一种透明抗菌水凝胶敷料、其制备方法和应用与流程

本发明属于生物材料、高分子材料等领域，具体地，涉及一种应用于促进伤口愈合，防止伤口感染的透明抗菌水凝胶敷料、其制备方法和应用。

背景技术：

高保湿性和抗菌性的功能医用敷料作为一种临时皮肤替代物在治疗过程中发挥着重要作用。当皮肤组织受到创伤时，如烧伤，擦伤，溃烂等，表层细胞抵抗能力下降，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等革兰氏菌容易在伤口上繁殖，引起创伤范围的进一步扩大。伤口一旦被细菌感染，就不容易愈合。目前临床使用最多的是无菌纱布，成本低，有一定的隔菌效果，但是当伤口化脓或有体液流出时，易与纱布粘合在一起，更换纱布时，容易破化新生皮肤，不利于伤口愈合，同时病人得再一次遭受痛苦。

早已证明湿润环境下更有利于伤口的愈合，细菌纤维素具有吸湿能力强、促进愈合、减轻疼痛和减少更换次数等优点，尤其是根据培养条件的不同，可获得不同性状的膜材料，以应对不同渗出液量及染菌程度的创伤病例，是一种极具潜力的“理想”创伤敷料材料。同时水凝胶敷料成为当前研究的热门，水凝胶含水量高，可保持伤口的湿润环境，溶胀性能好，当伤口体液渗出时，能吸收渗出液，给伤口一个清洁干净的环境。透明水凝胶敷料还能随时观察伤口的愈合情况，如若伤口恶化，可及时采取措施。目前最常用的制备水凝胶的方法是化学法，在凝胶单体中加入少量交联剂。化学法合成的水凝胶性能受凝胶单体，交联剂，引发剂量以及反应条件的影响。

在目前已有的关于细菌纤维素敷料专利文献中，中国专利CN 103205863公开了一种细菌纤维素缓释敷料的方法，采用静电纺丝的方法将细菌纤维素与聚合物药物缓释纳米纤维复合。静电纺丝时所使用的油相有机溶剂是有毒的，且缓释敷料需频繁更换，降低的负载药物的利用率。

专利CN 203138849提供了一种细菌纤维素湿性敷料，敷料中并没有抑菌或杀菌的成分，存在感染性。

关于水凝胶敷料的专利文献中，中国专利CN 102675651公开了一种壳聚糖水凝胶制备抗菌敷料的方法。制备含有抗菌剂的改性壳聚糖水凝胶，该水凝胶敷料具有抗菌性，克服了伤口感染的问题，但是材料力学性能差，抗水性差，在应用上有一定的局限性。

专利CN 101502607公布一种医用壳聚糖透明水凝胶创伤敷料的制备方法。在敷料制备过程中添加了防腐剂，能抗浅部真菌感染。但添加剂在pH偏酸性时效果最佳，人体pH＝7.35-7.45，抗菌效果有所抑制。

美国有关透明水凝胶专利申请如下：

美国专利US 2009/0326496 A1公开透明高聚物水凝胶创伤敷料，目的是吸收伤口渗出液同时能随时观察伤口愈合状况。水凝胶层主要是经过化学改性后的纤维素，如羧甲基纤维素凝胶、羟乙基纤维素凝胶、羟丙基甲基纤维素、改性丙烯酰胺等。

美国专利United States Patent No.4909244.设计一种透明敷料，敷料主要包括凝胶层和隔菌层，透明凝胶层是乙烯醋酸乙烯脂，材料是不含水分，100％固体可熔性聚合物，柔软性和弹性好。阻菌层是弹性和粘结性好的聚氨酯，作为隔菌层，阻挡细菌侵入创伤处。该敷料的含水率不高，不能为伤口提供一个促进修复的湿润环境。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种透明抗菌水凝胶敷料及其制备方法，其目的在于通过采用原位复合法，将细菌纤维素晶须和水凝胶单体I化合物进行复合，并将其浸泡在硝酸银和NaBH₄溶液中，制备得到表面附着有纳米银颗粒的透明抗菌水凝胶敷料，由此解决现有技术的水凝胶敷料含水量低、抗菌效果差的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种透明抗菌水凝胶敷料，所述水凝胶敷料包括细菌纤维素晶须和透明凝胶，其中所述细菌纤维素晶须分散在所述透明凝胶中。

