本申请要求2015年11月18日提交的美国临时申请No.62/256,823的权益，将其以其整体在此引入作为参考。
背景技术：
神经系统的疾病和损伤，包括先天性疾病、癌症、退行性疾病和脊髓损伤，影响了数百万所有年龄段的人。当在发育过程中不能正确形成大脑或脊髓时，就会出现先天性疾病。神经系统的癌症是由异常细胞的不受控制的扩散引起的。当神经系统中神经细胞不能正常工作时会发生退行性疾病。有证据表明，损伤可以通过用可以成熟为神经细胞的细胞衍生的新细胞(称为神经干细胞)代替丢失的细胞来逆转。然而，移植的干细胞可以并经常从植入部位迁移并经历导致畸胎瘤形成的一些细胞转化。另外，由于它们的大小，干细胞通常被直接注射到CNS中，这可引起并发症。侵入性CNS手术会使患者因分娩过程中和分娩后发生的并发症(包括但不限于出血和水肿)而面临风险。全身性施用的干细胞通常最终滞留在小毛细血管中，这可在肺中引起不希望的影响，甚至不会到达疾病或损伤。干细胞疗法也可引发不良免疫反应。
技术实现要素：
本发明公开了神经细胞外囊泡(neural extracellular vesicle，EV)和使用这些EV在治疗脊髓损伤、中风、外伤性脑损伤和神经退行性疾病中的方法。
在一些实施方案中所公开的EV可通过以下获得：将从多能干细胞(例如人胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC))产生的神经祖(NP)细胞在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以使NP细胞产生EV，且将所述EV从培养基分离。在一些实施方案中，所述NP细胞为SOX 1+、SOX 2+、OCT4-和NESTIN+。
在一些实施方案中所公开的EV可通过以下获得：将直接或间接从多能干细胞(PSC)(例如ESC或iPSC)衍生的神经细胞在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以产生EV，且将所述EV从培养基分离。在一些实施方案中，所述PSC-衍生的神经细胞包括神经胶质细胞，如星形细胞或少突胶质细胞。在一些实施方案中，所述PSC-衍生的神经细胞包括神经元。在一些实施方案中，所述PSC-衍生的神经细胞从衍生自hES细胞的NP细胞分化。在一些实施方案中，所述PSC-衍生的神经细胞直接从PSC分化。
还公开了通过以下获得的EV，其通过将任何来源的星形细胞在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以使星形细胞产生EV，且将所述EV从培养基分离。
在一些实施方案中，所公开的EV也可通过以下获得：将从PSC产生的间充质干细胞(MSC)在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以使MSC细胞产生EV，且将所述EV从培养基分离。
如本发明所公开，由hNP细胞(在此也称为NPEX)产生的EV具有1653种未在来自干细胞-衍生的星形细胞(在此也称为APEX)或间充质干细胞(在此也称为MSCEX)的EV中识别的蛋白质(参见表9)。因此，在一些实施方案中，所述EV包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600或更多种表9中列出的蛋白生物标记物。
如本发明所公开，由APEX产生的EV具有596种未在NPEX或MSCEX中识别的蛋白质(参见表8)。因此，在一些实施方案中，所述EV包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多种表8中列出的蛋白生物标记物。
如本发明所公开，MSCEX产生的EV具有536种未在APEX或MSCEX中识别的蛋白质(参见表7)。因此，在一些实施方案中，所述EV包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或更多种表7中列出的蛋白生物标记物。
在一些实施方案中，所公开的EV从基本上均匀的细胞群产生。在一些实施方案中，所公开的EV从未转化的细胞产生。
还公开了包含所公开的EV的组合物。在一些实施方案中，所述组合物在生物相容的支架，如水凝胶中包含所公开的EV。合适的水凝胶包括：在体温固化或凝固的温度依赖性水凝胶，例如，PLURONICSTM；通过离子交联的水凝胶，例如，藻酸钠；通过暴露于可见光或紫外线而凝固的水凝胶，例如，具有丙烯酸酯末端基团的聚乙二醇聚乳酸共聚物；和在改变pH时凝固或固化的水凝胶，例如，TETRONICSTM。水凝胶可包括，例如，以下任一种：多糖、蛋白质、聚磷腈、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、乙二胺的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)、和磺化聚合物。
在一些实施方案中，所述包含所公开的EV的组合物进一步包含一种或多种神经营养剂。该组合物可进一步包含一种或多种选自以下的试剂：白血病抑制因子(LIF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CTNF)、表皮生长因子受体(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-6、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CTNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、肝细胞生长因子(HGF)、IFN-γ、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-1ra、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、单核吞噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经营养因子(NT3)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)、TIMP-2、肿瘤坏死因子(TNF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-D、尿激酶纤溶酶原活化剂受体(uPAR)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、IL1-a、IL-3、来普汀、干细胞因子(SCF)、基质细胞-衍生的因子-1(SDF-1)、血小板衍生的生长因子-BB(PDGFBB)、转化生长因子β(TGFβ-1)和TGFβ-3。
在一些实施方案中，所述包含所公开的EV的组合物进一步包含蛋白酶抑制剂、RNA酶抑制剂或其组合。
还公开了治疗患有脊髓损伤、中风、外伤性脑损伤或神经退行性疾病的受试者的方法，包括向受试者给药有效量的包含本发明公开的神经EV的组合物。在一些实施方案中，所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、帕金森相关的障碍、亨廷顿病、朊病毒病、运动神经元疾病(MND)、脊髓小脑共济失调(SCA)或脊髓性肌萎缩(SMA)。
