥得13.8g灵芝孢子粉糖肽(2)，得率1.38％，多糖含量为70.82％，酸水解氨基酸含量4.35mg/100mg。
实施例3：灵芝孢子粉糖肽提取物的分子量检测
将制备的灵芝孢子粉糖肽，采用高效凝胶色谱法测定分子量：
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪
色谱柱：
预柱：TOSOH TSK-GUARDCOLUMN PWXL 6.0*40mm
TOSOH TSK-GEL G5000PWXL 7.8*300mm
TOSOH TSK-GEL G3000PWXL 7.8*300mm
预柱、G5000PWXL、G3000PWXL串联
流动相：0.2mol/L的氯化钠水溶液
流速：0.6ml/min
柱温：40℃
检测器：Agilent示差折光检测器40℃
色谱工作站：Agilent色谱工作站(带GPC软件)
Dextran标准分子量多糖：分子量范围180-2000000，购自中国药品生物制品检定所
取制备的灵芝孢子粉糖肽粉末1和2加水溶解，制成3mg/ml的溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，取20μl注入色谱柱，记录色谱图，GPC软件计算两者重均分子量为1000-2000。
实施例4：灵芝孢子粉糖肽提取物的动物药效实验
本试验例用于说明灵芝孢子粉糖肽(由上述实施例1得到)对环磷酰胺所致小白鼠白细胞减少症模型白细胞总数的影响。
动物：昆明种小鼠，SPF级，雄性，20-22g。
实验第一天开始分组给药。环磷酰胺注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml。环磷酰胺单用及联合用药均于实验第一天注射环磷酰胺1次。灵芝孢子粉糖肽(1)和(2)注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml，GM-CSF注射液给药体积为每10g小鼠皮下注射给药0.2ml，每日1次，连续给药8天。
实验动物共分7组，阴性对照组、环磷酰胺100mg/kg单用给药组、环磷酰胺100mg/kg与GM-CSF 100μg/kg剂量组，环磷酰胺100mg/kg与灵芝孢子粉糖肽(1)-200mg/kg联合用药组，环磷酰胺100mg/kg与灵芝孢子粉糖肽(1)-400mg/kg联合用药组，环磷酰胺100mg/kg与灵芝孢子粉糖肽(2)-200mg/kg联合用药组，环磷酰胺100mg/kg与灵芝孢子粉糖肽(2)-400mg/kg联合用药组。每组12只动物。于给予环磷酰胺前眼眶静脉丛取血1次，于给予环磷酰胺后第3、5、7、9天眼眶静脉丛取血，使用全自动血细胞分析仪进行血细胞计数及分类。血细胞数量用均值±标准差(x(_)±SD)表示，并进行各给药组与阴性对照组之间，联合用药组与环磷酰胺单用组之间的t检验。
实验结果表明：小鼠腹腔注射环磷酰胺可使外周血白细胞数量明显降低，与阴性对照组比较有显著性差异。灵芝孢子粉糖肽两个剂量组白细胞总数明显回升。具体结果见表1。
上述实施例只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。