相关申请的交叉引用本申请要求于2015年4月20日提交的发明名称为“类血小板蛋白微粒及利用类血小板蛋白微粒传递药物的方法”的美国临时申请号为62/149,849的申请日的权益，通过引用的方式将其内容作为一个整体并入本文。发明背景诸如癌症及缺血性心脏病等慢性疾病仍旧为许多国家主要死亡原因之一(baueretal.,(2014),thelancet384:45-52)。该些疾病的防治不仅占了各国年度卫生保护预算的大部分，而且成为受影响家庭经济及感情上的沉重负担。即使相关领域持续发展出用以治疗不同慢性疾病的新颖疗法及确认新潜力药物的靶点，但该些潜力疗法的治疗应用性仍受限。许多疗法至今面对的主要挑战之一即为靶点专一性：如何将治疗作用仅局限于靶点位置(rajetal.,(2014),drugdelivery2014:1-20)。过去数十年间，在确认及研发用以治疗缺血性心脏病(ischemicheartdisease,ihd)的新颖药物上已有持续性的进展。然而在许多国家，ihd仍为主要死亡原因之一(goetal.,(2014),circulation129:e28-e292)。目前已经确定的多数的治疗效用并非仅局限于靶点位置(vanderheideetal.,(2013),circulationres113:464-477)。因此，如何成功地将一已经确定的治疗药剂传递至目标位置，仍为相关领域待克服的主要挑战之一。在缺血性心脏病发展过程中发生的一个关键事件是将循环的单核细胞招募到梗死区域(liuetal.,(2011),arteriosclerthrombvascbiol31:834-841；sarmaetal.,(2002),circulation105:2166-2171；furmanetal.,(2001),jamcollcardiol38:1002-1006)。一旦这些循环单核细胞穿透内皮细胞层，即会转变为巨噬细胞，进而通过发炎活性造成梗塞心脏更严重的损伤。即使已研发可靶向该些巨噬细胞的治疗方法，研究已经表明，该些治疗方法不仅会影响梗塞心脏区域的巨噬细胞，也会影响位于身体其它位置的巨噬细胞(leyetal.,(2011),arteriosclerthrombvascbiol31:1506-1516)。发明概述本揭示内容是基于包含脂质体及血小板膜蛋白的蛋白脂质体的设计。该蛋白脂质体会与单核细胞等循环血细胞结合，而不会结合至内皮细胞。如此一来，该蛋白脂质体可用以传递包覆于其中的治疗药剂，其通过结合至能移动到受伤位置(例如心脏梗塞区域)的单核细胞来达到传递药剂的目的。一旦单核细胞转变为巨噬细胞，巨噬细胞会经由胞饮作用(endocytosis)吸收该蛋白脂质体，从而将治疗药剂传递至单核细胞聚集的位置(例如梗塞区域)。或者是，在蛋白脂质体进行胞饮作用前，即会将治疗药剂释放于单核细胞或巨噬细胞聚集的疾病位置。因此，本揭示内容提供了一种蛋白微粒，例如包含一微粒(例如一脂质体)及一种或多种血小板膜蛋白的蛋白脂质体，其中该蛋白脂质体可结合至能移动(不论被动或主动)到受伤位置的单核细胞(monocyte)、中性粒细胞(neutrophil)或其它循环性细胞。在某些实施方式中，该蛋白微粒包覆一治疗药剂，例如一心脏保护药剂，举例来说，一抗炎药剂(anti-inflammatoryagent)、一抗凋亡药剂(anti-apoptoticagent)、一抗纤维化药剂(anti-fibroticagent)、一免疫调节药剂(immuno-modulatoryagent)或一促血管新生药剂(proangiogenicagent)。在某些实施方式中，该脂质体包含一磷脂及胆固醇。在上述任一种蛋白微粒(例如蛋白脂质体)中，该一种或多种血小板膜蛋白可包含一由血小板膜分离的蛋白混合物。在某些实施方式中，血小板是静息(resting)血小板或部分活化的血小板。如本文所用，部分活化的血小板是指会表达早期活化标记物(例如cd62p)且不会表达完全活化标记物(例如cd40l及cd18)的血小板。在某些实施方式中，本揭示内容所述的蛋白粒子(例如蛋白脂质体)几乎不包含血小板膜的脂质成分。或者或此外，任一种本揭示内容所述的蛋白微粒(例如蛋白脂质体)不会结合至内皮细胞。在另一方面，本揭示内容提供了一种用以将一治疗药剂传递至一个体的方法，该方法包含对该个体施用任一种本揭示内容所述的蛋白微粒(例如任一种蛋白脂质体)，其中该蛋白微粒包覆所述的治疗药剂。在另一方面中，本揭示内容提供了一种用以治疗一缺血性心脏病的方法，该方法包含对一有需要的个体施用一有效量的任一种本揭示内容所述的蛋白微粒(例如蛋白脂质体)，其中该蛋白微粒包覆一用以治疗缺血性心脏病(ischemicheartdisease,ihd)的治疗药剂。在某些实施方式中，该抗ihd的药剂是一抗炎药剂。本揭示内容的范畴还包含(a)一用以将一治疗药剂传递至一靶点位置(例如一受伤位置)或用以治疗ihd的药物组合物，该药物组合物包含任一种本揭示内容所述的蛋白微粒(例如蛋白脂质体)，其中该蛋白微粒包覆一诸如抗ihd药剂(例如抗炎药剂)的治疗药剂及一药学上可接受的载体；以及(b)本揭示内容所述的蛋白脂质体的用途，其用以制备一可将治疗药剂传递到靶点位置的药物，或用以制备一可治疗ihd的药物。此外，本揭示内容提供了一种用以传递药物的试剂盒，其包含任一种本揭示内容所述的蛋白微粒及一种本揭示内容所述的那些治疗药剂。该治疗药剂是包覆于该蛋白微粒中。在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方式的细节。本发明的其他特征或优点将从以下附图、若干实施方式的详细描述以及所附权利要求中显而易见的获得。附图说明图第1a-1g是关于纯化人类pmp及制备plp。图1a为制备plp的示意图，其包含利用薄膜水合作用方法(thin-filmhydrationmethod)将纯化的人类血小板膜蛋白(plateletmembraneprotein,pmp)与基于dopc的脂质体接合。图第1b为整体策略的示意图。在心肌梗塞的进展中，血小板会附着于聚集的单核细胞表面(详见1)。因此，血小板-单核细胞聚集物会外渗(详见2)。因此，类血小板蛋白脂质体(platelet-likeproteoliposome,plp)会以类似于血小板的作用模式与单核细胞进行反应(详见3)。一旦穿过内皮细胞，源自单核细胞的巨噬细胞即会吞噬(phagocytosis)plp(详见4)。图1c是经数次超速离心步骤后，由新鲜分离的人类血小板所纯化的pmp。图1d为sds-page照片，用来检测证明膜蛋白的纯度。黑框指出在最终纯化的膜蛋白溶液中不会观测到β-肌动蛋白(β-actin，黑框位置)。白框指出由最终膜蛋白溶液得到的蛋白带(band)。图1e为利用蛋白免疫印迹分析所检测的某些血小板膜蛋白照片。图1f包含纯脂质体(plainliposome，即没有与pmp结合)及plp的冷冻电子显微(cryo-em)照片；比例尺为100微米。图1g为显示在各指定样本中是否存在gpiib及cd42c的照片。以超速离心将每毫升10毫克的plp浓缩至每毫升1毫克，再利用抗-gpiib及抗-cd42c抗体进行蛋白免疫印迹分析来确认与pmp与plp的接结合。图2a-2b是类血小板蛋白脂质体与不同类型细胞作用的照片。图2a为相较于脂质体，类血小板蛋白脂质体与不同类型细胞相互作用的荧光照片。图2b为与不同类型细胞结合的类血小板蛋白脂质体的流式细胞分析结果。图3a-3e是关于plp的靶向专一性。将小鼠内皮细胞(svec)、单核细胞(raw264.7)及小鼠腹腔巨噬细胞(mφ)暴露于以dii标记的脂质体或以dii标记的plp，于37℃作用4小时，之后进行流式细胞分析(图3a)。plp暴露于mφ会形成空泡(vacuole，白色箭头)；比例尺为2微米(图3b)。可利用tem观察到mφ中的plp(白色箭头)；比例尺为0.2微米(图3c)。由荧光照片可观察到以dii标记的脂质体(图3d)或是以dii标记的plp(图3e)与三种细胞类型的作用；比例尺为10微米。图4a-4d是关于以激光照射造成损伤的小鼠耳朵皮肤中，具有dii标记的plp的位置。造成小鼠耳朵烧伤后，由静脉注射100微升的每毫升5毫克的具有dii标记的纯脂质体或plp(白色箭头)。以植物凝集素(isolectin)抗体预染血管。将多光子显微镜镜头聚焦于受伤位置以捕捉纯脂质体(图4a)及plp(图4b)外渗的30分钟的延时图(time-lapseimage)。拍摄30分钟后，于经纯脂质体治疗(图4c)及经plp治疗(图4d)的小鼠的伤口周边随机选取5个位置拍照；比例尺为50微米。图5a-5f是关于心肌i/r损伤的小鼠模式中，plp的组织分布。对10周大的小鼠进行45分钟的缺血处理后，随即进行24小时(图5a)或72小时(图5b)的再灌流(reperfusion)。由静脉注射脂质体或plp，待其循环4小时后牺牲小鼠。灌流及均质化处理收集到的器官，并进行hplc分析。n＝6，*,p<0.05。**,p<0.01。图5c为对冷冻切片样本分析于i/r受损心脏中，以dii标记的脂质体或plp的位置(细胞核：蓝色；肌钙蛋白i(troponini)：绿色)。图5d为cd11b+(图5e)及cd11b+dii+(图5f)非肌细胞(non-myocyte)的流式细胞分析及统计分析结果，其中该非肌细胞是暴露在由经24或72小时再灌流时注射的纯脂质体或plp的4小时后，从i/r损伤的小鼠心脏分离得到的。n＝5，***,p<0.001。图6a-6d是关于在心肌i/r损伤的小鼠模式中plp-copp的治疗分析结果。图6a为研究流程图：对小鼠进行45分钟的缺血处理和72小时的再灌流，之后静脉注射生理食盐水、copp(mg/kg)、lipo-copp(mg/kg)或plp-copp(mg/kg)。接下来每5天注射一次，直到第28天牺牲小鼠为止。之后，将小鼠心脏进行组织切片，并以马森三色染色(masson’strichrome)染色组织(图6b)。nt：未处理，copp：无包覆copp(freecopp)，lipo+copp：以脂质体包覆的copp，plp+copp：以plp包覆的copp。比例尺在完整组织切片的视野下为1毫米，在高倍率视野下则为100微米。图6c为各治疗组(n＝4)的心脏梗塞区域的统计分析结果，*,p<0.05；n.s代表无显著差异。图6d为经72小时再灌流注射不同的治疗后，检测i/r受损心脏中ho-1基因及促发炎基因的表达结果。图7a-7d为经plp-copp治疗后，利用心脏超音波检测mi受损小鼠模型的心脏功能及血液化学分析结果。图7a为治疗流程图：在对lad动脉进行永久性结扎后，让小鼠休息72小时，之后由静脉注射约100微升的生理盐水、仅有lipo、仅有plp、copp(5mg/kg)、lipo-copp(5mg/kg)或plp-copp(5mg/kg)。每5天进行一次治疗，直到第28天时，以心脏超音波分析小鼠的心脏功能(n＝8)(图7b)；lvef：左心室射出分率(leftventricularejectionfraction)；fs：缩短分析(fractionshortening)；lvedv：左心室舒张末期容积(leftventricularend-diastolicvolume)；lvesv：左心室收缩末期容积(leftventricularend-systolicvolume)；ivsd：舒张期心室间隔厚度(interventricularseptalthicknessatdiastole)；ivss：收缩期心室间隔厚度(interventricularseptalthicknessatsystole)。通过分析小鼠血液中生物标记物的表达来评估其肝脏功能(图7c)、肾脏功能(图7d)及心脏功能(图7e)；ast：天冬氨酸转氨酶(aspartateaminotransferase)；alt：丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase)；tbil：总胆红素(totalbilirubin)；bun：血尿素氮(bloodureanitrogen)；cre：肌酐(creatinine)；ckmb：肌酸激酶mb(creatinekinasemb)。*,p<0.05，***,p<0.001。图8是关于plps会透过生物模拟(biomimicking)血小板与循环单核细胞的作用来增加copp的靶向专一性。plps与循环单核细胞的结合可提供一种与epr功效无关的替代性传递心脏保护药物(例如copp)路径。一旦聚集的循环单核细胞浸润至受伤组织区域，源自单核细胞的巨噬细胞会吞噬附着的plps。经吞噬后，被包覆的copp会释放到细胞质中，并引发ho-1的表达，进而降低促发炎细胞激素(pro-inflammatorycytokines)的表达。此外，plp不仅会减少copp对其它器官的副作用，该传递载体也可能减少copp与驻留于心脏的巨噬细胞(residentcardiacmacrophage)接触的机会。图9是关于以激光造成损伤30分钟后，于损伤区域检测dii+信号的统计分析结果。检测及统计分析在小鼠耳朵的以激光造成的损伤位置中，具有dii标记且纯脂质体或plp的总荧光信号(n＝3)。***,p<0.001。图10a-10c为体外分析由copp诱发的ho-1表达量。图10a是关于copp、ho-1及胆红素关系的示意图。将细胞暴露于脂质体或plp中，于37℃反应4小时；以pbs冲洗过量的残余物。将细胞放回37℃培养箱至隔日，接着进行蛋白免疫印记(图10b)。图10c为于各治疗样本中，经诱发的ho-1将血红素(heme)催化为胆红素的专一活性(n＝6)。nt：未经处理；copp：未包覆的copp；lipo+copp：以脂质体包覆的copp；plp+copp：以plp包覆的copp。*,p<0.05，***,p<0.001。图11是关于心脏组织切片的苏木精及伊红染色(hematoxylinandeosinstaining)结果。以苏木精及伊红染色分析i/r受损小鼠模型中(n＝4)心脏梗塞的区域。比例尺在完整组织切片的视野下为1毫米，在高倍率视野下则为100微米。对小鼠进行45分钟的缺血处理和72小时的再灌流，之后由静脉注射生理盐水、copp(5mg/kg)、lipo-copp(5mg/kg)或plp-copp(5mg/kg)。接下来每5天注射一次，直到第28天牺牲小鼠为止。发明详述急性或慢性疾病的致病关键在于，巨噬细胞是否会聚集至疾病位置处(pawelecetal.,currentopinioninimmunology.2014；29:23-28)。该些巨噬细胞一开始会以单核细胞形式出现在血管中(gordonetal.,naturereviewsimmunology.2005；5:953-964)。循环的单核细胞会移动至最接近疾病位置的血管，接着穿透内皮细胞连结(一种称为血管穿透(extravasation)的过程，hume,currentopinioninimmunology.2006；18:49-53)，到达疾病位置。