优选地，所述透明凝胶具有式(I)所示的结构通式，

其中，R₁为氢、甲基或乙基，R₂为羟基、胺基、甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、异辛酯、羟乙酯、环氧丙酯、二甲氨乙酯、十六酯或十八酯。

优选地，所述细菌纤维素晶须的含水量是95％～99.6％，所述细菌纤维素晶须的长度为100～300nm，直径为5～50nm。

优选地，所述水凝胶敷料为多孔结构，所述多孔结构的孔径大小为2μm～5.5μm。

优选地，所述水凝胶敷料的含水量为50％～70％。

优选地，所述水凝胶敷料还包括其表面的抗菌剂纳米银颗粒，所述纳米银颗粒的尺寸为40～70nm。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的水凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将产细菌纤维素的细菌接种在液体培养基中，在25℃～30℃静态培养至少一周得到纤维素膜，将得到的纤维素膜用蒸馏水浸泡2～4天，再将其放入浓度为0.1mol/L NaOH溶液中煮沸30分钟，然后用去离子水漂洗至中性得到细菌纤维素薄膜；

(2)将步骤(1)得到的细菌纤维素薄膜捣碎，离心取上层，得到离心后的纤维素，将离心后的纤维素加入到体积浓度为40％～60％硫酸中，在40℃～60℃条件下，进行水解反应8小时到12小时，水解完成之后进行离心、透析、再离心得到细菌纤维素晶须；

(4)将透明凝胶单体与步骤(2)得到的细菌纤维素晶须按照体积比1～9:1进行混合，优选体积比为2.25～9:1，加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯和催化剂N,N,N',N'-四甲基乙二胺，聚合固化形成凝胶后，加入15％～30％的过硫酸铵水溶液，混合均匀，静置2～4小时形成透明水凝胶，并将其在不同浓度的乙醇溶液中进行洗涤，得到洗涤后的透明凝胶；所述洗涤的具体步骤优选为：分别在50％、40％、30％、20％、10％和5％的乙醇溶液中进行降梯度洗涤，每次洗涤四小时；

(4)将步骤(3)获得的透明水凝胶浸泡在AgNO₃溶液中1小时，然后用酒精冲洗，再将其在NaBH₄溶液浸泡10分钟，超纯水清洗后得到附着纳米银颗粒的透明抗菌水凝胶。

优选地，步骤(1)所述的产细菌纤维素的细菌为葡糖木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、农杆菌、根瘤菌和/或八叠球菌中的一种或多种。

优选地，步骤(1)所述的液体培养基为细菌产膜培养基，其成分包括20g/L的葡萄糖、5g/L的酵母粉、5g/L的酵母粉、1.5g/L的柠檬酸和6.8g/L的Na₂HPO₄。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的抗菌水凝胶敷料的应用，所述抗菌水凝胶敷料应用于医用敷料。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。