在所公开的EV的内容中代表的蛋白质家族中有几种在与年龄有关的疾病的背景下是有益的。这些包括催化活性酶如金属蛋白酶、几种钙介导的信号传导蛋白和其他离子通道。存在几种DNA和RNA聚合酶亚单位以及泛素连接酶和蛋白酶体亚单位。因此，还公开了治疗患有蛋白质稳态紊乱(protein homeostasis disorder)或蛋白质病的受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的含有本发明公开的神经EV的组合物。
还公开了含有神经EV的组合物在制备用于治疗具有脊髓损伤、患有中风或外伤性脑损伤、或患有神经退行性疾病的患者或受试者的药物中的用途。
在附图和下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。从说明书和附图以及权利要求中，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。
附图说明
图1显示了可以从中获得细胞外囊泡(EV)(例如外泌体)的细胞的潜在来源。
图2是超微结构分析，表明含有EV的多泡体(MVB)在神经祖细胞(NP)中很常见。传统上描述为“含有较小的球形和椭圆形囊泡以及被描述为细丝、颗粒、不规则稠密团块和膜组分的其他包含物的囊泡”在NP的界膜附近是明显的。也如所报道的，囊泡经常以3个或更多囊泡的簇被发现(图A、B)。图B的插图显示在图C中，并且该MVB实际上具有向内进入较大多泡体的囊泡萌芽，支持了这些囊泡在从质膜回收蛋白质中的作用。这些囊泡确实与质膜结合，将EV释放到细胞外空间(图D、E)。先前的报道表明囊泡可以聚结，并且这在NP中很常见，并且在具有MVB簇的大多数细胞中可见(图A、F、G)。图H是来自NP的纯化EV的透射电子显微镜(TEM)图像。
图3A至3D显示EV可以通过纳米颗粒跟踪分析来纯化和检测。图3A显示了通过SDS-PAGE分离的源自外泌体的蛋白和用考马斯染料染色的凝胶。来自EV的蛋白质谱与细胞沉淀重叠，但不相同，证明负载被专门运输到EV。图3B显示，当通过BCA测定法比较时，蛋白质含量显示当细胞暴露于严苛条件下(例如营养剥夺)时，分布图中的蛋白质的量变化。图3C和3D显示了来自神经祖细胞(图3C)和星形细胞(图3D)的纯化EV的NanoSight分析。这些EV显示重叠但具有不同的尺寸轮廓，且两种类型的细胞都产生指示55nm囊泡的峰值，并且范围为25-250nm。
图4显示分化的神经细胞将来自神经祖细胞的DiI标记的EV内化。在最终EV旋转和PBS洗涤之前，通过向细胞上清液中加入10μM DiI达30分钟，可以标记EV。当加入到用于分化细胞的培养基中时，在5分钟内EV的吸收明显。
图5A和5B显示来自神经祖细胞的EV保护更多分化的神经细胞免于饥饿应激。图5A显示了通过从神经祖细胞(NP)、星形细胞或人脐带MSC超滤而收获的EV。通过BCA测量蛋白质含量，并将EV连续稀释并在等体积磷酸盐缓冲血清(PBS)中转移到含有NeuroNet细胞的孔中(6-8周分化)。当细胞被固定时，使细胞经历饥饿应激10天，并对β-III微管蛋白(Tuj)进行染色。使用Cellomics Arrayscan对每个孔的中心20个视野进行成像(所示的来自4个技术代表的代表性图像)。图5B显示NP和星形细胞EV保护细胞免受饥饿应激，并大部分保持了单层完整性和延伸。尽管MSC处理的孔中存在更多的细胞和碎片，但细胞大部分已经失去了它们的神经形态。在仅接受PBS的孔中仍可检测到少量细胞。NP和星形细胞EV样品具有较高的蛋白质浓度，所以用50μg蛋白质/孔处理。MSC样品中的蛋白质是有限的，因此6.25是可能的最高浓度，但仍然以浓度依赖性方式杀死细胞，所以较高剂量(50、25或12.5μg/孔)不可能产生不同的结果。
图6A至6C显示在注射1小时内可在中风组织附近发现铟-111标记的EV。图6A至6C显示与游离铟(图6A)相比，铟-111标记的EV(图6B，6C)的生物分布，其指示当在中风后立即注射(图6B圈，左图)或中风发生后24小时注射(图6C，圈，左图)时，在注射后1小时内在脑中在靠近中风组织处存在EV。不管初始注射的时间如何，在注射后24小时，EV被大部分从该区域清除(图6B，6C；圈，右图)，尽管仍然可以检测到更小量的放射性，这可表明EV被周围组织代谢。
图7显示了DiR标记的EV在仔猪脑中的生物分布。通过立体定位注射(上图)直接递送到脑实质内，并且进入蛛网膜下腔内的CSF(下图)，可以从背侧和腹侧检测到DiR标记的EV(约2.7x 1010个囊泡/kg)。在两种情况下，在脑的背侧和腹侧都可检测到荧光，但在IP注射时在背侧区域(上图)和在CSF注射后在脑的腹侧区域(下图)更明显。
图8A至8E显示使用源自神经细胞的EV的治疗改善了小鼠栓塞性中风模型中的梗塞面积和功能结果。将APEX、MSCEX、PBS和NPEX等分试样提供给不知情的研究者，用于在诱发栓塞性中风后注射入小鼠(在中风后2、14和28小时，3次重复剂量为约2.7x 1011个囊泡/kg)。在中风后96小时收集的脑的TTC染色显示在NPEX或APEX治疗后显著减少的梗塞面积，而MSCEX无效(图8A，8C)。在研究过程中，NPEX和APEX也降低了死亡率，其中超过40％的对照和MSCEX治疗的小鼠在研究过程中死于并发症，而对于APEX和NPEX治疗的动物，损失了大约25-30％(图8B)。在APEX和NPEX治疗的动物中也观察到包括通过胶带测试检测到的改善的感觉能力的表型益处(图8E)以及通过神经功能缺损评分总结的更少的神经缺陷(图8D)。
图9A至9C显示来自神经细胞的EV调节中风后的免疫应答。中风后96小时的血样流式细胞术表明APEX和NPEX相对于MSCEX和对照(载体)治疗组增加了调节性T细胞(图9A)，减少了炎症性T辅助细胞(图9B)，并增加了循环中的抗炎性M2巨噬细胞(图9C)。
图10A至10C显示了通过MRI测量的NPEX治疗导致中风后28±4小时内减少的梗塞体积。经历中风的动物在中风后2、14和24小时接受NPEX(大约2.7x 1010个囊泡/kg)或PBS(载体)。麻醉时，动物也进行了MRI分析。与接受PBS的动物相比，NPEX治疗的动物具有显著减少的梗塞体积(图A-C)。当评估同侧和对侧之间的尺寸差异时，NPEX组中的半球差异较小，表明与对照相比水肿和肿胀较少。
图11显示NPEX治疗改善了中风后12周的分子缺陷。T2和T2flair图像均显示在中风后12周NPEX治疗的猪中检测到的损伤较少。组织的缺失(死亡)在12周的时间点显著降低，并且在治疗的动物中与主体组织密度不一致的区域十分不明显。
图12是维恩图，显示了NPEX、APEX和MSCEX EV所独有以及共有的蛋白质数量。
发明详述
定义
根据本发明，可使用本领域技术内的常规细胞培养方法、化学合成方法和其它生物和药物技术。这些技术是众所周知的且在文献中另有完全解释。
当提供一个范围的值时，应当理解为该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一(除非本发明另有清楚地说明，如在包含多个碳原子的基团的情况，在该情况提供了落在该范围内的各碳原子数)，以及该指定范围内的任何其他指定值或中间值都包含在本发明内。可以独立地包括在较小范围内的这些较小范围的上限和下限也包含在本发明内，其受指定范围内任何明确排除的限制。当指定范围包括极限值之一或者两者时，除去包括极限值的两者中任一的范围也包含在本发明内。