本揭示内容提供了一种类血小板蛋白微粒(例如蛋白脂质体(proteoliposome,plp))，其可与单核细胞结合，透过单核细胞的移动将诸如诊断或治疗药剂等药剂传递至特定位置，例如疾病发生位置。蛋白微粒是一种包含一种或多种蛋白的微粒(例如纳米粒子)，较佳的情况是，该一种或多种蛋白是表现于微粒的表面。本揭示内容所述的plp是一种脂质体相关的传递系统，其表面具有纯化的血小板膜蛋白。该些plp可作为具有优势性的药物传递载体，其能利用循环血细胞(例如单核细胞)作为传递体(shuttle)，用来将包覆于plp中的治疗药剂传递至目标靶点，例如心肌梗塞区域。一旦携带plp的循环单核细胞穿过内皮细胞层，即会活化成为巨噬细胞。接着，该些自我活化的巨噬细胞会吞噬表面结合的plp，释放包覆的药物(例如抗炎药剂)或使包覆药物于巨噬细胞内作用，进而产生治疗功效。在某些情况下，药物可改变吞噬plp的巨噬细胞的基因表达谱，减少细胞激素/趋化激素(chemokine)的表达量和/或增加有利因子的分泌，进而促进组织修复/再生。在不受限于任何理论的情况下，本揭示内容所述的plp具有下列优点。第一，其提供了一种将治疗药剂传递到目标靶点(例如心脏梗塞区域)的新颖方法，据以治疗ihd等靶向疾病。第二，在某些优选的实施方式中，本揭示内容所述的plp仅包含源自静息或部分(些微)活化的血小板的膜蛋白。该种plp不会结合至内皮细胞，因此不会形成血栓(thrombosis)。类血小板蛋白微粒本揭示内容所述的蛋白微粒可以是任一种包含一种或多种血小板膜蛋白的微粒，其中该一种或多种血小板膜蛋白可以表现在微粒的表面。在某些实施方式中，本揭示内容所述的蛋白微粒是类血小板蛋白脂质体(platelet-likeproteoliposome,plp)，其是指具有一种或多种血小板膜蛋白插入(通常是人为方式)至脂质体膜上的类脂质体载体。plp可包含一种插入一种或多种血小板膜蛋白的脂质体。至少一部分的血小板膜蛋白可暴露于plp的表面，如此一来，该蛋白可与结合对象(举例来说，单核细胞等循环血细胞细胞表面的受体)作用。在某些实施方式中，脂质体中脂质及血小板膜蛋白的比例为1,000,000：1到30：1(w/w)。在某些实施例中，比例为1,000：1、30：1到50：1(w/w)，例如30：1到40：1或40：1到50：1。本揭示内容所述的plp能结合至单核细胞、中性粒细胞和/或其它可移动至受伤位置的循环血细胞。在某些实施方式中，相较于其它类型的细胞(例如内皮细胞)，plp可具专一性地结合至单核细胞。plp可“具专一性地结合”(specificallybinds)至单核细胞等靶细胞为本领域技术人员所能了解的词汇，而用以测定专一性结合的方法亦为本领域技术人员所熟知的方法。若相较于替代靶细胞(例如内皮细胞)，plp可更常、更快、结合时间更久和/或亲和性更高地结合至靶细胞，则称plp与单核细胞等靶细胞具有「专一结合」(specificbinding)活性。plp可“专一结合”(specificbind)至单核细胞是指相较于其它类型的细胞(例如内皮细胞)，该plp可更高亲和性、结合性(avidity)、更快和/或结合时间更久地结合至单核细胞。由该定义可知，举例来说，可专一结合至一第一靶细胞的plp可以或不可以专一或优选结合至一第二靶细胞。在此情况下，“专一结合”(specificbinding)或“优选结合”(preferentialbinding)不必然为(虽然可以包含)排他性结合(exclusivebinding)。一般来说，非必要性地，结合意指优选结合。在某些特定实施例中，本揭示内容所述的plp不会结合至内皮细胞，因此不会形成血栓；即plp不会或相当低程度地结合至内皮细胞，在此情况下，即使有任何结合，皆不足以引发显著的血栓形成(例如可利用一般医疗方法确认的具有临床意义的血栓形成)。在某些实施方式中，本揭示内容所述的plp几乎不包含血小板膜(整体或其部分)的脂质成分。“几乎不包含”(substantiallyfree)一词是指plp包含不超过最小量的血小板膜，例如约少于10％、约少于5％或约少于2.5％的血小板膜。在某些实施例中，plp不包含血小板膜的脂质成分(即，不含有血小板膜的脂质成分)。(i)脂质体及其它微粒在本揭示内容中，术语“脂质体”(liposome)一词是指一组合物，其包含一围绕于内部液态空间的外脂层膜(例如称为单层脂质体(unilamellarliposome)的单一脂质双层或称为多层脂质体(multilamellarliposome)的多脂质双层)(例如可参照cullisetal.,biochim.biophysacta,559:399-420(1987))。单层脂质体的直径通常约为20到400纳米(nanometer,nm)、约为50到300纳米、约为300到400纳米或约为100到200纳米。多层脂质体的直径通常约为1到10微米，且可包含2到数百层的可与液态层交错的同心脂双层。各脂质双层可包含二单层，其包含反向排列的双性脂质分子(oppositelyorientedamphipathiclipidmolecules)。双性脂质通常包含一可共价连结至一种或多种非极性(疏水性)酰基或烷基链的极性(亲水性)头部(headgroup)。疏水性酰基链及周围液体介质之间的能量不利接触会引发双性脂质分子自行排列，最终使极性头部朝向双层表面，而酰基链则朝向双层的内部，用来有效地遮蔽酰基链，避免与液体环境接触。可利用一种或多种天然和/或合成的脂质化合物来制备本揭示内容所述的脂质体。脂质体可以包含负价脂质、正价脂质或其组合。适合的负价脂质实例包含，但不限于，二荳蒄-(dimyrystoyl-)、二软脂酰-(dipalmitoyl-)及二硬脂酰磷脂酰甘油(distearoylphasphatidylglycerol)，二荳蒄-、二软脂酰-及二硬脂酰磷脂酸(dipalmitoylphosphatidicacid)，二荳蒄-、二软脂酰-及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dipalmitoylphosphatidylethanolamine)，其不饱和二酰基及经混合的酰基链部分，以及心磷脂(cardiolipin)。例示性的正价脂质包含，但不限于，n，n'-二甲基-n，n'-双十八烷基溴化铵(n,n'-dimethyl-n,n'-dioctacylammoniumbromide,ddab)、n，n'-二甲基-n，n'-双十八烷基氯化铵(n,n'-dimethyl-n,n'-dioctacylammoniumchloride,ddac)、n-(1-(2,3-二脱氧)丙基)-n，n，n-三甲基氯化铵(n-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl)-n,n,n-trimethylammoniumchloride,dotma)、3.beta.-[n-(n'，n'-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基)胆固醇(3.beta.-[n--(n',n'-dimethylaminoethyl)carbamoyl]cholesterol,dc-chol)、1,2-二油酰基-3-[三甲基铵]-丙烷(1,2-dioleoyloxy-3-[trimethylammonio]-propane,dotap)、1,2-十八烷氧基-3-[三甲基铵]-丙烷(1,2-dioctadecyloxy-3-[trimethylammonio]-propane,dstap)、1,2-二油酰丙基-3-二甲基-羟乙基氯化铵(1,2-dioleoyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammoniumchloride,dori)及如martinetal.,currentpharmaceuticaldesign2005,11,375-394所述的阳离子脂质。在某些实施方式中，可利用一种或多种磷脂及任选的一种或多种具有相似分子形状及大小的其它分子来制备本揭示内容所述的脂质体，其中该一种或多种其它分子同时具有一疏水性结构及一亲水性结构(例如胆固醇)。适合用来制备本揭示内容所述的脂质体的磷脂包含，但不限于，卵磷脂(phosphatidylcholine,lecithin)、溶血卵磷脂(lysolecithin)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanol-amine)、磷脂酰丝胺酸(phosphatidylserine)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)、鞘磷脂(sphingomyelin)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,cephalin)、心磷脂(cardiolipin)、磷脂酸(phosphatidicacid)、脑脂醣苷(cerebrosides)、双十六烷基磷酸(dicetylphosphate)及二软脂酰-磷脂酰甘油(dipalmitoyl-phosphatidylglycerol)。其它非含磷的脂质包含，但不限于，硬脂胺(stearylamine)、十二胺(dodecylamine)、十六胺(hexadecyl-amine)、乙酰基棕榈酸酯(acetylpalmitate)、蓖麻油酸甘油酯(glycerolricinoleate)、十六硬脂酸(hexadecylsterate)、肉荳蔻酸异丙酯(isopropylmyristate)、双性丙烯酸聚合物(amphotericacrylicpolymer)、脂肪酸(fattyacid)、脂肪酰胺(fattyacidamide)、胆固醇(cholesterol)、胆固醇酯(cholesterolester)、二酰基甘油(diacylglycerol)及琥珀酸甘油二酯(diacylglycerolsuccinate)等。在某些实施方式中，本揭示内容所述的脂质体的主要脂质成分可以是卵磷脂，其可具有不同链长及不同饱和程度的各种酰基链基团。在某些实施例中，卵磷脂包含具有c14到c22碳链长度的饱和性脂肪酸。相较于不饱和性长链卵磷脂，饱和性长链卵磷脂于活体中的渗透性(permeable)较低，而稳定性较高。也可使用具有单或双不饱和性脂肪酸的卵磷脂及饱和性与不饱和性脂肪酸的混合物。任一种本揭示内容所述的脂质体可进一步包含一固醇(sterol)，较佳的是胆固醇，且胆固醇：磷脂的摩尔比约为0.1到1.0。在某些实施例中，脂质体可包含以下混合物：二硬脂酰卵磷脂/胆固醇、二软脂酰卵磷脂/胆固醇、二荳蒄卵磷脂/胆固醇、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,dopc)/胆固醇，或卵鞘磷脂(eggsphingomyelin)/胆固醇。必要时，可利用一聚合层来涂布(coat)本揭示内容所述的脂质体，用来增加脂质体于活体内的稳定性(例如立体稳定脂质体)。适合的聚合物实例包含，但不限于，聚乙二醇(poly(ethyleneglycol),peg)，其可形成一亲水性表层以改善脂质体的循环半衰期，并增加到达治疗靶点的脂质体数量(例如可参照workingetal.jpharmacolexpther,289:1128-1133(1999)；gabizonetal.,jcontrolledrelease53:275-279(1998)；adlakhahutcheonetal.,natbiotechnol17:775-779(1999)；及koningetal.,biochimbiophysacta1420:153-167(1999))。适合用来制备本揭示内容所述的脂质体的peg-脂质实例包含，但不限于，1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-350](1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethyleneglycol)-350],mpeg350pe)、1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-550](1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethyleneglycol)-550],mpeg550pe)、1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-750](1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethyleneglycol)-750],mpeg750pe)、1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-1000](1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethyleneglycol)-1000],mpeg1000pe)、1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000],mpeg2000pe)、1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethyleneglycol)-3000],mpeg3000pe)、1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethyleneglycol)-5000],mpeg5000pe)、n-酰基-神经胺醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)750](n-acyl-sphingosine-1-[succinyl(methoxypolyethyleneglycol)750],mpeg750ceramide)、n-酰基-神经胺醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)2000](n-acyl-sphingosine-1-[succinyl(methoxypolyethyleneglycol)2000],mpeg2000ceramide)及n-酰基-神经胺醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)5000](n-acyl-sphingosine-1-[succinyl(methoxypolyethyleneglycol)5000],mpeg5000ceramide)。可利用不同方法来制备本揭示内容所述的脂质体。