(1)采用原位复合法，将细菌纤维素晶须与透明的凝胶单体的聚合物复合，在引发剂过硫酸铵的作用下，制备出复合的透明抗菌凝胶材料，将其作为医用敷料，含水量高；

(2)本发明制备得到的水凝胶敷料具有较好的力学强度和柔韧性，其拉伸强度可以达到0.35MPa-0.55MPa；

(3)本发明制备的水凝胶敷料透明，可随时观察伤口愈合和恶化情况，亦可延长敷料的使用时间，附着纳米银颗粒后，敷料的抗菌性能得到提高；

(4)本发明的水凝胶敷料为多孔结构，可以为细胞在材料表面生长提供足够的空间，有利于细胞的粘附；

(5)本发明耗时短，试验操作简单，可根据需要制备多种不同形状的透明创伤敷料。

附图说明

图1本发明的抗菌透明水凝胶敷料切开后的结构示意图；

图2为实施例1和实施例2中聚甲基丙烯酸羟乙酯与细菌纤维素晶须在不同体积比下复合水凝胶的透明性表征；

图3为实施例1和实施例2中聚甲基丙烯酸羟乙酯与细菌纤维素晶须复合水凝胶含水量图；

图4为实施例1和实施例2中聚甲基丙烯酸羟乙酯与细菌纤维素晶须复合水凝胶抗菌效果图；

图5为小鼠成纤维细胞在实施例1制备得到的水凝胶敷料材料上的增殖情况；

图6为实施例1制备得到的水凝胶敷料表面SEM表征；

图7为实施例1中制备的水凝胶敷料附着纳米银颗粒材料的SEM图；

图8为实施例1中步骤(2)制备得到的细菌纤维素晶须的SEM照片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的如图1所示的透明抗菌水凝胶敷料，包括细菌纤维素晶须和透明凝胶，其中所述细菌纤维素晶须均匀分散在所述透明凝胶中。

所述透明凝胶为具有式(I)所示的结构通式，

其中，R₁为氢、甲基或乙基，R₂为羟基、胺基、甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、异辛酯、羟乙酯、环氧丙酯、二甲氨乙酯、十六酯或十八酯。

透明凝胶为及其制备方法为现有技术，所有凝胶单体经聚合后成为透明的凝胶对于制备本发明的透明水凝胶敷料都是可行的，其聚合度n为现有的透明的凝胶单体聚合物任意可行的n的范围，优选n为100～10000。

所述细菌纤维素晶须的含水量是95％～99.6％，所述细菌纤维素晶须的长度为100～300nm，直径为5-50nm。

所述水凝胶敷料为多孔结构，所述多孔结构的孔径大小为2μm～5μm。多孔结构可以为细胞在材料表面生长提供足够的空间，有利于细胞的粘附。

所述水凝胶敷料的含水量为50％～70％。

所述水凝胶敷料还包括其表面的抗菌剂纳米银颗粒，所述纳米银颗粒的尺寸为40～70nm。

所述的水凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将产细菌纤维素的细菌接种在液体培养基中，在25℃～30℃静态培养至少一周得到纤维素膜，将得到的纤维素膜用蒸馏水浸泡2～4天，再将其放入浓度为0.1mol/L NaOH溶液中煮沸30分钟，目的是除去残存的菌体和培养基，然后用去离子水漂洗至中性得到细菌纤维素薄膜；

(2)将步骤(1)得到的细菌纤维素薄膜捣碎，离心取上层，得到离心后的纤维素，将离心后的纤维素加入到体积浓度为40％～60％硫酸中，在40℃～60℃条件下，进行水解反应8小时到12小时，水解完成之后进行离心、透析、再离心得到细菌纤维素晶须；

(3)将透明凝胶单体与步骤(2)得到的细菌纤维素晶须按照体积比1～9:1混合均匀，加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯和催化剂N,N,N',N'-四甲基乙二胺，聚合固化形成凝胶后加入15％～30％的过硫酸铵水溶液，混合均匀，静置2～4小时形成透明水凝胶，并将其在不同浓度的乙醇溶液中进行梯度洗涤，得到洗涤后的透明凝胶；

(5)将步骤(3)获得的透明水凝胶浸泡在AgNO₃溶液中1小时，然后用酒精冲洗，再将其在NaBH₄溶液浸泡10分钟，超纯水清洗后得到附着纳米银颗粒的透明抗菌水凝胶。

步骤(1)所述的产细菌纤维素的细菌为葡糖木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、农杆菌、根瘤菌和/或八叠球菌中的一种或多种。

步骤(1)所述的液体培养基为细菌产膜HS培养基，其成分为：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸1.5g/L，Na₂HPO₄ 6.8g/L。