除非另有说明，本发明所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本发明描述的那些相似或等同的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。
应注意到，如本发明和所附权利要求中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数，除非本发明另有清楚地说明。
此外，以下术语应具有下列定义。可以理解的是，如果下面没有定义具体的术语，则该术语具有在本领域普通技术人员的背景中在其典型使用范围内的含义。
术语“受试者”是指作为施用或治疗目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人或兽患者。术语“患者”是指在临床医生(例如医生)治疗下的受试者。
术语“治疗有效”是指所用组合物的量足以改善疾病或病症的一种或多种原因或症状。这种改善只需要减少或改变，而不一定是消除。
术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或与合理的利益/风险比相称的其他问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
在本发明中所用的术语“治疗(treat、treating、treatment)”等，是指向具有患病风险或被疾病状态、病症或缺陷所影响的患者提供益处的任何行为，所述疾病状态、病症或缺陷可通过使用本发明所述细胞组合物而改善。治疗病症包括通过减轻或抑制至少一种症状、延缓疾病状态或病症影响的进展，包括预防或延缓疾病状态或病症的发病等来改善病症。在本申请中，治疗可涉及减轻脊髓损伤或中风的影响，包括逆转和/或抑制这种损伤的效果，逆转、改善、抑制和/或稳定神经退行性疾病，使得疾病改善和/或不进展或恶化。术语“预防”用于描述“降低发生特定结果(通常为疾病状态和/或病症的进展和/或恶化)的可能性”的方法。
生长细胞、分离细胞、和相关的克隆、DNA分离、扩增和纯化、涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶反应的标准技术，以及多种分离技术是本领域技术人员熟知且经常使用的。多种标准技术描述于Sambrook等人,1989Molecular Cloning,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,New York；Maniatis等人,1982Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,New York；Wu(Ed.)1993Meth.Enzymol.218,Part I；Wu(Ed.)1979Meth.Enzymol.68；Wu等人,(Eds.)1983Meth.Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(Eds.)1980Meth.Enzymol.65；Miller(Ed.)1972Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York；Old和Primrose,1981Principles of Gene Manipulation,University of California Press,Berkeley；Schleif和Wensink,1982Practical Methods in Molecular Biology；Glover(Ed.)1985DNA Cloning Vol.I和II,IRL Press,Oxford,UK；Hames和Higgins(Eds.)1985Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,UK；和Setlow和Hollaender 1979Genetic Engineering:Principles and Methods,Vols.1-4,Plenum Press,New York。文中所使用的缩写和命名被认为是在领域内标准的且在本发明所引用的专业期刊中被广泛使用。
术语“人多能干细胞”，其中“人类胚胎干细胞”(hESC)和人诱导的多能干细胞(hiPSC)是其子集，其源于受精之后任意时间的前胚胎(pre-embryonic)、胚胎、胎儿组织或成人干细胞(在人诱导多能干细胞情况中)，且具有能够在适当条件下产生几种不同细胞类型的后代的特征，尤其包括神经元干细胞和祖细胞、神经嵴细胞、间充质干细胞(MSC)和相关的增殖和非增殖性神经细胞。这个术语包括多种类型的已确立的干细胞系和以所述的方法从多能性的原生组织中得到的细胞。
术语“胚胎干细胞”是指多能细胞，优选灵长类的，包括人，该细胞从囊胚阶段胚胎中分离出来。
术语“神经祖细胞”是指能够分裂有限次数，且有能力分化成神经元和胶质细胞类型的细胞。
术语“细胞外囊泡”和“EV”在本发明中使用是指约10nm至10μm尺寸的囊泡，其由液体、大分子、溶质和源自脂质双层或胶束包含的细胞的代谢产物组成。在一些情况下，所述EV为细胞-衍生的EV。术语“EV”还包括工程化为包含细胞-衍生的EV(如神经EV)中发现的生物活性分子的脂质囊泡。这些术语包括外泌体和核外粒体。外泌体通过胞外分泌多泡体(MVB)而释放。核外粒体为在质膜上组装和从其释放的囊泡。在一些情况下，所述EV的尺寸为约20nm至10μm，20nm至1μm，20nm-500nm，30nm-100nm，30nm-160nm，或80-160nm。在一些实施方案中，所述EV为约20至150nm尺寸的外泌体。
术语“自体EV”用于描述一类EV，其从将给予EV的受试者或患者的细胞获得。
术语“神经EV”用于意指细胞-衍生的EV，其从多能干细胞体外衍生的神经祖细胞产生，或从所述神经祖细胞体外衍生的神经细胞产生，或从多能干细胞产生。该术语还指工程化以包含足够数量的细胞-衍生的神经EV中发现的生物活性分子以具有基本上相同的生物活性的囊泡。
组合物
本发明公开了神经EV(例如外泌体)和使用这些EV治疗脊髓损伤、中风、外伤性脑损伤和神经退行性疾病的方法。
在一些实施方案中所公开的EV可通过以下获得：将从多能干细胞(例如人胚胎干细胞(hESC)或诱导的多能干细胞(iPSC))体外产生的神经祖(NP)细胞或间充质干细胞(MSCs)在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以使NP细胞或MSC产生EV。
从人胚胎干细胞(ESCs)制备人神经祖(hNP)细胞的方法描述于，例如，美国专利号7,531,354，其以其整体在此引入作为参考以用于教导这些细胞。人神经祖细胞(hNPs)已知可表达与最早的多能神经干细胞相关的标记物，包括Nestin、Musashi-1、Sox1、Sox2和Sox3。注意到虽然饲养细胞游离神经祖细胞可用于产生EV，但也可以使用本发明另外描述的任何神经祖细胞。优选的神经祖细胞是根据美国专利号7,531,354中提出的方法生产的，是无贴壁饲养细胞并且无拟胚体。