该些方法为本所属领域所熟知的方法或本揭示内容所述的方法；举例来说，以下方法：lichtenbergandbarenholzinmethodsofbiochemicalanalysis,volume33,337-462(1988)，也可参照szokaetal.,ann.rev.biophys.bioeng.9:467(1980)；u.s.pat.nos.4,235,871,4,501,728,and4,837,028；liposomes,marcj.ostro,ed.,marceldekker,inc.,newyork,1983,chapter1；andhope,etal.,chem.phys.lip.40:89(1986)，各相关内容通过引用的方式并入本文。可如先前技术(tsengetal.,1999)所述，结合薄膜水合标准法及重复挤压法来制备小型单层载体(smallunilamellarvesicle，suv，大小<100纳米)。可利用常规技术来制备特定大小的脂质体(例如可参照u.s.pat.no.4,737,323及hopeetal.,biochim.biophys.acta,812:55-65(1985))，个相关内容通过引用的方式并入本文。以水浴或探针超声法超声处理脂质体悬浮液可将其体积逐渐减少至小于50纳米的小型单层载体。也可利用均质化或微流等方法，利用剪切能量(shearingenergy)将大型脂质体剪切为小型脂质体。在常规的均质化程流中，是以标准乳化均质机再循环多层载体，直到制成特定大小的脂质体，据观察，通常是介于约100到500纳米之间的脂质体。在该些方法中，可利用常规激光束粒径鉴别法(laser-beamparticlesizediscrimination)来监测粒径分布。利用小孔径聚碳酸酯膜(polycarbonatemembrane)或不对称的陶瓷膜(ceramicmembrane)来挤压脂质体可有效将脂质体大小减少至相对明确的大小分布。一般来说，可使悬浮液通过膜一次或多次，直到产生特定大小分布的脂质体。可依次利用较小孔径的膜来挤压脂质体，以逐渐减少脂质体的大小。可利用常规方法来分析的任一种本揭示内容所述脂质体，用来确认其物理和/或化学特性。举例来说，可利用磷酸试验(phosphateassay)来确定脂质体的浓度。磷酸试验是基于钼酸盐(molybdate)与孔雀绿染剂(malachitegreendye)之间的作用来进行分析。主要作用原理是无机磷酸盐会与钼酸盐反应形成一无色未还原的磷钼酸复合体，该磷钼酸复合体于酸性环境进行还原反应后，会转换为一蓝色复合体。当与孔雀绿形成复合体时，磷钼酸的颜色会加深20或30倍。测量最终产物(一种经还原的绿色可溶性复合体)于620纳米波长时的吸光值，用来直接分析溶液中的无机磷酸盐。在其它实施方式中，本揭示内容所述的用以传递药物的颗粒可以是一种由一种或多种聚合物或共聚物所组成的纳米粒子。举例来说，纳米粒子可以是一种由常规技术制备的聚(乳酸-共-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolicacid),plag)纳米粒子。(ii)血小板膜蛋白如本揭示内容所述的蛋白脂质体(proteoliposome,plp)等蛋白微粒包含一种或多种血小板膜蛋白，其较佳地表现于plp的表面。在某些实施方式中，该一种或多种血小板膜蛋白只会呈现在静息血小板和/或部分活化血小板，而不会呈现在活化的血小板。血小板膜蛋白可包含p-选择蛋白(p-selectin,cd62p)、cd40l、cd18或其组合。或者是，血小板膜蛋白几乎没有cd40l、cd18或二者(例如，不包含cd40l、cd18或二者)。在某些实施方式中，血小板膜蛋白可以包含gpiib、cd42c和/或一种或多种种如表2所列的蛋白，举例来说，该些与单核细胞等循环血细胞作用的蛋白。在某些实施例中，本揭示内容所述的plp包含一种膜蛋白混合物，其利用如实施例所述方法等常规技术由静息和/或部分活化的血小板所分离。可利用常规方法或本揭示内容所述方法来制备可用以制备plp的血小板膜蛋白。举例来说，可以常规重组技术来制备各蛋白，再将其插入任一种本说明书所述的脂质体中，据以形成plp。或者是，可以常规技术由血小板(例如静息或部分活化之血小板)来纯化血小板膜蛋白。可将蛋白混合物插入一适当的脂质体中。或者是，可将蛋白混合物进一步纯化(例如色层分析(chromatography))，用来增加特定膜蛋白的含量，并增加用以制备plp的蛋白的含量。在一实施例中，由静息或些微(部分)活化的血小板来分离血小板膜蛋白。由静息或些微活化血小板分离的膜蛋白所制备的plp，具有不会结合至内皮细胞的优点，由此避免产生血栓。可利用本所属领域熟知的方法将一种或多种血小板膜蛋白插入至脂质体中，以形成如本揭示内容所述的蛋白脂质体。例如，可参照已公开的us2005/0123594中相关内容，为了所需目的，各相关内容通过引用的方式并入本文。在一实施例中，是于可形成蛋白脂质体的环境中加入适当的清洁剂，再将一脂质溶液与血小板膜蛋白进行混合，其中该脂质溶液包含用以制备如本揭示内容所述的脂质体的成份(例如脂质)。脂质与蛋白的比例可以介于30：1到50：1之间(例如30：1)。可于适当的温度(例如4℃)利用pbs等适当的缓冲液进行充分的透析(extensivedialysis)，用来移除清洁剂及游离蛋白(freeprotein)。若有必要，可重复使用生物磁珠(biobead,sm-2；bio-rad)来移除残存的清洁剂。(iii)治疗药剂任一种本揭示内容所述的蛋白脂质体可包覆一治疗药剂，举例来说，一心脏保护药剂，例如一抗炎药剂、一抗凋亡药剂、一抗纤维化药剂、一免疫调节药剂或一促血管新生药剂。抗炎药剂为能抑制炎症的化合物。例示性的抗炎药剂包含，但不限于，非类固醇类的抗炎药物(non-steroidalanti-inflammatorydrug,nasid)，例如阿司匹灵(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)及那普洛辛(naproxen)。其它的例示性抗炎药剂包含阿氯芬酸(alclofenac)、阿氯米松双丙酸酯(alclometasonedipropionate)、阿孕奈德(algestoneacetonide)、α淀粉酶(alphaamylase)、安西法尔(amcinafal)、安西非特(amcinafide)、氨芬酸钠(amfenacsodium)、盐酸氨普立糖(amiprilosehydrochloride)、阿那白滞素(anakinra)、阿尼罗酸(anirolac)、阿尼扎芬(anitrazafen)、阿扎丙宗(apazone)、巴柳氮二钠(balsalazidedisodium)、节达酸(bendazac)、苯恶洛芬(benoxaprofen)、盐酸节达明(benzydaminehydrochloride)、菠萝蛋白酶(bromelains)、溴呱莫(broperamole)、布地奈德(budesonide)、卡布洛芬(carprofen)、环洛芬(cicloprofen)、辛喷他宗(cintazone)、克利洛芬(cliprofen)、丙酸氯倍他索(clobetasolpropionate)、丁氯倍他松(clobetasonebutyrate)、氯p比酸(clopirac)、氯硫卡松丙酸盐(cloticasonepropionate)、醋酸三氟米松(cormethasoneacetate)、可托多松(cortodoxone)、癸酸盐(decanoate)、地夫可特(deflazacort)、庚酸睾酮(delatestryl)、能普-睾酮(depo-testosterone)、地奈德(desonide)、去轻米松(desoximetasone)、二丙酸地塞米松(dexamethasonedipropionate)、双氯芬酸钾(diclofenacpotassium)、双氯芬酸钠(diclofenacsodium)、双醋二氟拉松(diflorasonediacetate)、二氟米酮钠(diflumidonesodium)、二氟尼柳(diflunisal)、二氟泼尼醋(difluprednate)、双酞叹酮(diftalone)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide)、轻西奈德(drocinonide)、甲地松(endrysone)、恩莫单抗(enlimomab)、依诺利康钠(enolicamsodium)、依匹挫(epirizole)、依托度酸(etodolac)、依托芬那醋(etofenamate)、联苯乙酸(felbinac)、非那莫(fenamole)、芬布芬(fenbufen)、芬氯酸(fenclofenac)、苯克洛酸(fenclorac)、芬度柳(fendosal)、苯吡恶二酮(fenpipalone)、芬替酸(fentiazac)、夫拉扎酮(flazalone)、氟扎可特(fluazacort)、氟芬那酸(flufenamicacid)、氟咪挫(flumizole)、醋酸氟尼缩松(flunisolideacetate)、氟尼辛(flunixin)、氟尼辛葡甲胺(flunixinmeglumine)、氟考丁醋(fluocortinbutyl)、氟米龙醋酸醋(fluorometholoneacetate)、苯氟喹酮(fluquazone)、氟比洛芬(flurbiprofen)、氟瑞托芬(fluretofen)、丙酸氟替卡松(fluticasonepropionate)、咲喃洛芬(furaprofen)、咲罗布芬(furobufen)、哈西奈德(halcinonide)、丙酸齿倍他索(halobetasolpropionate)、醋酸齿泼尼松(halopredoneacetate)、异丁芬酸(ibufenac)、布洛芬(ibuprofen)、布洛芬错(ibuprofenaluminum)、皮考布洛芬(ibuprofenpiconol)、伊洛达普(ilonidap)、吲噪美辛(indomethacin)、吲噪美辛钠(indomethacinsodium)、吲噪布洛芬(indoprofen)、吲四挫(intrazole)、醋异氟龙(isoflupredoneacetate)、氧卓乙酸(isoxepac)、伊索昔康(isoxicam)、酮基布洛芬(ketoprofen)、盐酸洛非咪挫(lofemizolehydrochloride)、氯诺昔康(lomoxicam)、氯替泼诺碳酸乙醋(loteprednoletabonate)、甲氯灭酸钠(meclofenamatesodium)、甲氯芬那酸(meclofenamicacid)、甲氯松二丁醋(meclorisonedibutyrate)、甲芬那酸(mefenamicacid)、美色拉嗪(mesalamine)、美西拉宗(meseclazone)、甲二氛睾酬(mesterolone)、美雄酬(methandrostenolone)、美替诺龙(methenolone)、美替诺龙醋酸醋(methenoloneacetate)、磺庚甲泼尼龙(methylprednisolonesuleptanate)、吗尼氟醋(momiflumate)、萘丁美酮(nabumetone)、诺龙(nandrolone)、萘普生(naproxen)、萘普生钠(naproxensodium)、甲氧萘丙醇(naproxol)、尼马宗(nimazone)、奥色拉嗪钠(olsalazinesodium)、肝蛋白(orgotein)、奥帕诺辛(orpanoxin)、氧甲氢龙(oxandrolane)、奥沙普秦(oxaprozin)、羟基保泰松(oxyphenbutazone)、轻甲稀龙(oxymetholone)、盐酸瑞尼托林(paranylinehydrochloride)、戊聚糖多硫酸钠(pentosanpolysulfatesodium)、甘油保泰松钠(phenbutazonesodiumglycerate)、吡非尼酮(pirfenidone)、吡罗昔康(piroxicam)、肉桂酸吡罗昔康(piroxicamcinnamate)、吡罗昔康乙醇胺(piroxicamolamine)、比诺布洛芬(pirprofen)、泼那扎特(prednazate)、普立非酮(prifelone)、普罗度酸(prodolicacid)、普罗喹宗(proquazone)、普罗沙挫(proxazole)、枸橡酸普罗沙挫(proxazolecitrate)、利美索龙(rimexolone)、氯马扎利(romazarit)、水杨酸胆碱硫酸仪(salcolex)、沙那西定(salnacedin)、双水杨醋(salsalate)、血根氯鞍(sanguinariumchloride)、司克拉宗(seclazone)、丝美辛(sermetacin)、康力龙(stanozolol)、舒多昔康(sudoxicam)、舒林酸(sulindac)、舒洛芬(suprofen)、他美辛(talmetacin)、氟烟酞醋(talniflumate)、他洛柳醋(talosalate)、特丁非隆(tebufelone)、替尼达普(tenidap)、替尼达普钠(tenidapsodium)、替诺昔康(tenoxicam)、氧喹苯胺(tesicam)、辛叉异喹酮(tesimide)、睾酮、睾酮混合物(testosteroneblends)、四氢甲吲胺(tetrydamine)、硫平酸(tiopinac)、替可的松匹伐醋(tixocortolpivalate)、托美丁(tolmetin)、托美丁钠(tolmetinsodium)、三氯氟松(triclonide)、三氟氨醋(triflumidate)、齐多美辛(zidometacin)及苯酰吡酸钠(zomepiracsodium)。抗凋亡或心脏保护药剂是能抑制凋亡的蛋白、核酸或小分子化合物。实例包含igf、pdgf、神经调节蛋白(neuregulin)及血管生成素(angiopoietin)。本揭示内容所使用的促血管新生药剂为可刺激新血管发展的化学化合物(例如蛋白、核酸或小分子化合物)。本揭示内容所述的促血管新生药剂可以是一种生长因子(growthfactor)或细胞激素(cytokine)，其利用刺激内皮细胞生长或移动来诱发或促进血管新生；例如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)。或者是，促血管新生药剂可以是纤维母细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,fgf)家族的一员，例如fgf-1(酸性)、fgf-2(碱性)、fgf-4或fgf-5。实例包含曲弗明(trafermin)、generxtm或一种用以编码fgf-4的腺病毒基因治疗载体。其它的促血管新生药剂包含血管生成素-1(angiopoietin-1)。