步骤(2)中硫酸的添加量为每100克离心后的纤维素中加入150～400毫升体积分数为40％～60％硫酸，优选为200毫升。

步骤(2)第一次离心是为了除去浓硫酸，透析是进一步纯化，除去残留的离子溶液，最后一步离心是取上清液，也就是在水溶液中分散均匀的细菌纤维素晶须。

步骤(3)所述透明凝胶单体与步骤(2)得到的细菌纤维素晶须混合体积比优选为2.25～9:1。

步骤(3)所述交联剂质量为所述凝胶单体质量的0.5％～3％，优选为1％，所述催化剂为所述凝胶单体质量的0.5％～1.5％，优选为1.4％。

步骤(3)聚合固化形成凝胶的具体操作优选为在4℃下静置24h使聚合固化形成凝胶。

所述凝胶单体与细菌纤维素晶须的混合液与过硫酸铵混合，过硫酸铵的量为混合液量的0.2wt％～1wt％，其中0.5wt％最优。

步骤(3)将凝胶单体和步骤(2)制备得到的细菌纤维素晶须按照一定体积比混合均匀，加入交联剂和催化剂促进凝胶单体聚合，再加入过硫酸铵引发凝胶单体和细菌纤维素晶须的凝胶化，这样使得细菌纤维素晶须和凝胶单体聚合物共同形成了透明水凝胶，且细菌纤维素晶须均匀分散在透明凝胶单体聚合物中。

步骤(3)中所述在不同浓度的乙醇溶液中进行梯度洗涤，其目的是除去过硫酸铵(APS)。乙醇溶液中进行梯度洗涤的具体步骤为：分别在50％、40％、30％、20％、10％和5％的乙醇溶液中进行降梯度洗涤，每次洗涤四小时。

本发明的困难在于如何将细菌纤维素水解为纳米结构的纤维素晶须，并保留细菌纤维素的高含水量，增加其光透过性，同时纳米结构的纤维素晶须必需能与凝胶单体均匀混合。

具体的困难在于对温度、硫酸浓度、硫酸的加入量以及反应时间的控制。不同的反应时间和温度得到的细菌纤维素晶须尺寸大小不同。硫酸浓度过高会导致纤维素碳化，硫酸浓度过低不能酸解纤维素。

本发明制备得到的抗菌水凝胶敷料可应用于医用敷料。

以下为实施例：

实施例1

(1)实验所用细菌为葡糖醋杆菌，将葡糖醋杆菌接种在HS培养基中，在30℃生化培养箱中静态培养一周，得到厚度约为10毫米的细菌纤维素膜。用0.1mol/L NaOH溶液煮沸半小时除去培养基中的细菌残留，再用去离子水浸泡一周至pH中性，即可得到纯化后的纤维素膜。

(2)将细菌纤维膜捣碎成浆，离心(10000转/分钟，10分钟)除去匀浆里的水分，取上层，得到离心后的纤维素；配置200ml 50％浓硫酸，称量离心后的纤维素，按照每100g纤维素中加入200ml 50％浓硫酸，水浴60℃8小时左右。水解完成后先进行离心处理(10000转/分钟，10分钟)，取上层，透析，再离心去上层清液，得到细菌纤维素晶须。

(3)将甲基丙烯酸羟乙酯与细菌纤维素晶须混合均匀，其中甲基丙烯酸羟乙酯与细菌纤维素晶须体积比为7:3，加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯质量为甲基丙烯酸羟乙酯的0.1％，再加入催化剂N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)为甲基丙烯酸羟乙酯质量的1.4％，混合均匀并在4℃条件下静置 24小时后加入20％过硫酸铵。甲基丙烯酸羟乙酯与细菌纤维素晶须混合液与过硫酸铵的体积比为13:1。均匀后混合转移至24孔板中，10℃下静置形成透明凝胶。将凝胶置于不同浓度的乙醇溶液中梯度洗涤，即分别在浓度为50％，40％，30％，20％，10％，5％的乙醇溶液中降梯度洗涤，每次洗涤四小时，具体步骤为：首先将水凝胶在50％乙醇溶液浸泡4小时，之后将饱和吸收50％乙醇溶液的水凝胶置于浓度为40％的乙醇溶液4小时，目的在于稀释水凝胶中的乙醇，重复以上操作至乙醇浓度降至10％，再将水凝胶浸没在5％乙醇溶液中4小时，最后将水凝胶放在去离子水中浸泡4小时，更换去离子水5次确保乙醇全部除干净。