在一些实施方案中所公开的EV可通过以下获得：将直接或间接衍生自多能干细胞的分化的神经细胞，如星形细胞，在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以产生EV，且将所述EV从培养基分离。在一些实施方案中，所述分化神经细胞为hN2TM神经元细胞(ArunA Biomedical)、NeuroNetTM神经元或AstroProTM星形细胞(ArunA Biomedical Inc)。
用于制备产生EV的NP细胞、神经细胞或MSC的多能干细胞包括人胚胎干细胞(hESCs)和人诱导的多能干细胞(hiPSCs)。
多能干细胞可表达一种或多种阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可利用针对Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测到的标记物(Thomson等人，Science 282:1145，1998)。多能干细胞在体外分化导致SSEA-4，Tra-1-60，和Tra-1-81表达(如果有)的缺失和SSEA-1表达的增加。未分化多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，通过用4％的多聚甲醛固定细胞，接着用载体红(Vector Red)做底物使其按照制造商(Vector Laboratories，Burlingame Calif.)所述进行显色，能够将其检测出来。如RT-PCR所检测的，未分化的多能干细胞通常也表达Oct-4和TERT。
可以使用的多能干细胞的类型包括已建立的从妊娠后形成的组织中衍生的多能干细胞系，所述组织包括在妊娠期间的任意时间获取的胚胎前组织(例如囊胚)、胚胎组织或胎儿组织，典型地(但不必需)是在怀孕的前10-12周。非限制性实例是已建立的人胚胎干细胞或人胚胎生殖细胞的伦理细胞系，例如人胚胎干细胞系WA01、WA07和WA099(WiCell)。也预期在所述细胞的初始建立或稳定化的过程中使用本发明公开的内容，此种情况下，来源细胞可以是直接从来源组织中获取的灵长类多能细胞。从已经在不存在饲养细胞的条件下培养的多能干细胞群中获取的细胞也是合适的。突变的人胚胎干细胞系例如BG01v(BresaGen、Athens、Ga.)，以及正常人胚胎干细胞系例如WA01、WA07、WA09(WiCell)和BG01、BG02(BresaGen、Athens、Ga.)也是合适的。
人胚胎干细胞(hESCs)可通过现有技术中描述的方法制备，例如，Thomson等人(美国专利5,843,780；Science 282:1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff.，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:7844，1995)所述的方法。或者，它们商购获得。
外胚层干细胞(EpiScs)和诱导的多能干细胞(iPSCs)从早期的植入后期胚胎(early post-implantation stage embryos)中分离。它们表达Oct4，并且是多能的。通过四种基因(c-myc，Klf4，S10X2，Oct4)的逆转录病毒转导，iPSCs由成年体细胞去分化回到多能状态。
如美国专利申请文件第20140356382号中所述，“可以通过任何合适的方法从培养基和/或细胞组织收集细胞产生的外泌体。通常可以通过离心、过滤或这些方法的组合从细胞培养物或组织上清液制备EV制剂。例如，可以通过差速离心制备EV，即低速(<2,0000g)离心以沉淀较大的颗粒，随后进行高速(>100,000g)离心以沉淀EV，用合适的过滤器(例如，0.22μm过滤器)、梯度超速离心(例如，具有蔗糖梯度)或这些方法的组合进行尺寸过滤”。应注意的是，EV的内含物，即已经去除或排除脂质双层的EV，也可用于设计人造EV。
此外，如美国专利申请文件No.20140356382中所述，外源蛋白质和/或肽和其他物质可以通过包括电穿孔或使用转染试剂在内的多种不同技术引入到EV中。电穿孔条件可能因生物治疗剂物质的装载量和尺寸而异。典型的电压在20V/cm到1,000V/cm的范围内，例如20V/cm到100V/cm，电容通常在25μF和250μF之间，例如在25μF和125μF之间。对于用抗体装载EV来说，150mV至250mV范围内的电压，特别是200mV的电压是优选的。或者，可以使用转染试剂将EV装载外源蛋白质和/或肽。尽管EV的尺寸很小，但常规的转染剂可用于转染带有蛋白质和/或肽的EV。EV也可以通过用表达感兴趣的治疗性蛋白质或肽的核酸构建体转化或转染宿主细胞来装载，使得治疗性蛋白质或肽在EV从细胞产生时被吸收至EV中。
在说明性实施方案中，将本发明公开的产生EV的NP细胞和/或神经细胞培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或长达约1、2、3、4、5、6、7、8周或约1、2、3、4、5或6个月，这取决于细胞及其产生EV的能力。产生EV的细胞可以在合适的培养基中培养并且在本领域普通技术人员容易确定的条件下生长。细胞培养条件可以随细胞类型而变化，并且在下文中提供的实施例说明合适的培养基和条件。例如，可以使用带有胎牛血清(例如10％)并任选地补充有谷氨酰胺或含谷氨酰胺的混合物和抗生素的CMRL 1066培养基(来自Invitrogen)。在一些实施方案中，细胞可以在表面(饲养细胞)上生长，例如，它们可以在表面上生长为单层(不含饲养细胞)并且可以生长至30、40、50、60、70、80、90、95或100％融合。
细胞生长培养基是本领域众所周知的并且至少包括极限必需培养基加上一种或多种任选组分，如生长因子、抗坏血酸、葡萄糖、非必需氨基酸、盐(包括痕量元素)、谷氨酰胺、胰岛素(如果指出并且不排除)、激活素A、转铁蛋白、β巯基乙醇及其它在本领域中众所周知的并且如本发明另外描述的试剂。优选的培养基是支持神经细胞的低蛋白质、无血清的生长培养基。所使用的生长因子可以是成纤维细胞生长因子2(FGF2)，单独或优选与白血病抑制因子(LIF)组合。取决于在生长培养基中生长的NP或神经细胞，包含LIF是优选的，但可能不需要。另外的培养基包括可含有血清的基底细胞培养基，例如约0.1％至20％(优选约2-10％)胎牛血清，或对于确定的培养基，不存在胎牛血清和KSR，以及任选地包括牛血清白蛋白(约1-5％，优选约2％)。优选的培养基被限定并且是无血清和低蛋白质的。生长培养基的组分取决于待生长的神经细胞的类型，所有这些在本领域中都是已知的。特别优选的培养基是来自ArunA的培养基和补充剂。AB2TM神经细胞培养基试剂盒包含AB2TM基础神经培养基和ANSTM神经培养基补充剂。培养基和补充剂专门设计用于多功能性以满足所有神经细胞培养需求。AB2TM基础神经培养基和ANSTM神经培养基补充剂可用作特定培养基的基础，以指导hNP1TM细胞系向各种神经表型的分化。通过测试细胞生长、无菌性、pH值、渗透性和内毒素，每批培养基和补充剂均预获使用资格。
来自ArunA的配方允许神经培养物在多次传代中保持稳定的核型，而不需要饲养细胞，使其成为包括早期药物发现在内的各种研究应用的极佳选择。