本揭示内容所使用的血管新生药剂包含，但不限于，vegf、fgf、血管生成素及pdgf。抗纤维化药剂是指具有抑制纤维化(包含不正常形成的通常包含胶原蛋白(collagen)的纤维结缔组织)活性的化学化合物(例如蛋白、核酸或小分子化合物)。本揭示内容所述的抗纤维化药剂可以具有不同的作用机制；例如于个体受影响的区域中，减少胶原蛋白的形成或增加胶原蛋白的代谢或移除。本揭示内容包含所有具有减少纤维组织活性的化合物，而不论各药剂的特定的作用机制。实例包含尼达布尼(nintedanib)及吡非尼酮(pirfenidone)。免疫调节药剂是能预防或改善非预期的免疫反应的蛋白、核酸或小分子化合物。实例包含沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)、阿普斯特(apremilast)及类固醇。可利用常规方法或本揭示内容所述方法，将任一种本揭示内容所述的治疗药剂插入至任一种本揭示内容所述的适当的蛋白脂质体中。在某些实施方式中，是利用产生一跨蛋白脂质体膜的ph梯度(其中蛋白脂质体的内部是酸性)及混合欲包覆的治疗药剂与蛋白脂质体，来装载(load)蛋白脂质体；例如可参照maureretal.,expertopinioninbiologicaltherapy1,923-47；nbomanetal.,cancerres.54,2830-2833；waterhouseetal.,methodsenzymol.391(2005)40-57，为了所需目的，通过引用的方式并入这里。在某些实施例中，ph梯度可以是硫酸铵梯度；例如可参照haranetal.,biochim.biophys.acta1115(1993)201-215andu.s.pat.no.5,316,771，为了所需目的，通过引用的方式并入。一旦治疗药剂已经装载至蛋白脂质体中，可直接使用该组合物或进一步处理该组合物以移除未装载的药物。ph装载技术通常包含二步骤，分别为产生具有脂质体内低ph值的ph梯度，以及随后的装载治疗药剂。可利用不同方法产生跨膜质子梯度。举例来说，可于低ph值缓冲液(例如ph4的柠檬酸缓冲液)制备蛋白脂质体后，利用ph7.5缓冲液置换外部缓冲溶液(例如maddenetal.,chem.phys.lipids,53:37-46(1990))。或者是，可利用离子载体(ionophore)及阳离子梯度(高内部阳离子浓度)(例如fenskeetal.,biochimbiophy.acta,1414:188-204(1998))。诸如尼日利亚菌素(nigericin)及a23187等离子载体会分别使外移的一价或二价阳离子与内移的质子结合，由此酸性化蛋白脂质体的内部。此外，可利用高浓度的弱碱(例如硫酸铵)来制备蛋白脂质体(haranetal.,biochim.biophys.acta,1151:201-215(1993))。依据相同的原理，移除外部的铵盐溶液会产生一ph梯度，由此进行后续的药物装载步骤。除了ph梯度，也可利用金属离子梯度来有效装载治疗药剂。举例来说，可参照cheungetal.,biochimbiophysacta,1414:205-216(1998)。中性形式的弱碱治疗药剂可通过膜，并通过形成药物-金属离子复合物停留于脂质体的液体内部。若治疗药剂是一水溶性弱碱药物，其可溶于液体溶液(例如300mm蔗糖或具有适当ph值的等渗缓冲液)后，与蛋白脂质体悬浮液混合，再于适当的温度进行孵育。药物溶液可包含少量的水混溶性有机溶剂(例如，<10％乙醇)，以增加药物的溶解性。可依据脂质组合物及药物特性来调整孵育的温度及时间。一般来说，相较于由短链饱和性脂质(例如dmpc/胆固醇)或不饱和性脂质形成的脂质体，由胆固醇及长链饱和性脂肪酸(例如dspc/胆固醇)组成的脂质体具有较差的通透性，且需要较高的温度来达到快速且有效装载的目的。举例来说，dspc/胆固醇脂质体通常需要等于或高于60℃的温度；装载通常会在5-15分钟后结束，但也有可能长达2小时。若治疗药剂为亲脂性(lipophilic)，可在能使药剂分布于脂质体双层的二单层之间条件下，将药剂与脂质混合以制备蛋白脂质体。可利用本揭示内容所述的方法，利用跨膜ph或其它离子梯度将位于外部单层的药剂装载至脂质体内部(翻转至ln双层的内部单层)。可利用如ceh等人所述方法(biochimbiophysacta.1995nov1；1239(2):145-56)，利用跨膜梯度将化合物远程装载(remoteloading)至蛋白脂质体中。该方法包含将欲装载至蛋白脂质体的治疗药剂与一和悬浮蛋白脂质体复合的硼酸孵育，由此累积蛋白脂质体内的治疗药剂含量(cehetal.,1995andu.s.pat.no.6,051,251)。药物组合物及其用途本揭示内容也提供一种药物组合物，其包含任一种如本揭示内容所述的蛋白脂质体等蛋白微粒，以及一药学上可接受的载体或赋形剂，其中该蛋白微粒可包覆一种或多种种如本揭示内容所述的治疗药剂。药物组合物中的载体必须为“可接受的”(acceptable)，从某种意义上说，该载体能与组合物中其它活性成分兼容，且较佳地，能稳定活性成分且不会对待治疗个体产生不良反应。适用于本揭示内容所述的药物组合物的载体或赋形剂可以是能增加个体吸收蛋白脂质体的物质、帮助蛋白脂质体结合至单核细胞的物质，和/或增加源自单核细胞的巨噬细胞进行胞饮作用的物质。适当的载体和/或赋形剂也可包含任何能将本揭示内容所述的经修饰的蛋白脂质体配制为制剂的物质，由此产生方便且准确的剂量。此外，可在制备过程中使用载体和/或赋形剂，辅助处理本揭示内容所述的蛋白脂质体。依据施用路径及药剂形式的不同，可使用不同的载体和/或赋形剂。例示性的赋形剂包含，但不限于抗黏着剂(antiadherent)、结合剂(binder)、涂料崩解剂(coatingsdisintegrant)、填充剂(filler)、调味剂(flavor，例如甜味剂(sweetener))、色素(color)、助流剂(glidant)、润滑剂(lubricant)、防腐剂(preservative)及吸附剂(sorbent)。本揭示内容所述的载体和/或赋形剂也可包含载体(vehicle)和/或稀释剂(diluent)，其中“载体”(vehicles)是指任何通常可作为溶剂或载体的媒介(media)；“稀释剂”(diluent)则是指一种用以稀释组合物中活性成分的稀释试剂；适当的稀释剂包含任何能减少药物制备的黏性的物质。可依据挑选的药学形式来选择载体和/或赋形剂的种类及数量；适当的药学形式为液体系统(例如溶液(solution)、注入液(infusion)及悬浮液(suspension))、半固体系统(例如胶体(colloid)、凝胶(gel)、浆糊(paste)及乳剂(cream))、固体系统(例如粉末(powder)、颗粒(granulate)、片剂(tablet)、胶囊(capsule)、丸剂(pellet)、微粒(microgranulate)、小片剂(minitablet)、微胶囊(microcapsule)、微丸剂(micropellet)及栓剂(suppository))等。可利用本所属领域常规技术将上述各系统配制为正常、延缓或加速释放的剂型。可依据标准技术及本揭示内容所述技术来制备包含本揭示内容所述的蛋白脂质体的药物组合物。在某些实施例中，是将药物组合物配制为可用于肠胃外投药，包括管内施用(intracanalicularadministration)、静脉内施用(intravenousadministration)、皮下施用(subcutaneousadministration)及肌肉内施用(intramuscularadministration)。在某些实施例中，是以推注(bolusinjection)或注入方式将药物组合物施用至静脉内。适用于本发明的剂型可参照remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany,philadelphia,pa.,17thed.(1985)。在某些实施例中，将药物组合物配制为注射形式，例如静脉内注入形式。可依据本所属领域常规技术以适当的分散或润湿剂(例如吐温80(tween80))或悬浮剂来配制无菌组合物，例如无菌注射液体或油性悬浮液。无菌注射制剂也可为无菌注射溶液或悬浮液，其是于无毒性的肠胃外可接受的稀释剂或悬浮液中，例如于1,3-丁二醇中的溶液。可接受的载体及溶剂可以是甘露醇(mannitol)、水、林格氏液(ringer’ssolution)或等渗氯化钠溶液。此外，无菌的非挥发性油通常可作为溶剂或悬浮媒介(例如合成的单甘油酯或双甘油酯)。可利用油酸(oleicacid)及其甘油酯衍生物等脂肪酸来制备注射物，或是利用天然药学上可接受的油类(例如橄榄油或蓖麻油，特别是其聚氧乙基形式)来制备注射物。该些油性溶液或悬浮液也可包含一长链酒精稀释剂或分散剂、或羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose)或相似的分散剂。也可利用药学制备上其它常见的表面活性剂(surfactant，例如吐温，tweens或span系列)、其它相似的乳化剂或具有生物利用性的增强剂来制备注射物。任一种药物组合物皆可以循环单核细胞作为载体，由此将治疗药剂传递至特定的靶点。在使用上，是对一有治疗需要的个体(例如人类)施用一有效量的包含任一种本揭示内容所述的蛋白脂质体的药物组合物，其中该蛋白脂质体包覆一治疗药剂(例如一抗炎药剂)，且可利用本揭示内容所述的适当路径来施用该药物组合物。蛋白脂质体会利用与单核细胞结合的活性，随着单核细胞于个体体内循环，进而到达单核细胞聚集的位置(例如发炎位置)。一旦单核细胞穿越内皮细胞层，即会分化为巨噬细胞，并会利用胞饮作用吸收附着的蛋白脂质体，进而放释包覆的治疗药剂以产生治疗功效。“一有效量”(aneffectiveamount)在本说明书是指不论是在单独使用或是与一种或多种种其它活性物质共同使用的情况下，各活性物质能于个体体内产生治疗效果的用量。如本领域技术人员所知，有效量会随着施用路径、赋形剂使用及其它活性物质的共同使用而有所调整。当然，该用量也会随着欲治疗的特定状况、疾病的严重程度、个体患者的参数(包括年龄、身体状况、体型、性别及体重)、治疗持续时间、同步疗法(如果有的话)的性质及特定施用路径等医疗人员于其专业知识及技能范畴内予以辨断的相关因素而有所调整。该些因素为本领域技术人员所熟知且不需常规实验即可了解。通常是优选使用各成分或其组合的最大剂量，即在健全的医疗判断下，施用最高的安全剂量。然而，本领域技术人员应理解，病患可能基于医药因素、心理因素或其它因素而坚持使用较低的剂量或耐受剂量。在某些实施方式中，利用包含本揭示内容所述的抗炎药剂的药物组合物来治疗缺血性心脏病(ischemicheartdisease,ihd)。“治疗”(treating)一词在本说明书是指对一个体施用或施予一包含一种或多种活性成分的组合物，其中该个体患有过敏疾病、过敏疾病的症状或有罹患过敏疾病之的倾向，用来治疗、治愈、改善、减缓、改变、治疗、减轻、改进或影响该疾病、该疾病的症状或罹患该疾病的倾向在施用至患有ihd、疑似患有ihd或有患ihd风险的个体(例如人类ihd病患)后，蛋白脂质体会通过附着于单核细胞而被传递到心脏梗塞区域，并于靶点产生特定的治疗功效。ihd是一种由于补给至心脏的血流量减少(例如动脉粥状硬化(atherosclerosis))所导致的疾病。与ihd相关的症状包含，但不限于，胸痛及不舒适。试剂盒本揭示内容也提供一种试剂盒，其用以将治疗药剂传递至靶点，或是用以将抗-ihd药剂(例如抗炎药剂)传递到心脏梗塞区域以治疗ihd。本发明试剂盒可包含一种或多种容器，其包含任一种本揭示内容所述的药物组合物，其中该药物组合物包含一种包覆治疗药剂的蛋白微粒(例如蛋白脂质体或纳米粒子)，以及一药学上可接受的载体。在某些实施方式中，试剂盒可包含依据任一种本揭示内容所述方法而撰述的使用操作说明。使用操作说明可包含施用药物组合物以传递包覆其中的治疗药剂的说明，或是依据任一种本揭示内容所述方法来治疗ihd的说明。试剂盒可进一步包含一用以筛选适于治疗的个体的说明，其是基于确认该个体是否患有ihd、疑似患有ihd或有罹患ihd风险来进行筛选。关于本揭示内容所述的药物组合物(其包含一包覆一治疗药剂的蛋白脂质体)的使用操作说明，通常包含用以进行特定治疗的剂量、投药流程及施用路径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如多剂量包装)或次单位剂量。试剂盒随附的使用操作说明通常是书写于标签或包装内含物(例如试剂盒随附的书面数据)的书面说明，或是以机器可读取(例如储存于磁盘或光盘的说明书)的形式提供。标签或包装内含物指出组合物用以将治疗药剂传递到靶点，或是用以治疗ihd。使用操作说明可提供实施任一种本揭示内容所述的方法。本揭示内容所述的试剂盒是位于适当的包装内。适当的包装包含，但不限于，安瓶(vial)、瓶子(bottle)、瓶罐(jar)及软包装(flexiblepackaging，例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。也可为与特定装置(例如喷雾器等吸入或鼻腔给药装置)或注入装置(例如小型泵(minipump))共同使用的包装。试剂盒可具有一无菌入口(举例来说，容器可以是一静脉内溶液袋或一具有可以皮下注射针头穿刺的塞子的安瓶)。容器也可具有一无菌入口(举例来说，容器可以是一静脉内溶液袋或一具有可以皮下注射针头穿刺的塞子的安瓶)。本揭示内容所述的试剂盒可具选择性地提供其它成分，例如缓冲液或翻译信息。正常来说，试剂盒包含一容器及标签或包装内含物或以容器随附型式提供。在某些实施方式中，本揭示内容提供了用以制备本发明试剂盒的内容物的说明。惯用技术除非另所有指，否则可于本领域技术人员所熟知之范畴内，利用分子生物学、微生物学、细胞生物学、生化学及免疫学的常规技术(包含重组技术)来实现本发明。下列文献充分说明了该些技术：例如molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition(sambrook,etal.,1989)coldspringharborpress；oligonucleotidesynthesis(m.j.gait,ed.,1984)；methodsinmolecularbiology,humanapress；cellbiology:alaboratorynotebook(j.e.cellis,ed.,1998)academicpress；animalcellculture(r.i.freshney,ed.,1987)；introductiontocellandtissueculture(j.p.matherandp.e.roberts,1998)plenumpress；cellandtissueculture:laboratoryprocedures(a.doyle,j.b.griffiths,andd.g.newell,eds.,1993-8)j.wileyandsons；methodsinenzymology(academicpress,inc.)