(4)将上述处理后的透明凝胶浸泡在浓度为0.001mol/L AgNO₃中一小时然后用酒精冲洗30秒，再将其浸泡在浓度为0.1mol/L NaBH₄中10分钟。得到附着纳米银颗粒的抗菌性透明凝胶敷料。

实施例2

以所述相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤(3)中，甲基丙烯酸羟乙酯与细菌纤维素晶须体积比为1:1。

实施例3

以所述相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤(3)中，制备丙烯酸与细菌纤维素晶须混合液：丙烯酸单体与细菌纤维素晶须体积比为7:3，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯质量为丙烯酸的0.1％，催化剂N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)为丙烯酸质量的1.4％，混合均匀并在4℃条件下静置24小时后加入20％过硫酸铵。混合液与过硫酸铵的体积比为13:1。

实施例4

以所述相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤(2)中配置60％浓硫酸酸解细菌纤维素，水浴40℃12小时。

实施例5

以所述相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤(1)中，实验所用菌为产醋杆菌。

实施例6

以所述相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤(4)中，AgNO₃浓度为0.001mol/L，NaBH₄浓度为0.01mol/L。

实施例7

对实施例1中材料进行抗菌效果检测，实验所用菌为大肠杆菌，实验方法如下：制备浓度约为10⁴cfu/ml的大肠杆菌悬浮液，取2ml菌液，将材料浸泡在菌液中，材料大小为圆柱状2cm²×0.5cm。在37℃下培养1天和2天后，用10ml PBS冲洗材料表面菌液。菌液混匀后做适当稀释，做3个稀释度。去0.1ml稀释度菌液均匀涂抹在固体琼脂平板上，置于37℃培养箱中培养24h。观察平板中菌落数。

实施例8

对实施例1中材料进行生物学评价，细胞实验所用细胞为小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)，制备细胞悬浮液，并接种于置有实施例1材料的24孔板中；对照组为无实施例1材料下接种细胞于96孔板中。每孔接种10000个细胞。置于37℃，5％CO₂条件下的培养箱进行培养，每24h换一次新鲜培养基，并进行一次CCK-8细胞增殖检测。测450nm波长下的OD值，OD值越高，说明细胞数量越多。

实验结果分析：

图1为抗菌透明水凝胶敷料剖开以后的结构示意图。敷料内部与细菌纤维素晶须混合均匀，吸附在复合水凝胶表面的纳米银颗粒易于释放，起到抗菌效果。

图2为实施例1，2中聚甲基丙烯酸羟乙酯与细菌纤维素晶须在不同体积比下复合水凝胶的透明性表征。在可见光波长下，复合水凝胶的透明度可以达85％以上。

图3为实施例1中聚甲基丙烯酸羟乙酯与细菌纤维素晶须复合水凝胶含水量图。复合水凝胶的含水量在60％-70％之间。

图4为实施例1中聚甲基丙烯酸羟乙酯与细菌纤维素晶须复合水凝胶抗菌效果图。实验所用菌为大肠杆菌，抗菌效果在第一天时可达到70％，随着纳米银颗粒释放，抗菌效果也逐步增强，第二天抗菌率可达80％。

图5为小鼠成纤维细胞在实施例1制备得到的水凝胶敷料材料上的增殖情况。OD值越高，说明细胞数量越多。细胞第一天和第二天在实施例1材料增殖状况良好，可以看出实施例1制备得到的水凝胶敷料与小鼠成纤维细胞之间有着良好的生物相容性。

图6为实施例1中制备的水凝胶敷料材料表面表征SEM图，所述水凝胶敷料为多孔结构，所述多孔结构的孔径大小为2μm～5.5μm。

图7为实施例1中制备的水凝胶敷料附着纳米银颗粒材料的SEM图。纳米银颗粒的尺寸为40～70nm。

图8为实施例1中步骤(2)制备得到的细菌纤维素晶须的SEM照片。细菌纤维素晶须的长度为100～300nm，直径为5-50nm。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。