视培养基中生长的细胞类型而定，任选地可加入培养基中的其他试剂包括例如以下的任一种或多种：烟酰胺、TGF-β家族成员(包括TGF-β1、2和3)、激活素A、诺达尔(nodal)、骨形态发生蛋白(BMP 2至7)血清白蛋白、成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员、血小板衍生生长因子-AA、和血小板衍生生长因子-BB、富含血小板的血浆、胰岛素生长因子(IGF-Ⅰ、Ⅱ、LR-IGF)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、-11)、胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-Ⅰ和GLP-2模拟体(mimetobody)、艾塞那肽-4(Exendin-4)、甲状旁腺素(parathyroid hormone)、胰岛素、黄体酮、抑肽酶、氢化可的松、乙醇胺、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂例如三乙烯五胺、毛喉素(forskolin)、丁酸钠、乙胞素(betacellulin)、ITS、头蛋白、神经突起生长因子、诺达尔(nodal)、丙戊酸(valporic acid)、曲古菌素A(trichostatin A)、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD、CA)、N2和B27补充剂(Gibco、CA)、甾醇生物碱如环巴明(cyclopamine)(EMD、CA)、角质细胞生长因子(KGF)、迪考普夫(Dickkopf)蛋白家族、牛垂体提取物、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印度刺猬蛋白(Indian hedgehog)、音刺猬蛋白(sonic hedgehog)、蛋白酶抑制剂、诺驰(Notch)通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂(sonic hedgehog inhibitors)、杂合素(heregulin)、或它们的组合，或多种其它组分。每个组分若包含时，以有效量包含。
作为进一步的实例，合适的培养基可由以下组分制备，例如，达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、Gibco#11965-092；敲除达尔伯克改良伊格尔培养基(KO DMEM)、Gibco#10829-018；Ham's F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺、Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液、Gibco 11140-050；β-巯基乙醇、Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。
细胞培养基可商业获得并且可以补充市售组分，包括限定的不含xeno的成分，例如可从Invitrogen Corp.(GIBCO)，Cell Applications，Inc.，Biological Industries，Beth HaEmek，Israel和Calbiochem获得的那些。本领域普通技术人员将能够根据本发明容易地修饰细胞培养基以产生任何一种或多种靶细胞。
所公开的产生EV的细胞可以以各种方式在支持细胞的饲养细胞层上培养。在饲养细胞层上培养细胞的方法在本领域中是众所周知的。细胞可以在细胞支持物或基质上生长，作为贴壁单层，而不是作为拟胚体或在悬浮液中。在某些实施方案中，取决于用于制造EV的细胞，可能优选使用细胞支持物。当使用时，细胞支持物优选包含至少一种底物蛋白质。底物蛋白质包括例如细胞外基质蛋白质，其是细胞外基质中发现的蛋白质，例如层粘连蛋白、生腱蛋白、血小板反应蛋白及其混合物，其表现出生长促进并含有与表皮生长因子(EGF)同源的结构域，并展现生长促进活性。可以使用的其他底物蛋白包括例如胶原、纤连蛋白、vibronectin、聚赖氨酸、聚鸟氨酸及其混合物。另外，也可以使用凝胶和其他材料，例如含有有效浓度的一种或多种这些胚胎干细胞分化蛋白的其他凝胶的甲基纤维素。包含这些分化蛋白的示例性分化蛋白或材料包括例如层粘连蛋白，BD Cell-TakTM Cell和Tissue Adhesive、BDTM FIBROGEN Human Recombinant Collagen I、BDTM FIBROGEN Human Recombinant Collagen III、BD MatrigelTM Basement Membrane Matrix、BD MatrigelTMBasement Membrane Matrix High Concentration(HC)、BDTM PuraMatrixTM Peptide Hydrogel、Collagen I、Collagen I High Concentration(HC)、Collagen II(Bovine)、Collagen III、Collagen IV、Collagen V和Collagen VI，等等。
或者，这些细胞可以在基本上不含饲养细胞的培养系统中培养，但仍然支持细胞增殖以产生EV。使用先前培养另一种细胞类型调整的培养基可以支持无饲养层培养中细胞的生长。或者，可以使用化学成分确定的培养基来支持无饲养层培养的生产EV的细胞的生长而不分化。这些方法在本领域中是众所周知的。在本发明的某些实施方案中，细胞在无饲养细胞的培养基中生长。
EV可以以不同的时间间隔(例如约2、4、6、8或3、6、9、12天或更长的时间间隔，取决于EV的生产速率)被收获。EV的示例性产量范围可为，在约24小时至7天的增殖和非增殖性神经细胞的培养时间段中至少约1ng EV/1百万个细胞、至少约10ng EV/1百万个细胞、至少约50ng EV/1百万个细胞、至少约100ng EV/1百万个细胞、至少约500ng EV/1百万个细胞、至少约750ng EV/1百万个细胞、至少约800ng EV/1百万个细胞、至少约900ng EV/1百万个细胞、至少约1.0μg EV/1百万个细胞、至少约1.5μg EV/1百万个细胞、至少约2.0μg EV/1百万个细胞、至少约2.5μg EV/1百万个细胞、至少例如约3.0μg EV/1百万个细胞、至少约5.0μg EV/1百万个细胞和至少约10.0μg EV/1百万个细胞，如本发明另外所述。
