一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制作方法

技术特征：

1.一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1：原代细胞培养：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增；

S2：神经干细胞纯化及扩大培养：将扩增融合到80％-90％的原代神经干细胞进行消化、传代，直至传到第5代,并鉴定细胞纯度达95％以上后，作为种子细胞；

S3：神经干细胞工作细胞库的建立：将步骤S2中的种子细胞，计数并无血清培养基悬浮培养，待培养瓶细胞融合到80％—90％，将细胞消化传代，如此反复直至细胞传代P6-P9代；

S4：神经干细胞注射液的制备：将步骤S3中的P6-P9代细胞加生理盐水定容或负载于微载体，制成临床用神经干细胞注射液。

2.如权利要求1所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，步骤S1和S3中无血清培养基是由DMEM/F12，B27，N2，以及神经营养因子BFGF,EGF,LIF组成，无任何动物源血清成分。

3.如权利要求1所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，步骤S1的原代神经干细胞的来源为哺乳动物、灵长类动物或啮齿类动物的神经干细胞中的一种或几种；所述原代神经干细胞为手术分离废弃胎脑组织的皮层组织，然后消化酶将组织消化离心获得原代神经干细胞悬液。

4.如权利要求1所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，步骤S1的原代神经干细胞的来源方法包括IPSC诱导、提取胚胎干细胞、提取人类视网膜色素上皮细胞或提取神经组织器官以外的其他器官或组织干细胞。

5.如权利要求1所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，步骤S1的原代神经干细胞的来源为医疗废弃的人源胎脑皮层组织的神经干细胞。

6.如权利要求1所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，步骤S3的悬浮培养的方法包括以下步骤：

(a)将神经干细胞接种在包含bFGF和EGF的DMEM/F12或DMEM培养基中培养；

(b)2、3或4天后在培养基中添加5-20％体积的营养补充液并继续培养，其中所述营养补充液是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mMol/L的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mMol/L的丙酮酸钠，0.5-1.5mMol/L的NAC，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的LIF的DMEM/F12或DMEM培养基；

(c)监测培养基中形成的神经球直径，当60％以上、优选70％以上神经球直径高于阈值时，分离直径高于所述阈值的神经球，消化后收获，其中所述阈值为200-500μm，例如为250μm、300μm、350μm、400μm或450μm；

(d)未挑中的直径小于所述阈值的剩余细胞保留在原培养基中，将培养基移除1/2-1/4体积，然后添加与移除体积相同体积的(a)中所述的包含bFGF和EGF的培养基继续培养；

(e)在(a)接种神经干细胞10、11、12、13、14或15天后通过合并(c)中收获的细胞和(d)继续培养所得的细胞而收获细胞。

7.如权利要求1所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述微载体包括脂质体、微胶囊或微球载体。

8.由权利要求1-7中任一项所述的制备方法制成的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液。

9.如权利要求8所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液，其特征在于所述神经干细胞注射液中包含大于1×10⁶个神经干细胞。

10.权利要求8中所述的治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液的使用方法，其特征在于，将所述治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液植入患者体内；所述植入方法包括定点注射，静脉回输、鞘内注射、鼻腔粘膜吸附或肌肉注射。