；handbookofexperimentalimmunology(d.m.weirandc.c.blackwell,eds.)；genetransfervectorsformammaliancells(j.m.millerandm.p.calos,eds.,1987)；currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel,etal.,eds.,1987)；pcr:thepolymerasechainreaction,(mullis,etal.,eds.,1994)；currentprotocolsinimmunology(j.e.coliganetal.,eds.,1991)；shortprotocolsinmolecularbiology(wileyandsons,1999)；immunobiology(c.a.janewayandp.travers,1997)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies:apracticalapproach(d.catty.,ed.,irlpress,1988-1989)；monoclonalantibodies:apracticalapproach(p.shepherdandc.dean,eds.,oxforduniversitypress,2000)；usingantibodies:alaboratorymanual(e.harlowandd.lane(coldspringharborlaboratorypress,1999)；theantibodies(m.zanettiandj.d.capra,eds.,harwoodacademicpublishers,1995)。即使没有进一步的说明，本领域技术人员仍可基于本说明书充分实施本发明。下文提出多个实施方式仅用来说明本发明，不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。此处所引用的所有公开文献，为了本文引用的目的和主题，均以引用的形式并入本文。实施例：生物模拟血小板-单核细胞的作用以作为靶向治疗急性心肌梗塞的新颖策略有鉴于多种于基础研究中具有潜力的心脏保护药物无法成功应用在临床治疗上，研发有效的心脏保护治疗策略仍为相关领域一大挑战。关键之一在于使传递目标药物至梗塞心脏的过程最佳化。目前已有数种药物传递系统会主动将包覆药物传递至梗塞区域，功能化该些传递系统的表面仅能增加其于靶点的停留时间或于体内的循环半衰期。因此，仍需要强化该些传递系统的穿透及保留(enhancedpermeabilityandretention,epr)功效，使其成为传递药物的主要路径。本研究提供了一种新颖的药物传递系统，可传递心脏保护药物至心脏梗塞区域，而无须仰赖epr功效。此种新颖的药物传递系统主要是以生物方式模拟心肌梗塞后期(post-myocardialinfarction,mi)，血小板与循环单核细胞之间的作用。举例来说，利用经纯化之人类血小板膜蛋白及脂质(例如1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,dopc)脂质)来制备类血小板蛋白脂质体(platelet-likeproteoliposome,plp)。图1b即阐述了此一策略。活体外实验结果指出，plp对单核细胞及巨噬细胞具有很强的结合亲和力，对内皮细胞却不具结合亲和力。活体多光子影像(intravitalmultiphotonimaging)显示，相较于纯脂质体对照组，plp对组织损伤位置具有较佳的靶向功效。于72小时的再灌流后(为单核细胞聚集最密集的时间点)，施用注射可发现，相较于对照区域，plp会显著地聚集在心脏梗塞区域。此外，包覆于plp内的钴原卟啉(cobaltprotoporphyrin,copp)(plp-copp)可改善mi小鼠模型的心脏功能，并减少包覆药物产生的副作用。本研究结果指出，本揭示内容所述的plp系统可有效将药物传递至心脏梗塞区域等特定位置。材料及方法动物实验本研究使用八周大的balb/c公鼠购自中国台湾实验动物中心(nationallaboratoryanimalcenter,taiwan)，且饲养于可自由采食食物及饮用水的12小时夜间/日间循环的环境中。依据ojha等人所述方法((2008),amjphysiolheartcircphysiol294:h2435-h2443)，进行心肌缺血-再灌流(i/r)的外科手术。简单来说，将小鼠置于具有适当速率及呼吸容量(tidalvolume)的室内空气-异氟醚(isoflurane)通风环境中。利用左侧胸切开术(leftthoracotomy)观测心脏，其中左肺会收缩，用来露出心包(pericardium)。接着，提高左心房以露出左前降冠状动脉(leftanteriordescendingcoronaryartery,lad)，利用位于锥形针的7-0丝质缝合线进行分离。缝合线是固着于聚乙烯-10(polyethylene-10)管上，可利用冠状动脉闭塞产生可逆性缺血。于闭塞后，持续缺血45分钟。45分钟后，解开缝合线，以对受损的心肌进行再灌流。隔天，利用心脏超音波检测小鼠的外科手术是否成功。利用相似的方法，于距离左心耳(leftatrialappendage)2-3毫米的位置对lad进行永久性接合，以产生心肌缺血(myocardialischemia,mi)的小鼠模型。心脏超音波依据chen等人所述方法((2015),stemcellstransmed4:269-275)，以30-mhz探针(vevo770；visualsonics,toronto,on,canada)检测i/r及mi小鼠模型的心脏功能。先以左侧卧位方式检测(leftlateraldecubitusposition)小鼠。以m-模式及二维心脏超音波影像得到胸骨旁长轴切面(parasternallongaxisview)。于乳突肌(papillarymuscle)插入位置测量垂直于心室长轴的左心室舒张末期内径(leftventricularend-diastolicdiameter,lvedd)及左心室收缩末期内径(leftventricularend-systolicdiameter,lvesd)。利用心脏超音波系统依据(lvedv-lvesv)/lvedv×100％公式自动计算得到lvef，其中lvedv为左心室舒张末期容积(leftventricularend-diastolicvolume)，其是以7.0lvedd3/(2.4+lvedd)公式进行计算；而lvesv则是左心室收缩末期容积(leftventricleend-systolicvolume)，其系以7.0×lvesd3/(2.4+lvesd)公式进行计算。分离人类血小板及纯化血小板膜蛋白在中央研究院生物医学科学研究所的道德伦理委员会许可下，收集人类捐赠者身上未活化或部分活化的血小板。将血液收集至经酸性柠檬酸葡萄糖(acidcitratedextrose,acd)抗凝血剂(anticoagulant)处理过的真空采血管(bdsciences,cat#366450)中。于室温以350×g转速离心20分钟，以得到富含血小板的血浆(plateletrichplasma,prp)。将prp的上层移至一新的离心管中，丢弃下层。于室温以1,200×g的转速离心10分钟，以得到血小板沉淀物及几乎不含血小板的血浆(上清液)。将血小板沉淀物悬浮于台氏缓冲液(tyrode’sbuffer；1.8mmcacl2、1mmmgcl2、2.7mmkcl、136.9mmnacl、0.4mmnah2po4、11.9mmnahco3、5.6mmd-葡萄糖及每毫升0.1u的腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase))，再于室温以1,200×g的转速再次离心10分钟。丢弃上清液，将血小板再悬浮于1毫升的台氏缓冲液中。适当修改donovan等人所述方法((2013),alzheimer’sresther5:32)来纯化人类血小板膜蛋白。简单来说，将纯化的人类血小板沉淀物悬浮于台氏缓冲液中，再于室温以1,100×g的转速离心15分钟；之后，将沉淀物再悬浮于5毫升的血小板溶解缓冲液(10mmtrishcl、1.5mmmgcl2、10mmkcl、0.5mmpmsf、ph8)中，于冰上放置30分钟。接着，于冰上对悬浮的血小板溶液进行6×15秒的超音波震荡处理，再于室温以1,500×g的转速离心10分钟；丢弃经分离的血小板胞器，并保留位于上清液的剩余的血小板蛋白成分。于4℃以180,000×g的转速离心2小时后，将沉淀物再悬浮于100mmna2co3、ph11溶液中，置于冰上15分钟以移除蛋白成分中残留的脂质残基。于4℃将溶液以180,000×g的转速离心2小时，将沉淀物再悬浮于无菌水中。图1c阐述了由完整血小板均质物纯化pmp的例示式流程。确认蛋白由台湾中央研究院的ibms蛋白质体核心设施(ibmsproteincorefacility)确认经纯化的人类血小板膜蛋白溶液中的膜蛋白。细胞将小鼠内皮细胞svec(crl-2181,atcc)及单核细胞raw264.7细胞(tib-71,atcc)培养于包含2mm谷氨酰胺(glutamine)及10％胎牛血清(fetalcalfserum)的dmem细胞培养液(dulbecco’smodifiedeagle’smedium)中。依据zhang等人所述方法((2008),currprotocimmunol14:14.1)，由成鼠分离小鼠的腹腔巨噬细胞(peritonealmacrophage,mφ)。简单来说，至少将小鼠暴露于2毫升的3％巯基乙酸盐(thioglycollate)中3天。以冰的pbs(10毫升)收集腹腔渗出的细胞。于37℃的环境下，使细胞贴附于组织培养盘2小时，接着置换新鲜的细胞培养液(dmem/f-12+10％fbs)。sds-page及蛋白免疫印记以4-12％之sds-聚丙烯酰胺凝胶(sds-polyacrylamidegel,biorad,us)分离样本。转移至pvdf膜后，加入一级及二级抗体，再以ecl-plus试剂检测信号。一级抗人类gpiib抗体(gtx113758)、抗人类cd42c抗体(gtx113355)及抗β-肌动蛋白抗体(gtx109639)是购买自genetex(us)。抗人类cd62p(sc-19672)是购买自santacruz(us)。兔子多株抗ho-1抗体是依据lin等人所述方法((2013),arteriosclerthrombvascbiol33:785-794)自行制备。组织染色先将样本置于蔗糖溶液(15％，w/v)6小时，再置于浓缩的(30％，w/v)蔗糖溶液整晚，于-20℃的环境中，将脱水组织包埋于组织冷冻液中，并进行冷冻切片。将5微米厚的组织切片固定于玻片上，再依据标准马森三色染色法(masson’strichromestaining)进行苏木精-曙红(hematoxylin-eosin)染色。以附于显微镜(axiovert200m；zeiss,germany)的数字相机(modeld30；hitachi,japan)拍摄经染色的组织切片。免疫荧光影像以diic18(lifetechnologies,us)标记纯脂质体及plp。接着，检测经dii标记的材料，以了解其与不同细胞类型之间的作用。先将细胞种植于玻片上，再使其暴露于任一种上述材料中，于37℃反应6小时。以温的pbs洗涤以移除未结合的材料。之后，在种植在玻片上的细胞上加上盖玻片，以zeissaxioscope显微镜拍摄并以axiovision软件处理细胞照片。以抗-小鼠肌钙蛋白i(anti-murinetroponini,dshb,us)标记经dii标记之纯的脂质体及plp，以染色小鼠心肌细胞，再以dapi(0.1mg/ml)染色细胞核。以zeissaxioscope显微镜拍摄并以axiovision软件处理细胞照片。分离非肌肉细胞由成鼠取出心脏细胞后，以冷的包含1％fbs的汉克平衡盐溶液(hank'sbalancedsaltsolution,hbss)洗涤组织3次。对心脏进行灌流以移除过多的血液，再将心脏置于200微升的中性蛋白酶溶液(dispaseiisolution，每毫升5u之dispaseii、5mmcacl2、每毫升0.1u之胶原酶b(collagenaseb))中。以刀片切割心脏，并使其通过细网，之后置于5毫升的中性蛋白酶溶液，于37℃作用30分钟。接着，加入5毫升的包含10％fbs的dmem，再以40微米过滤器于冰上进行过滤。保留过滤液，并于4℃以1,000rpm的转速离心5分钟。以流式细胞仪分析沉淀物。流式细胞分析使细胞暴露于经dii标示的纯脂质体或经dii标示的plp后，以温的pbs洗涤细胞。于室温以1,000rpm的转速离心5分钟，以移除未结合的纯脂质体或plp。接着，将细胞沉淀物与5％山羊血清混合物于冰上反应30分钟。于4℃以1,000rpm的转速离心5分钟后，将样本与特定一级抗体进行反应：与apc接合的抗-小鼠f4/80抗体(mca497apc,abdserotec,us)、抗-小鼠cd11b抗体(14-0112,ebioscience,us)或抗-cd144抗体(555289,bdscience,us)，于4℃避光反应1小时。于4℃以1,000rpm的转速离心5分钟，以移除过多的一级抗体。接着，将样本与具有荧光标记的二级抗体于4℃避光反应1小时。利用离心移除过多的二级抗体后，以流式细胞仪(bdscience,us)分析样本。pcr分析以tri试剂(1毫升/整个心脏)由整个心脏分离出总rna。接着，利用随机引物混合物(randomprimermixer,protoscriptm-mulvfirststrandcdnasynthesiskit,newenglandbiolabs)将1微克的rna转录为cdna，再利用特定的引物(表1)以pcr反应(35个循环)进行扩增。将反应物于95℃反应1分钟、58℃反应1分钟及于72℃反应1.5分钟，以分别使其变性(denaturation)、退火(annealing)及延伸(extension)。于tbe缓冲液(80mmtris碱、80mm硼酸及2mmedta、ph8)中，以1％(重量/体积)琼脂糖凝胶及60伏特电压(作用1小时)分离pcr产物。利用healthview核酸染剂(healthviewnucleicacidstain,genomics,taipei,taiwan)染色凝胶，30分钟后以紫外光进行分析。