在某些实施方案中，通过超速离心或差速离心或其任何组合收集和收获EV，收集沉淀的EV，并且任选地收集的沉淀的EV用合适的介质洗涤。例如，可以通过离心、过滤或这些方法的组合从细胞培养物或组织上清液制备EV的制剂。在一些实施方案中，EV可以通过差速离心制备，即低速(<2,0000g)离心以沉淀较大的颗粒，接着高速(>100,000g)离心以沉淀EV，用适当的过滤器(例如0.22μm过滤器)、梯度超速离心(例如，具有蔗糖梯度)或这些方法的组合进行尺寸过滤。EV可通过差速离心、微量过滤和超滤、聚合沉淀、微流体分离、免疫捕获和尺寸排阻色谱法来纯化。分离和纯化EV的这些和/或相关的方法描述于Théry,et al.,Current Protocols in Cell Biology,(2006)3.221-3.22.29,copyright 2006by John Wiley&Sons,Inc.；Sokolova,et al.,Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2011,87,146-150；Wiklander,et al.,Journal of Extracellular Vesicles,2015,4,26316,pp.1-13；和et al.,Journal of Extracellular Vesicles,2014,3,23430,pp.1-11。可以开发其他分离方法，例如电场射频和声学。
药物组合物
公开了包含治疗有效量的一种或多种所公开的EV和药物可接受的载体的药物组合物。包含所公开的EV的制剂的形式可为液体，固体，半固体或冻干粉末形式，例如，溶液、悬浮液、乳剂、缓释制剂、片剂、胶囊、粉末、栓剂、乳膏、软膏、洗剂、气雾剂、贴片等，优选以适合简单给药精确剂量的单位剂型。
药物组合物通常包含常规药物载体和/或赋形剂其可另外包含其它药剂、载体、佐剂、添加剂等。EV与一种或多种赋形剂的重量百分比范围可为约20:1至约1:60、或约15:1至约1:45、或约10:1至约1:40、或约9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1至约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、或1:35、且优选为约20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1或5:1。在一些实施方案中，所公开的组合物包含约1μg至约1g或更多的总EV、约500μg约500mg、约1mg至约500mg的总EV、约5至约500mg、约10至约500mg、约25至约500mg、约50mg至约350mg、约75mg至约450mg、约50mg至约450mg、或约75mg至约325mg或约100mg至约650mg的总EV且可任选包含一种或多种合适的药物载体、添加剂和/或赋形剂。
用于肠胃外给药(例如静脉内，肌肉内，鞘内脑脊液内或鼻内)的可注射组合物通常将在合适的静脉内溶液，如无菌生理盐水溶液中含有EV和任选的其它组分。该组合物也可以配制成在水乳液中的悬浮液。
液体组合物可通过将包含EV和任选的药物佐剂的药物组合物溶解或分散于载体例如盐水、葡萄糖水溶液、甘油或乙醇中以形成溶液或悬浮液来制备。为了用于口服液体制剂中，可将组合物制成溶液、悬浮液、乳液或糖浆，以液体形式或适合在水或生理盐水中水合的干燥形式提供。在鼻内、气管内或肺内施用的情况下，组合物可以作为液体组合物提供，其可以喷雾到鼻子、气管和/或肺中。
对于口服给药，这些赋形剂包括药品级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。如果需要的话，该组合物也可包含少量的无毒的辅助物质如湿润剂、乳化剂或缓冲液。
当组合物以固体制剂形式用于口服给药时，制剂可以是片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂等。在片剂制剂中，组合物通常与添加剂一起配制，例如，诸如糖或纤维素制剂的赋形剂，诸如淀粉糊或甲基纤维素的粘合剂，填充剂，崩解剂和通常用于制备药物制剂的其他添加剂。
制备这种剂型的方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的；例如，参见Remington's Pharmaceutical Sciences(第17版，Mack Pub.Co.1985)。待施用的组合物将包含一定量的药物有效量的选择的化合物用于在包括根据本发明的患者或受试者的生物系统中用于治疗用途。
静脉内制剂可以包含本发明所述的EV、等渗介质和防止EV聚集的一种或多种物质。示例的静脉内/鞘内/脑脊液内制剂可以含有盐水溶液(例如生理盐水(NS)；约0.91％w/v NaCl，约300mOsm/L)和/或0.18％盐水中的右旋糖4％，以及任选1％、2％或3％人血清白蛋白。此外，EV可能被破坏以获得根据本发明的组合物中使用的内容物和内含物。
在示例性实施方案中，本发明的制剂可包含约约50ng EVs/ml静脉内/鞘内/脑脊液内介质，包括约100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1.0μg、1.5μg、2.0μg、2.5μg、3.0μg、5.0μg、10.0、15.0μg、20.0μg、100μg或更多EV/ml的用于治疗脊髓损伤、中风、外伤性脑损伤和/或神经退行性疾病的静脉内/鞘内/脑脊液内介质。
在一些实施方案中，静脉内制剂可包含约0.1μg EVs/ml介质、约0.2μg EVs/ml静脉内介质、约0.3μg EVs/ml静脉内介质、约0.4μg EVs/ml静脉内介质、约0.5μg EVs/ml静脉内介质、约0.6μg EVs/ml静脉内介质、约0.7μg EVs/ml静脉内介质、约0.8μg EVs/ml静脉内介质、约0.9μg EVs/ml静脉内介质、约1.0μg EVs/ml静脉内介质、约1.5μg EVs/ml静脉内介质、约2.0μg EVs/ml静脉内介质、约2.5μg EVs/ml静脉内介质、如至少例如约3.0μg EVs/ml静脉内介质、如例如至少约5.0μg EVs/ml静脉内介质、约10.0μg EVs/ml静脉内介质、15.0μg EVs/ml静脉内介质或约20.0μg或更多EVs/ml静脉内介质。
在一些实施方案中，所述药物组合物为以下剂型，其包含至少25mg EV、至少50mg EV、至少60mg EV、至少75mg EV、至少100mg EV、至少150mg EV、至少200mg EV、至少250mg EV、至少300mg EV、约350mg EV、约400mg EV、约500mg EV、约750mg EV、约1g(1,000mg)或更多EV，单独或与治疗有效量的至少一种其它生物活性剂组合，该其它生物活性剂可用于治疗脊髓损伤、中风、外伤性脑损伤和/或神经退行性疾病。在一些实施方案中，所述药物组合物包含约10mg至约750mg、约25mg至约650mg、或约30mg至约500mg、或约35mg至约450mg、最通常约50至约500mg EV。
在一些实施方案中，静脉内制剂包含本发明所述的EV、等渗介质和一种或多种防止EV聚集的物质。因此静脉内制剂可包含盐水溶液(例如生理盐水(NS)；约0.91％w/v NaCl，约300mOsm/L)和/或0.18％盐水中的右旋糖4％，和任选1％、2％或3％人血清白蛋白。