表1：引物序列制备类血小板蛋白脂质体依据jang等人所述之薄膜水合法((2012),pnas109:1679-1684)来制备类血小板蛋白脂质体。图1a阐述了例示性步骤。将每毫升10毫克的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,dopc)及3.28毫克的胆固醇(avantipolarlipids)分别溶于1毫升的溶剂(由体积比为9:1之氯仿(chloroform)及甲醇所组成)后，调整体积使二者以6:4的摩尔比均匀混合。利用旋转蒸发器(rotaryevaporator)形成薄膜。若脂质预先以diic18(lifetechnologies,us)进行标记，则在薄膜形成步骤前，将染剂加入原混合物中(每10毫克的dopc加入20微升)。将膜悬浮于1毫升的hepes-pbs缓冲液中，最终的脂质浓度约为每毫升10毫克。经数次冷冻-解冻后，利用100纳米的聚碳酸酯膜(whatman,us)挤压脂质溶液。将制得的脂质溶液与经纯化的人类血小板膜蛋白以30:1的比例均匀混合，加入1％正辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷(n-octyl-β-d-glucopyranoside,og)，于室温反应1小时。依据使用操作手册(biorad)，利用sm2-生物磁珠(sm2-biobead)移除清洁剂。之后，于4℃以6,000×g的转速离心5分钟，用来从磁珠中分离plp。于4℃利用pbs对上清液(不包含清洁剂的蛋白脂质体)进行透析反应，以移除任何未接合的人类pmp。依据hamori等人所述方法((1993),pediatrres34:1-5)，以plp包覆钴原卟啉(cobaltprotoporphyrin,copp,enzo)。将欲包覆的copp与无清洁剂的plp溶液混合，再以液态氮进行冷冻。接着，将混合物冷冻干燥过夜。第二天，以pbs水合冷冻干燥产物，再于4℃以80,000rpm的转速离心2小时。再次悬浮沉淀物并进行超高速离心1小时，以移除过多的copp。最后，将沉淀物悬浮于特定体积的pbs中。hplc定量依据chen等人所述方法((2015),nanoscale7:15863-15872)来制备欲进行hplc分析的样本。注射dii标记的纯脂质体或plp4小时后，以pbs灌流所有小鼠以移除血管中所有以dii标记的材料。接着，牺牲动物后，快速收集主要器官(脑、肺脏、心脏、肝脏、肾脏及脾脏)。将收集的组织切割出几个约为100毫克的组织块，并予以秤重。向各样本中加入ipa缓冲液(0.5毫升，将10％异丙醇与0.075mhcl以9:1的体积比均匀混合)，再以magnalyser机器利用氧化锆磁珠(zirconiabead,roche,mannheim,germany)均质化处理(罗氏，曼海姆，德国)。于4℃以3,000rpm的转速对均质化样本离心20秒，再加入0.5毫升的ipa缓冲液。置于4℃反应至隔日后，于4℃以14,000rp的转速离心15分钟。吸取并稀释包含萃取荧光染剂的上清液，之后进行hplc分析。利用waterse2695分离模块及waters2475flr检测器(usa)进行hplc分析。使用x-bridgec18管柱(250×4.6毫米,5微米,waters,usa)，将温度设定为40℃，并将荧光检测器的激发波长及发射波长分别设定为505纳米及515纳米。流动相是由甲醇及去离子水所组成(二者体积比为77:23)，流速为每分钟1毫升。序列稀释已知浓度的dil标记的纯脂质体或plp，以测量hplc标准品。利用裂解缓冲液(90％乙醇/10％1mhcl，体积比)处理以纯脂质体包覆的copp(lipo-copp)及以plp包覆的copp(plp-copp)溶液，利用测量copp由纯脂质体或plp释出的含量来确定纯脂质体或plp对copp的包覆效率。将溶液进行hplc分析。使用x-bridgec18管柱(250×4.6mm,5m,waters,usa)，将温度设定为40℃，并将荧光检测器的激发波长及发射波长分别设定为404纳米及417纳米。rossietal.,(1986),biomedchrom1:163-168。绘出已知浓度之copp的标准曲线，并测定各样本的包覆效率。冷冻电子显微镜(cryo-em)及透射电子显微镜(tem)冷冻电子显微镜影像是由台湾中央研究院的学术及仪器事务处的冷冻电子显微镜核心设施所的独立操作人员制备及拍摄。简单来说，利用tecnaif20电子显微镜(fei)以200kev来拍摄纯脂质体或plp的照片。各次曝光的低剂量条件约为20以2到3微米的离焦距离(defocus)拍摄照片，并利用4k×4kccd相机(gatan,usa)记录。已吞噬plp的巨噬细胞的透射电子显微镜影像是由台湾中央研究院的学术及仪器事务处的透射电子显微镜核心设施所的独立操作人员制备及拍摄。先将细胞种植于aclar膜(ems,us)上，于37℃培养至隔日。接着，将种植的细胞暴露于plp并于37℃反应6小时后，以温的pbs移除过多的plp。对样本进行tem分析。活体多光子显微镜依据lee等人所述方法((2012),natcommun3:1054)来进行活体多光子影像实验。实验前，先去除小鼠耳朵上的毛，再以75％乙醇及水擦拭。以多光子激光束照射耳朵真皮层的特定区域，照射时间约30秒，以造成激光损伤。以2.5％异氟醚(minrad)麻醉小鼠，实验中是将其维持于1.5％异氟醚的麻醉环境。将小鼠分成纯脂质体或plp治疗(n＝3)二组后，由尾静脉以静脉注射方式注入fitc-聚葡萄醣(dextran)，以标记小鼠的血管。待其稳定4小时后，以fvmpe-rs多模块多光子扫描显微镜(fvmpe-rsmulti-modemultiphotonscanningmicroscope,olympus)观察组织损伤区域。接着，由尾静脉以静脉注射方式注入100微升的每毫升5毫克的具有dii标记的纯脂质体或plp，而后立即观察耳朵组织损伤的区域，之后每5分钟观察一次，直到30分钟。ho-1活性试验通过测量细胞萃取物中胆红素的含量来确认暴露于copp之细胞中经诱发表达的ho-1的专一活性。lametal.,(2005),jimmunol174:2297-2304。将细胞沉淀物悬浮于添加镁的磷酸钾溶液(magnesium-supplementedpotassiumphosphatesolution，0.1mkpo4及2mmmgcl2；ph7.4)中，以冷冻-解冻循环处理3次后，利用超音波震荡使细胞质中的ho-1蛋白释放出来。利用反应混合物(包含100mmpbs、2mmmgcl2、3毫克的大鼠肝脏细胞质、0.8mmnadph、2mm的葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate)、0.2u的葡萄糖-6-磷酸去氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase)、20μm的酶底物氯高铁血红素(hemin)及1毫克的样本)进行ho-1酶试验。各样本的最终反应体积皆为1毫升，之后于37℃避光孵育1小时。加入氯仿以中止反应；之后萃取并离心胆红素，利用介于464及530纳米的吸光差异(胆红素的消光系数为40mm-1cm-1)，以光谱仪进行测量。以bradford蛋白试验检测各样本的蛋白浓度；将ho-1的活性表示为每小时每毫克蛋白所形成的胆红素(微摩尔)。血液试验所有的血液试验皆是由台湾中央研究院的台湾小鼠诊所的独立操作人员完成。所有的分析皆是使用约56周大的balb/c公鼠(各组n＝5)。统计分析利用单向anova(分析差异)检测及tukeypost-hoc检测来比对各治疗组于检测条件下的统计显著性。p值小于0.05即视为具有显著性。结果由人类血小板纯化血小板膜蛋白利用sds-page及蛋白免疫印记来确认纯化的血小板膜蛋白溶液不包含任何细胞质蛋白(图1d及1e分别阐述该些分析结果)。sds-page结果显示于注入纯化pmp的蛋白条(lane)中会出现多条蛋白带(band)，可能代表不同的pmp(白框，图1d)。除了纯化的人类pmp(黑框，图1d)外，所有的样本中皆可观察到β-肌动蛋白，其位于约42kda的位置(moebiusetal.,(2005),molcellproteomics4:1754-1761)。基于β-肌动蛋白是血小板内主要的细胞质蛋白(lewandrowskietal.,(2009),blood114:e10-e19)，若未检测到β-肌动蛋白即代表纯化的pmp溶液几乎没有细胞质蛋白污染。进一步利用蛋白免疫印记来确认某些检测带。如图1e所示，于plp样本可检测到血小板蛋白(例如cd62、gpiib及cd42c)却未检测到β-肌动蛋白。cd62p(p-选择蛋白(p-selectin))是一种活化的血小板受体，已知会与单核细胞的p-选择蛋白醣蛋白配体-1(p-selectinglycoproteinligand-1,psgl-1)作用，而gpiib(整合素(integrin)iib)则会透过纤维蛋白原(fibrinogen)与单核细胞的cd11b(整合素m)作用。已知血小板cd42c(gpib)会直接与单核细胞之cd11b作用。利用质谱分析来确认纯化pmp溶液中三种血小板受体及其它已知会与单核细胞作用的血小板受体(表2)。gpiib及cd42c会持续表达于血小板膜的表面，而cd62p则为早期血小板活化的标记物，针头穿刺会“些微地”(weakly)诱发其表达。murakamietal.,(1996),europeanjofclininvest26:966-1003；marquardtetal.,(2002),stroke33:2570-2574；harmonetal.,(2011)intcellularmedsociety1-11。表2：由蛋白质谱仪确定血小板膜蛋白可利用上述表格所列之一种或多种种血小板膜蛋白来制备本揭示内容所述的plp。在某些实施例中，利用至少一种以粗体表示的蛋白(已确认参与血小板-单核细胞作用的蛋白)来制备本揭示内容所述的plp。利用重组人类pmp及具有dopc的脂质体来制备plp依薄膜水合法(jangetal.,(2012),pnas109:1679-1684)来制备数批plp，该些plp皆是由dopc及胆固醇(重量比为9:1)的混合物及纯化的人类pmp以30:1的比例所组成。在冷冻电子显微照片中，纯脂质体具有不规则的形状且会聚集(图1f)。相较之下，plp均呈现圆形。然而，冷冻电子显微照片指出，plp的大小并不一致，即并非所有plp的大小皆约为100纳米。动态光散射(dynamiclightscattering,dls)测量结果显示相似的结果，平均来说，多数plp的大小皆接近100纳米(pdi＝0.077)，而纯脂质体的平均大小则约为130纳米(pdi＝0.12,表3)。重要的是，plp的表面会较纯脂质体带有更多的负电荷。已知血小板膜蛋白带有负电荷(lewandrowskietal.,(2009),blood214:e10-e19)，因此该结果证实人类pmp可成功接合至具有dopc的脂质体。此外，蛋白免疫印记也确认plp上人类pmp的存在(图1g)，该分析结果显示抗-人类gpiib及cd42c抗体仅会与plp产生阳性反应，而不会与纯脂质体产生阳性反应。表3：基于dopc的脂质体及plp的物理特性z-平均(nm)ζ电位(mv)pdi脂质体128.33±4.77-0.47±0.210.12±0.012plp100.47±5.97**-2.25±0.05***0.077±0.004利用malvernzetasizernanozs来测量三批不同的基于dopc的脂质体及plp(n＝3)的大小、表面电荷及多分散性指数(polydispersityindex,pdi)。plp的水力直径(hydraulicdiameter)及ζ电位是与脂质体进行统计分析比对。**,p<0.01，***,p<0.001。plp对单核细胞具有靶向专一性，对内皮细胞则不具靶向专一性为证实人类pmp具有功能性，将dii标记的纯脂质体及dii标记的plp与小鼠内皮细胞(svec)、小鼠单核细胞(raw264.7)及小鼠腹腔巨噬细胞(mφ)于37℃共同培养4小时。接着，移除过多或未结合的dii标记的纯脂质体或plp后，进行流式细胞分析(图3a)。与纯脂质体不同，plp对raw264.7细胞具有很强的结合亲和力，对svec则不具结合亲和力。由于mφ具有吞噬活性，相较于其它二种细胞类型，纯脂质体及plp皆会于mφ细胞中呈现较低的dii信号。此外，将plp暴露于mφ会造成多空泡的形成(白色箭头，图3b)，其中于某些空泡中可见到plp(白色箭头，第3b图)。关于dii-标记的纯脂质体及plp与三种细胞类型之间的作用，荧光照片也呈现相似的结果。三种受测细胞类型皆可与dii-标记的纯脂质体产生阳性反应(图3d)。相较之下，plp完全不会与svec产生反应，而在raw264.7及mφ中检测到dii的信号(图3e)。相较于纯脂质体会聚集于raw264.7细胞中，plp则会位于raw264.7的细胞表面，而不会进入细胞质。整体来说，该些结果证实位于plp上的人类pmp可使蛋白脂质体结合至单核细胞，而不会与内皮细胞结合。该特性极为重要，原因在于若以静脉注射方式施用，plp不会延着内皮细胞聚集，且相较于纯脂质体，plp更可能会附着于循环单核细胞上。或此外，本揭示内容所述的蛋白脂质体对血小板和/或红血球具有低结合活性，可减少引发血栓的机率。此外，暴露4小时后，多数的plp会位于raw264.7表面，而非细胞质；该结果显示，plp较不会被循环单核细胞吞噬，故可减少药物提早释放的机率。图2a显示荧光照片。以dii标记的脂质体对内皮细胞、单核细胞及巨噬细胞皆具有很强的结合力。相较之下，以dil标记的类血小板蛋白脂质体则仅会与单核细胞及巨噬细胞产生阳性信号。此外，类血小板蛋白脂质体的荧光信号是位于巨噬细胞内；然而，当与单核细胞共同培养时，该荧光信号则会位于其细胞膜表面。因此，该结果显示类血小板蛋白脂质体对单核细胞具有靶向专一性，对内皮细胞却不具靶向专一性。此外，类血小板蛋白脂质体会位于单核细胞细胞膜表面，而当与巨噬细胞共同培养时，则会位于其细胞内。流式细胞分析也可观察到相同的结果(第2b图)。相较于纯脂质体，plp对组织损伤位置具有更佳的靶向性基于在伤口愈合处及chd病患体内可观察到相似的发炎反应，利用激光诱发小鼠耳朵组织损伤作为动物模型，用来于活体内检测纯脂质体及plp的标的特性。产生损伤后，使小鼠休息约48小时，再由小鼠尾静脉以静脉注射方式施用dii标记的纯脂质体或plp。注射后，将双光子显微镜镜头聚焦于受伤区域，以捕捉二种脂质体的影像，每5分钟拍摄一次，直到30分钟。相较于注射plp的小鼠(图4b)，于受伤区域仅能观察到极少量的纯脂质体(白色箭头，图4a)。由30分钟时间点收集到的照片制作3维立体旋转影像，可发现到大量dii标记的plp会浸润到组织损伤位置，而于损伤组织仅能观察到极少量的纯脂质体。