在一些实施方案中，所述包含所公开的EV的组合物进一步包含一种或多种神经营养剂。该组合物可进一步包含一种或多种选自以下的试剂：白血病抑制性因子(LIF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子受体(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-6、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、肝细胞生长因子(HGF)、IFN-γ、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-1ra、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、单核吞噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经营养因子(NT3)、金属蛋白酶(TIMP-1)、TIMP-2的组织抑制剂、肿瘤坏死因子(TNF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-D、尿激酶纤溶酶原活化剂受体(uPAR)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、IL1-a、IL-3、来普汀、干细胞因子(SCF)、基质细胞-衍生的因子-1(SDF-1)、血小板衍生的生长因子-BB(PDGFBB)、转化生长因子β(TGFβ-1)和TGFβ-3。
在一些实施方案中，所公开的EV包含在生物相容的支架，如水凝胶中或包含在其上。合适的水凝胶包括在体温固化或凝固的温度依赖性水凝胶，例如，PLURONICSTM；通过离子交联的水凝胶，例如，藻酸钠；通过暴露于可见光或紫外线凝固的水凝胶，例如，具有丙烯酸酯末端基团的聚乙二醇聚乳酸共聚物；和在改变pH时凝固或固化的水凝胶，例如，TETRONICSTM。可用于形成这些不同水凝胶的材料的实例包括多糖如藻酸盐，聚磷腈和聚丙烯酸酯，它们为离子交联的，或嵌段共聚物如PLURONICSTM(也称为POLOXAMERSTM)，其为通过改变温度固化的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，或TETRONICSTM(也称为POLOXAMINESTM)，其为通过改变pH固化的乙二胺的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物。
合适的水凝胶还包括源自组织(包括但不限于膀胱、肠、血液和脑)的未确定的细胞外基质衍生的水凝胶，。
在一些实施方案中，公开的EV包含在生物相容性支架中或生物相容性支架上，所述支架包括胶原、纤维蛋白、丝、琼脂糖、藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、生物可降解聚酯如聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸或聚乙醇酸、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚醚砜、基于肽的生物材料、葡萄糖氨基聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白或其任何组合。
在一些情况下，水凝胶可通过使海藻酸(一种从海藻分离的碳水化合物聚合物)的阴离子盐与例如钙阳离子等离子交联来制造。水凝胶的强度随钙离子或海藻酸盐的浓度增加而增加。例如，美国专利第4,352,883号描述了海藻酸盐与二价阳离子在水中于室温下发生离子交联，形成水凝胶基质。
将EV与海藻酸盐溶液混合，将所述溶液递送到已经植入的支撑物结构，随后其因体内生理浓度的钙离子的存在而在短时间内凝固。或者，在植入前将溶液递送到支撑物结构，并使其在含钙离子的外部溶液中凝固。
一般说来，这些聚合物可至少部分溶于水溶液(例如水、或具有带电侧基的水性醇溶液或其单价离子盐)。存在许多带有可与阳离子(例如聚(磷腈)、聚(丙烯酸)和聚(甲基丙烯酸))反应的酸性侧基的聚合物的实例。酸性基团的实例包括羧酸基团、磺酸基团和卤代(优选氟代)醇基团。带有可与阴离子反应的碱性侧基的聚合物的实例为聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基吡啶)和聚(乙烯基咪唑)。
聚磷腈是具有由交替的单键和双键分隔的氮和磷原子组成的主链的聚合物。每个磷原子共价键合到两个侧链上。可以使用的聚磷腈具有大部分酸性并且能够与二价或三价阳离子形成盐桥的侧链。酸性侧链的例子是羧酸基团和磺酸基团。
可生物蚀解的聚磷腈具有至少两种不同类型的侧链、能够与多价阳离子形成盐桥的酸性侧基和在体内条件下水解的侧基，例如咪唑基、氨基酸酯、甘油和葡糖基。可生物蚀解的或可生物降解的聚合物，即在期望的应用中可接受的时期内溶解或降解的聚合物(通常为体内疗法)，一旦暴露于在约25℃和38℃之间的pH 6-8的生理溶液，将在少于约五年内降解，最优选在少于约一年内降解温度。侧链的水解导致聚合物腐蚀。水解侧链的实例是未取代的和取代的咪唑和氨基酸酯，其中侧链通过氨基键与磷原子键合。
合成和分析多种类型聚磷腈的方法描述于美国专利Nos.4,440,921，4,495,174和4,880,622。合成上述其它聚合物的方法是本领域技术人员已知的。参见，例如Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,J.I.Kroschwitz,editor(John Wiley and Sons,New York,N.Y.,1990)。许多聚合物，如聚(丙烯酸)、藻酸盐和PLURONICSTM是可商购的。
通过使带有带电侧基的水溶性聚合物与含有带相反电荷的多价离子的水溶液反应来使聚合物交联，所述多价离子当所述聚合物具有酸性侧基时为多价阳离子，或当所述聚合物具有碱性侧基时为多价阴离子。用于使聚合物与酸性侧基交联形成水凝胶的阳离子包括二价和三价阳离子，例如铜、钙、铝、镁和锶。将这些阳离子盐的水溶液添加到聚合物中以形成柔软、高度膨胀的水凝胶。
用于使聚合物交联形成水凝胶的阴离子包括二价和三价阴离子，例如低分子量二羧酸根离子、对苯二甲酸根离子、硫酸根离子和碳酸根离子。将这些阴离子盐的水溶液添加到聚合物中以形成柔软、高度膨胀的水凝胶，如关于阳离子所述。
为防止抗体进入水凝胶但允许养分进入，水凝胶中有用聚合物的尺寸在介于10,000D至18,500D之间的范围内。
温度依赖性或热敏感性水凝胶具有所谓的“反向胶凝(reverse gelation)”特性，即，其在室温或低于室温下为液体，并且当升温到较高温度(例如体温)时发生胶凝。因此，这些水凝胶易于在室温或低于室温下以液体形式施用，并且当升温到体温时自动形成半固体凝胶。结果，当首先将支撑物结构植入患者体内，随后用水凝胶-EV组合物填充时，这些凝胶特别适用。所述温度相关性水凝胶的实例为PLURONICSTM(BASF-Wyandotte)，例如聚氧乙烯-聚氧丙烯F-108、F-68和F-127、聚(N-异丙基丙烯酰胺)和N-异丙基丙烯酰胺共聚物。
这些共聚物可用标准技术操作以影响其物理特性，例如孔隙度、降解速率、转变温度和硬度。举例来说，在盐存在和不存在下添加低分子量糖会影响典型热敏感性聚合物的下限临界溶解温度(lower critical solution temperature，LCST)。此外，当通过在4℃下分散来制备浓度在介于5％与25％(W/V)范围内的这些凝胶时，粘度和凝胶-溶胶转变温度会受到影响，所述凝胶-溶胶温度与浓度呈反相关。