于30分钟时间点观察不是位于损伤区域的血管，可发现大量的dii标记的纯脂质体(图4c)。相较之下，于损伤位置外仅能检测到极少量的dii标记的plp(图4d)。相较于施用pbs或纯脂质体的小鼠，注射plp的小鼠的损伤位置具有显著较高的dii信号(第9图)。总结来说，活体多光子影像结果证实相较于纯脂质体，plp可能透过背负(piggy-backing)于循环单核细胞的方式，对损伤位置产生较佳的靶向性。plp对缺血/再灌流(i/r)损伤心脏具有较佳的靶向性为证实plp可临床应用到患冠状动脉心脏病(coronaryheartdisease,chd)的病患，利用i/r损伤小鼠模型来探讨纯脂质体与plp的组织分布特性。使小鼠经历45分钟的外科手术诱发性缺血后，进行再灌流。由于已知在人类chd病患中，聚集到心脏梗塞区域的单核细胞数量会于梗塞后72小时达到最高量(vanderlaanetal.,(2014)eurheartj35:376-385)，因此于24或72小时再灌流后，给小鼠注射100微升的5mg/kg的以dii标记的纯脂质体或plp。之后，使纯脂质体及plp于小鼠体内循环4小时后，牺牲小鼠，再进行hplc分析以了解器官内的dii信号量(第5a及5b图)。于24小时的再灌流后，施用纯脂质体或plp可发现，不论是施用何种脂质材料皆无法于小鼠脑部观察到任何的dii信号。于心脏、肺脏及肾脏可检测到少量的信号，然而纯脂质体及plp之间并没有显著的差异。肝脏及脾脏是二个施用纯脂质体及plp后，能观察到最高dii信号量的器官。有趣的是，相较于纯脂质体，脾脏内的plp具有显著较少的检测量，该结果显示，位于plp的人类pmp可能会抑制脾脏抓取(trap)plp。除了心脏外，于72小时之再灌流后静脉注射以dii标记的纯脂质体或plp也可观察到相似的分布状况。值得注意的是，不仅于脾脏中可观察到显著的差异，相较于纯脂质体，plp于心脏中也会产生较高的反应；该结果指出，位于plp的pmp会对心脏梗塞位置产生较佳的靶向性。于72小时的再灌流后施用plp的心脏组织切片也可检测到位于心脏梗塞位置的plp(图5c)。与对照组不同，不论是施用以dii标记的纯脂质体或plp，皆无法于i/r损伤心脏观察到完整的肌小节(sarcomere)结构。然而，可于梗塞区域清楚观察到plp的荧光信号，而于施用纯脂质体的心脏样本则无法检测到信号。为证实plp确实是透过单核细胞的媒介传递到受损心肌位置，利用流式细胞仪来检测整个心脏中浸润单核细胞的数量(图5d)。于24小时的再灌流后牺牲小鼠，取出心脏后发现不论是施用纯脂质体或plp，皆仅能观察到非常少量之cd11b+。相较之下，于72小时的再灌流后牺牲小鼠，则能于其损伤心脏中观察到显著增加的cd11b+细胞(图5e)。此外，相较于24小时的再灌流，于72小时再灌流后施用plp，可于心脏观察到显著较多的cd11b+dii+细胞量(图5f)。不论是在24或72小时的再灌流后施用纯脂质体，皆无法观察到相同的功效。因此，该结果显示，于72小时的再灌流后，进行注射，会诱发显著数量的plp利用单核细胞的介导浸润到受伤的心肌组织。施用以plp包覆的钴原卟啉(cobaltprotoporphyrinix,copp)会减少心脏的梗塞区域钴原卟啉(cobaltprotoporphyrinix,copp)是一种小分子，已知会透过诱导血红素加氧酶-1(hemeoxyenase-1,ho-1)的表达来抑制巨噬细胞的发炎活性(图10a)。ho-1会催化血红素分解产生胆绿素(biliverdin)、一氧化碳(carbonmonoxide,co)及铁。已知一氧化碳、胆绿素及胆红素(血红素最终的分解产物)具有很强的抗氧化及抗发炎活性(zhaoetal.,(2013),plosone8:e75927)，而副产物-铁则会参与铁蛋白(ferritin)的合成，其中铁蛋白具有抗凋亡的活性(zhaoetal.,(2013),plosone8:e75927)。施用copp会显著减少心脏的梗塞区域。sodhietal.,(2015),jcardiolther2:291-301；caoetal.,(2012)frontphysiol3:160；chenetal.,(2013)intjmolsci14:2684-2706。因此，将进一步探讨由静脉注射以plp包覆的copp(plp-copp)，是否会对i/r损伤小鼠模型产生相似的治疗功效。首先利用svec、raw264.7细胞及mφ来研究plp-copp能否诱导ho-1的表达(图10b)。虽然施用无包覆的copp会诱发ho-1的表达，然而相较于β-肌动蛋白的表达，施用以纯脂质体包覆的copp(lipo-copp)或plp-copp皆不会显著地增加svec中ho-1的表达。相较之下，施用无包覆的copp或lipo-copp会较未治疗组诱发更高量的ho-1表达。虽然相较于未治疗组，施用plp-copp会诱发raw264.7产生更高量的ho-1表达，然其蛋白带强度仍较无包覆的copp或lipo-copp微弱。因此，该些结果指出，与lipo-copp不同，位于plp表面的人类pmp会抑制细胞轻易吞噬被包覆的copp。相较于svec及raw264.7细胞，于所有形式的copp处理的mφ中，皆可观察到ho-1大量表达。此外，利用活体外活性试验测量胆红素的含量，结果证实所有经copp诱发表达的ho-1皆具有酶活性(第10c图)。此外，各copp治疗样本中的ho-1酶活性皆与酶表达量一致。在探讨plp-copp是否能减少i/r损伤小鼠模型的心脏梗塞区域前，先检测以纯脂质体及plp包覆的copp的稳定性(表5)。相对于lipo-copp，dls测量结果指出plp-copp于第3天的包覆效率与立即测量的数值之间不具有差异。此外，于包覆3天后，plp-copp的大小也无变化。然而，自7天后，不论是于lipo-copp或plp-copp皆可观察到显著减少的copp装载量。因此，在所有后续的动物实验中，皆是于活体实验前一天制备lipo-copp，而于实验前3-4新鲜制备plp-copp。表5：对包覆于plp中的copp进行定量对三批包覆于脂质体或plp的之钴原卟啉(cobaltprotoporphyrinix,copp)(n＝3)进行动态光散射分析，以确定包覆后的颗粒大小。利用hplc检测不同孵育时间中，脂质体或plp对copp的包覆效率。相对于立即检测纯脂质体或plp中copp的包覆效率，**,p<0.01,***,p<0.001。先前copp于小鼠的药物动力研究指出，每5天施用5mg/kg的copp足以于活体内诱发大量的ho-1表达(chenetal.,(2013),intjmolsci14:2684-2706)。在对小鼠进行45分钟的缺血及约72小时的再灌流后，由尾静脉注入100微升的5mg/kg的未包覆的copp、lipo-copp或plp-copp(第6a图)。之后每5天于再灌流后施用相同的剂量，直到第21天；牺牲小鼠后，收集其心脏进行组织分析(第6b及11图)。相较于i/r+生理盐水组，用lipo-copp处理的小鼠并无明显改善减少梗塞区域，于施用无包覆的copp或plp-copp的小鼠则可观察到显著的减少(第6c图)。该些结果证实以plp包覆copp不会减少药物的治疗效益。此外，包覆于纯脂质体中的copp无法对心脏梗塞位置产生任何治疗功效，该结果指出经接合的人类pmp对使包覆药物靶向至梗塞心脏极为重要。施用copp或plp-copp会降低i/r受损心脏中数种促发炎基因的表达(第6d图)。相较于施用生理盐水及lipo-copp，由静脉注射copp或plp-copp会增加小鼠心脏中ho-1基因(hmxo1)的表达。相较之下，于copp及plp-copp治疗组别中，可观察到诸如tnfα、mcp-1、il6及il1β等促发炎基因表达下降。因此，该些结果指出copp及plp-copp皆可诱发i/r受损心脏中ho-1的表达，且具抗发炎功效的ho-1可使数种促发炎细胞激素的表达量下降。plp会最小化copp的副作用虽然mi动物模型已充分证实copp的治疗效益，然也有文献报导其非预期的脱靶功效(schmidt,(2007),fasebj21:2639；ryteretal.,(2006)physiolrev86:583-650)。为了评估plp-copp整体的功效，于plp-copp治疗后检测非灌流的mi小鼠模型的心脏功能。一旦以外科手术诱发缺血后，于梗塞后3天，由静脉注射100微升的每毫升5毫克的无包覆的copp、lipo-copp或plp-copp。接着，每5天施用一次相同剂量，直到梗塞后28天(第7a图)。于mi后28天，以心脏超音波检测各组小鼠的心脏功能(第7b图)。mi+plp-copp组的左心室射出分率的百分比(lvef％，用以测量每次心脏收缩时，离开心脏的血流量)会显著地较mi+生理盐水、mi+lipo-copp及仅用二种载体组高。mi+copp及mi+plp-copp二组之间并无显著的差异。在检测短缩分率(thepercentageoffractionalshortening,fs％，其会受到心肌厚度的影响)时也可观察到相似的结果；相较于其它治疗组别(除了mi+copp组)，施用plp-copp可显著地改善fs％。也对各组的左心室舒张末期容积(lvedv)及左心室收缩末期容积(lvesv)进行评估。施用无包覆的copp或plp-copp皆无法将lvedv及lvesv的数值降低到与对照组相同的程度，然而该治疗结果仍显著地优于其它治疗组别。相似地，舒张期心室间隔厚度(ivsd)或收缩期心室间隔厚度(ivss)的检测更进一步指出plp-copp可与施用无包覆copp治疗相似地改善小鼠整体的心脏功能。接着，为确认plp能否将copp对其它器官的脱靶效果最小化，于28天治疗结束后，利用血清分析检测各治疗组的血液(第7c-7e图)。以血清中的天冬氨酸转氨酶(aspartatetransaminase,ast)、丙氨酸转氨酶(alaninetransaminase,alt)及总胆红素作为生物标记物来评估copp的肝毒性(第7c图)。各治疗组间ast及tbil测量并无显著的差异。然而，相较于mi+plp-copp组，于mi+copp组可检测到显著较高量的alt。此外，mi+lipo-copp及mi+plp-copp组具有与对照组相似的alt含量。检测血清中作为肾脏毒性的生物标记物的血尿素氮(bloodurinenitrogen,bun)及肌酐(creatinine,cre)也可得到相似的结果(第7d图)。结果清楚指出，copp治疗会增加血清中bun或cre的含量，而lipo-copp及plp-copp则不会。检测血清中可作为心脏毒性之生物标记物的肌酸激酶mb(creatinekinasemb,ckmb)含量可发现，相较于其它治疗组别，mi+copp及mi+plp-copp组具有显著较低的ckmb含量(第7e图)。该结果指出，copp本身不会诱发任何额外的心脏毒性，而增加的ckmb量可能是缺血性损伤造成的结果。总结上述，本研究的结果证实本揭示内容所述的plp可有效地将copp传递到心脏的受损区域，并减少与copp脱靶传递相关的副作用。第8图阐述了该流程。讨论将具有潜力的心脏保护药物由实验阶段转移到临床应用仍为医疗挑战之一。即使相关领域过去数十年来持续进行研究发展，目前仍无商业可得的有效的心脏保护药物(altamiranoetal.,(2015),jphysiol593:3773-3788；perriconeetal.,(2014),pharmacolres89:36-45；sluijteretal.,(2014),pharmacolther144:60-70)。某些较差的临床结果主要是归因于使用不当的动物模型及人类病患的个人生活方式。然而，目前仍未使全身性传递药物的靶向专一性达到最大化。举例来说，已知二甲双胍(metformin，一种经美国食品药物管理局许可的用以治疗第ii型糖尿病的抗糖尿病药物)于数种动物模型中具有心脏保护功效(whittingtonetal.,(2013),cardiovascdrugther27:5-16)。然而，近期的临床试验指出，于冠状动脉绕道手术中，预先对chd病患施用二甲双胍无法显著地减少心肌损伤(elmessaoudietal.,(2015),lancetdiabetesendocrinol3:615-623)。此外，相较于施用安慰剂的组别，施用二甲双胍治疗的病患有显著较高的机率产生腹泻及其它胃肠道不适等征状。临床结果证实二甲双胍不仅不具心脏保护功能，更会于治疗病患体内引发副作用。虽然有数种药物传递系统声称可主动传递到心脏梗塞位置，然而将该些传递系统的表面功能化仅能增加其于靶点的停留时间和/或增加其循环半衰期(dviretal.,(2011),nanolett11:4411-4414；yanetal.,(2014),biomaterials35:1063-1073；changetal.,(2013)jcontrolrelease170:287-94；nguyenetal.,(2015)advmater27:5547-5552)。该些传递系统仍需要增强穿透及保留(epr)功效作为到达靶点的主要路径。数篇报导及研究结果指出，epr功效已不再是包含癌症治疗等药物传递的可靠策略(nicholsetal.,(2014)jcontrolrelease190:451-464)。因此，本揭示内容所述的由单核细胞介导的传递策略代表了一种真正主动形式的药物传递。已有先前报导利用单核细胞介导策略来传递癌症药物。然而，已知的传递载体不是具有会被内皮细胞辨识的功能性表面(qinetal.,(2015),nanomedicine11:391-400)、具有促使循环单核细胞产生更佳吞噬作用的无功能性表面(nagaokaetal.,(2015),plosone10:e0132451；aferganetal.,(2008),jcontrolrelease132:84-90)，就是在进行全身性传送前，需要将传递载体预先与外部来源的单核细胞混合(anselmoetal.,(2015)jcontrolrelease199:29-36)。相较之下，本揭示内容所述的plp是生物模拟梗塞后血小板与循环单核细胞的生理作用来设计。plp上的pmp可使传递系统附着于会聚集至梗塞心脏的循环单核细胞。同时，蛋白有可能提供对抗内皮细胞的物理阻碍，用来预防任何非预期性的血栓。此外，已知在暴露4小时后，plp会聚集在单核细胞的表面，而不是被细胞吞噬。该特性极为关键，原因在于早期的吞噬作用会提早释放包覆的药物，引发非预期的结果。本研究所揭示的由plp媒介的药物传递系统是利用pmp的纯溶液，而非整个包含血小板膜磷脂的血小板膜，其中已知该血小板膜磷脂会促进血小板凝集于血管受伤位置(davietal.,(2007),nengljmed357:2482-2494)。由于本发明旨在最大化让plp附着于单核细胞表面的机率，膜磷脂可能会促使非预期性地凝集于内皮细胞上以及plp之间。此外，本发明选用脂质体(而非聚合物)作为plp的核心，原因在于已知脂质体可包覆广泛类型的药物，且更易被调控分子所接受(torchilinetal.,(2014)natrevdrugdiscov13:813-827)。另外，若使用全血小板膜，血小板膜磷脂可能会阻碍人类pmp与dopc脂质的成功接合。本揭示内容所述的plp可以不是利用单一类型或经定义的重组蛋白混合物制备而得；相反地，本揭示内容所述的plp可以包含整个人类pmp的纯化混合物。该plp可高度与单核细胞作用，用来增加药物传递的活性。本研究证实仅能于72小时的再灌流的梗塞心脏中检测到plp，而无法于24小时的再灌流的梗塞心脏中检测到plp。该结果为一种非预期性的结果，原因在于已知某些会与单核细胞作用的血小板受体也会与中性粒细胞作用，在人类病患发生梗塞24小时后，中性粒细胞会聚集至心脏梗塞位置(hausenloyetal.,(2015),nengljmed373:1073-1075)。接合过程可能会引发人类pmp产生某些修饰，造成与中性粒细胞的结合亲和力下降。然而，若于72小时的再灌流后施用静脉注射，约有5％的总注射plp会位于心脏，相较之下，约有0.3％的总注射纯脂质体会位于心脏。此外，plp的增加量会与心脏梗塞72小时后检测到的单核细胞增加量相关，该结果显示靶点是经由单核细胞所介导的。该些结果可对应于人类的临床资料，即于梗塞72小时后，单核细胞聚集的量会达到最高，且主要是位于梗塞的区域(vanderlaanetal.,(2014),eurheartj35:376-385)。基于最近的临床研究，可清楚知道再灌流期产生的发炎反应对于缺血时存活下来的心肌细胞的存活具有重大的影响力(hausenloyetal.,(2015),nengljmed373:1073-1075；altamiranoetal.,(2015),jphysiol593:3773-3788)。虽然相关领域已研发数种抗发炎的药物，该些药物至今仍未证实可产生有效的治疗。已知聚集的单核细胞具有双相特性，且许多研发药物皆旨在靶向m1时期的发炎反应。然而，可发现某些抗发炎药物也会影响驻留于心脏的巨噬细胞。与浸润的源自单核细胞的巨噬细胞不同，驻留于心脏的巨噬细胞主要是源自于胚胎前体(embryonicprecursor)，且可更有效地内化(internalizing)碎片及吞噬凋亡的心肌细胞(epelmanetal.,(2014),immunity40:91-104)。研究显示，该些细胞具有重要的止血作用，抑制其发炎反应事实上会延长整个发炎时期，最终造成心脏功能衰退(wanetal.,(2013),circres113:1004-1012)。据此，本研究的plp可能仅会靶向至新聚集的源自单核细胞的巨噬细胞，原因为若于72小时的再灌流后注射纯脂质体对照，则该纯脂质体对照无法聚集于心脏梗塞位置。因此，于72小时的再灌流后注射的plp-copp，可能会在浸润至受损的心肌后，立即被源自单核细胞的巨噬细胞载体所吞噬，而无法游离地与驻留于心脏的巨噬细胞作用。目前尚无探讨copp对驻留于心脏的巨噬细胞的影响的报导，而本研究则显示于施用copp治疗的小鼠与施用plp-copp治疗的小鼠的间，并不会观察到显著的治疗差异。已知驻留于心脏的巨噬细胞的数量会少于聚集的源自单核细胞的巨噬细胞数量(luoetal.,(2014),stemcellstranslmed3:734-744))，copp与plp-copp的间任何的显著差异皆仅能于较长的时间点观察到。然而，本研究清楚地证实于梗塞后72小时静脉注射plp-copp，可减少新聚集的源自单核细胞的巨噬细胞的发炎活性，且不会与驻留于心脏的巨噬细胞作用，进而成为一种成功的治疗策略。已知copp会增加转录因子foxo1的表达，且促进foxo1结合至启动子ho-1，由此增加ho-1的转录活性(liuetal.,(2013),plosone8:e80521)。近期，已于活体外及活体模型中证实预先施用copp可预防源自人类胚胎干细胞的心肌细胞遭受i/r损伤(luoetal.,(2014),stemcellstrnaslmed3:734-744)。检测i/r损伤的小鼠的心脏可发现，相较于施用生理盐水或lipo-copp，施用copp或plp-copp会诱发ho-1的表达。增加由copp所诱发的ho-1的表达量会减低数种促发炎基因的表达。其余文献显示ho-1是一种心脏保护酶，可直接或间接降低数种促发炎细胞激素的表达(sodhietal.,(2015),jcardiolther2:291-301；collinoetal.,(2013),dismodelmech6:1012-1020；wangetal.,(2010),circulation121:1912-1925)。许多研究证实copp于不同动物模型中皆具有治疗i/r损伤的功效，唯目前该药物仍缺乏人类临床的测试功效。考虑原因之一是copp中含有钴，其是一种重金属。早期研究显示，长期全身性注射copp会导致肝毒性(schmidt,(2007),fasebj21:2639)。确实，于针对mi小鼠模型的心脏功能的活体研究指出，在施用copp治疗后，于血清中可观察到显著增加的alt量，其是一种用以检测肝毒性的金标准生物标记物。临床上也会利用ast及tbil来检测肝毒性。然而，不像alt，ast及tbil试验出现差异的频率很高，因此通常仅作为支持alt测量的补充数据(ozeretal.,(2008),toxicology245:194-205)。即使于copp治疗组间未观察到ast及tbil测量具有显著的差异，于未包覆的copp治疗组观察到增加的alt含量仍指出，alt会引发某种程度的肝毒性。更重要的是，于28天后，不论是lipo-copp或plp-copp治疗皆不会显著地增加血清中alt的含量。相似地，未包覆的copp会引发肾脏毒性，且血清中的bun及cre含量也会显著地高于其它治疗组。整体来说，虽然全身性地传递未包覆的copp可改善mi小鼠模型的心脏功能，且不会引发额外的心脏毒性，然而却会观察到肝脏及肾脏毒性。相较之下，plp-copp对心脏可产生相似程度的改善，却不会于肝脏及肾脏引发任何副作用；因此，将大幅改善传递copp的功效。总结上述，本研究的plp仅利用人类pmp的蛋白成分，而不包含膜磷脂。因此，plp不论是在活体外或活体模型中皆对内皮细胞具有低结合亲和性，用来增加与心肌梗塞后聚集的循环单核细胞结合的机会。因此，利用附着于循环单核细胞，plp对梗塞心脏具有较纯脂质体更佳的靶向性。此一特性将减少仰赖epr功效作为达到心脏的主要路径的需求。由于包覆的copp可能会降低聚集的源自单核细胞的巨噬细胞的发炎活性，且不会与驻留于心脏的巨噬细胞作用，因此于72小时的再灌流后施用plp-copp可提供一种优秀的治疗策略，由此降低心脏的发炎(第8图)。此外，静脉注射plp-copp可产生与未包覆的copp相似的心脏改善功效，并减少药物的副作用。其它实施方式可将本说明书中公开的所有技术特征以任何组合进行组合。可使用能产生相同、均等或相似目的的技术特征来取代在该说明书中公开的技术特征。因此，除非另外特别指出，本说明书公开的技术特征仅是一系列均等或类似特点的实施范例。从上述说明书中，本领域技术人员可以容易地确定本发明的主要特点，并且在不悖离其精神和范围的情况下，对本发明作出各种改变和改进以将其适应于各种用途和情况。因此，其它的实施方式也在本发明申请专利的范畴内。均等虽然本说明书已经描述了本发明的多个实施方式，但是本领域技术人员很容易预见到用于实现本说明书所述的功能和/或获得本说明书所述的结果和/或一个或更多个本说明书所述的优点的各种其它手段和/或结构，且所有这样的变化和/或调整均被认为在本发明的范围之内。更一般而言，本领域技术人员很容易认识到本说明书所述的所有参数、尺寸、材料和构型均是示例性的并且实际的参数、尺寸、材料和构型取决于采用本发明教导的具体应用。本本领域技术人员仅利用常规实验即可识别或能够区别本说明书所述的本发明具体实施技术手段的等同技术手段。因此，当可理解，前述实施方式仅为例举并且在所附申请专利范围及其等同技术的技术手段的范围内，本发明可以采取不同于所描述或所要求保护的方式实施。本发明涉及本说明书所述的各个单独的技术特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，只要这样的技术特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则该些技术特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的组合也包含在本发明的范围之内。除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属
技术领域：
：中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。除非有明确的相反指示，否则本说明书及申请专利范围中所述的“一”(one)应理解为“至少一”(atleastone)。在本说明书和申请专利范围中，当可理解“和/或”(and/or)一词是指结合元素中的“任一或二者”(eitherorboth)，也即在某些情况下元素为共同存在，在其它情况下元素则为分开存在。当多个元素与“和/或”(and/or)共同表述时，应以相同的方式进行解释，即结合元素中的“一种或多种”(oneormore)。除了以“和/或”(and/or)子句特定连接的元素外，也可任选地包含其它元素，而不论其与特定连接的该些元素是否有关联性。因此，作为非限制性的例示，当与诸如“包含”(comprising)等开放式语言结合使用时，提及“a和/或b”在一实施例中可能仅仅涉及a(可选地包含不同于b的元素)；在另一实施例中可能仅仅涉及b(可选地包含不同于a的元素)；在另一实施例中可能涉及a及b二者(可选地包含其它元素)等。当在本文的说明书和申请专利范围中使用时，“或”(or)应当被理解为具有与上述定义的“和/或”(and/or)相同的含义。例如，当分开列表中的项目时，“或”(or)或“和/或”(and/or)应当被解释为包含，即包含至少一个，但是也包含若干元素或元素清单中的超过一个元素，以及可任选地附加的未列表项目。除非有相反的明确教示(例如”仅其中之一”(onlyoneof或exactlyoneof))，或者当用在申请专利范围中时，”由……组成”(consistingof))仅涉及包含若干元素或元素清单中的单一个元素。通常，当有诸如”任一”(either)、”其中之一”(oneof)、”仅其中之一”(onlyoneof或exactlyoneof)等排他性词汇置前时，本文中使用的词汇”或”(or)应当仅解释为指示排他性可替换项(即”一或另，而非二者”(oneortheotherbutnotboth))。当在申请专利范围中使用时，”主要是由……组成”(consistingessentiallyof)应当具有其在专利法领域中使用的普通含义。在本说明书和申请专利范围中，当可理解，若以”至少一”(atleastone)连接具有一种或多种元素的清单时是指选自该元素清单的元素中任何一个或多个的至少一个元素，但是不必然包含该元素清单中特定列出的各元素中的至少一个，且不排除该元素清单中元素的任何组合。这个定义也允许可任选地存在与“至少一”(atleastone)词汇所涉及的元素清单内特定标识的元素不同的元素，而不论其是否与特定标识的该些元素具有关联性。因此，作为非限制性例示，“a及b中至少一个”(或者等效地“a或b中至少一个”，或者等效地“a和/或b中至少一个”)在一实施例中可以涉及至少一个a，可任选地包含超过一个a，其中b不存在(并且可任选地包含不同于b的元素)；在另一实施例中涉及至少一个b，可任选地包含超过一个b，其中a不存在(并且可任选地包含不同于a的元素)；在另一实施例中涉及至少一个a，可任选地包含超过一个a，以及至少一个b，可任选地包含超过一个b(并且可任选地包含其它元素)等。当可理解，除非有相反的明确教示，在本文要求保护的包含超过一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于该方法的步骤或动作被记载的顺序。在申请专利范围及上述说明书中，所有过渡词汇(例如“包含”(comprising,including,containing)、“带有”(carrying)、“具有”(having)、“涉及”(involving)、“持有”(holding)、“由……构成”(composedof)等)都应当被理解为开放式的，即表示包含但不限于。如美国专利局专利审查程序手册2111.03节中所述，只有过渡词汇“由……组成”(consistingof)及“主要是由……组成”(consistingessentiallyof)应当分别为封闭式或者半封闭式的过渡词汇。序列表<110>中央研究院p.c.h.谢b.成<120>类血小板蛋白微粒及利用类血小板蛋白微粒传递药物的方法<130>a0988.70067wo00<150>us62/149,849<151>2015-04-20<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gagcagaaccagcctgaact20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tttgaacttggtggggctgt20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tagcccacgtcgtagcaaac20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4accctgagccataatcccct20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gatgcagttaacgccccact20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6acccattccttcttggggtc20<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7tgccaccttttgacagtgatg21<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ttcttgtgaccctgagcgac20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gccttcttgggactgatgct20<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10tggaaattggggtaggaaggac22当前第1页12当前第1页12