美国专利第4,188,373号描述使用PLURONICTM多元醇的水性组合物来提供热胶凝水性系统。美国专利第4,474,751号、第4,474,752号、第4,474,753号和第4,478,822号描述利用热凝性聚氧亚烃基凝胶的药物递送系统；利用这些系统，凝胶转变温度和/或凝胶硬度二者都可通过调整pH值和/或离子强度以及聚合物的浓度加以改变。
pH依赖性水凝胶在等于、低于或高于特定pH值下为液体，并且当暴露于特定pH值(例如7.35到7.45，即人体内细胞外流体的正常pH范围)时胶凝。因此，这些水凝胶能够以液体形式容易地递送到植入的支撑物结构，并在暴露于体内pH时自动形成半固体凝胶。所述pH相关性水凝胶的实例为TETRONICSTM(BASF-Wyandotte)、乙二胺的聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物、聚(甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯-g-乙二醇)和聚(甲基丙烯酸2-羟基甲酯)。这些共聚物可通过标准技术操作以影响其物理特性。
借助可见光或紫外光凝固的水凝胶可由包括水溶性区域、生物可降解区域和至少两个可聚合区域的大分子单体制成，如美国专利第5,410,016号中所述。举例来说，水凝胶可以生物可降解、可聚合大分子单体开始，所述大分子单体包括核心、在核心每一端上的延伸和在每一延伸上的端帽(end cap)。所述核心为亲水性聚合物，延伸为生物可降解聚合物，且端帽为能够使大分子单体在曝露于可见光或紫外光(例如长波长紫外光)时交联的寡聚物。
所述光凝固水凝胶的实例包括聚氧乙烯嵌段共聚物、具有丙烯酸酯端基的聚乙二醇聚乳酸共聚物以及两端由丙烯酸酯封端的10K聚乙二醇-乙交酯共聚物。与PLURONICTM水凝胶相同，这些包含所述共聚物的水凝胶可通过标准技术操作以改变其物理特性，例如降解速率、结晶度差异和硬度。
治疗方法
还公开了治疗患有脊髓损伤、中风、外伤性脑损伤或神经退行性疾病的受试者的方法，包括向受试者给药有效量的包含本发明公开的神经EV群体的组合物。在一些实施方案中，所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、帕金森相关的障碍、亨廷顿病、朊病毒病、运动神经元疾病(MND)、脊髓小脑共济失调(SCA)或脊髓性肌萎缩(SMA)。
术语“脊髓损伤”用于描述导致脊髓的正常运动、自主神经或感觉功能暂时或永久变化的脊髓损伤。该损伤通常是由身体创伤引起的，如运动损伤，滑倒和跌倒事故或机动车辆事故，但也可能由脊柱裂，弗里德里希共济失调和/或横贯性脊髓炎等疾病引起。导致功能丧失的脊髓损伤不一定是完全切断脊髓的结果。根据脊髓及其神经根受损的位置不同，损伤的症状和程度可能差异很大，从疼痛到失禁到瘫痪。描述了不同程度的不完全到完全损伤的脊髓损伤，导致功能完全丧失。脊髓损伤可导致截瘫或四肢瘫痪。
传统的脊髓损伤治疗始于稳定脊柱并控制与脊髓损伤相关的炎症，以防止进一步损伤。根据损伤的位置和程度，其他干预措施可能会有很大差异。在许多情况下，使用常规疗法，脊髓损伤需要大量的长期物理治疗和康复，尤其是在损伤干扰日常生活活动的情况下。
根据其原因可以将脊髓损伤分为三种类型：机械力、毒性和由于缺乏血流的缺血。脊髓损伤也可分为原发性和继发性损伤。原发性损伤是由原始伤害(物理损伤，毒素暴露或缺血)中立即发生的细胞死亡引起的，继发性损伤是由原始损伤引起的级联造成的，并导致进一步的组织损伤。这些继发性损伤途径包括炎症、肿胀、神经递质缺陷/不平衡，其为缺血和细胞自杀的结果。本发明可用于治疗所有形式的脊髓损伤，包括完全和不完全损伤、局部缺血、没有放射学异常的脊髓损伤、中央脊髓综合征、脊髓前索综合征、Brown-Séquard综合征、脊髓后索综合征、脊髓痨和脊髓圆锥等等。
术语“中风”用于描述脑血管意外(CVA)、脑血管损伤(CVI)或脑部发作，当脑血流量差导致细胞死亡时发生。有两种主要类型的中风：由于缺乏血流的缺血型，和由于出血导致的出血型。这两种类型的中风都会导致部分大脑无法正常工作。中风的迹象和症状可能包括无法在身体的一侧移动或感觉，理解或说话有问题，旋转的感觉或对一侧的视力丧失等等。中风发生后不久就会出现迹象和症状。如果症状持续少于一两个小时，则称为短暂性缺血发作。出血性中风也可能与严重头痛相关。中风的症状可以是永久性的。中风的长期并发症可能包括肺炎或膀胱失控。中风的主要危险因素是高血压。其他危险因素包括吸烟、肥胖、高血胆固醇、糖尿病、既往短暂性脑缺血发作(TIA)和心房纤颤等。缺血性中风通常是由血管阻塞造成的。出血性中风是由于出血直接进入脑或进入脑周围的空间而引起的。出血可能由于脑动脉瘤发生。根据本发明治疗缺血性和出血性中风。
术语“外伤性脑损伤”(TBI)用于描述脑在技能范围内的运动引起的脑损伤或由异物引起的脑损伤。TBI的原因可能包括跌倒、汽车碰撞或被物体撞击。TBI也可能是由穿透性物体引起的，即由外来物体进入颅骨引起的脑损伤。原因可能包括枪伤或被尖锐物体击中。TBI可能会导致脑震荡、无意识(昏迷)或健忘期。TBI可能损害认知功能(例如注意力和记忆力)、运动功能(例如、肢体无力、协调和平衡受损)、感觉(例如听力、视力、受损的感觉和触觉)和情绪(例如抑郁、焦虑、侵害、冲动控制、性格改变)中的一种或多种。
在整个说明书中使用术语“神经退行性疾病”来描述由中枢神经系统的损伤引起的疾病，并且可以通过将根据本发明的神经细胞移植到患者脑和/或脊髓的受损区域来降低和/或减轻该损伤。可以使用本发明的神经细胞和方法治疗的示例性神经退行性疾病包括例如帕金森病，亨廷顿病，肌萎缩性侧索硬化(Lou Gehrig病)，阿尔茨海默氏病，溶酶体贮积症(“白质病”或神经胶质细胞/脱髓鞘疾病，例如由Folkerth，J.Neuropath.Exp.Neuro.，58,9，1999年9月所述)，Tay Sachs病(β己糖酰胺酶(hexosamimidase)缺乏症)，其他遗传疾病，多发性硬化症，脑损伤或因缺血、意外事故、环境污染等造成的创伤，脊髓损伤，共济失调和酒精中毒。另外，本发明可以用于减少和/或消除对患者的中风或心脏病发作的中枢神经系统的影响，所述影响是由于所述患者脑部位缺乏血流或缺血引起，或已经从身体损伤发生至脑和/或脊髓。术语神经退行性疾病还包括神经发育障碍，包括例如自闭症和相关的神经疾病如精神分裂症等等。
取决于是否需要局部或全身治疗，并取决于待治疗的区域，本发明公开的组合物(包括药物组合物)可以以多种方式施用。
治疗受试者的方法包括施用药物组合物，所述药物组合物包含本发明所述的有效量的EV和任选的至少一种另外的生物活性剂(例如用于治疗神经退行性疾病、中风和/或脊髓损伤的药剂)。例如，可以配制组合物以使治疗有效剂量为约0.01、0.1、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或100mg/kg患者/天之间，或在一些实施方案中，大于100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mg/kg的公开的EV可以被施用给接受这些组合物的患者。
给予受试者的EV的剂量可少于10μg、少于25μg、少于50μg、少于75μg、少于0.10mg、少于0.25mg、少于0.5mg、少于1mg、少于2.5mg、少于5mg、少于10mg、少于15mg、少于20mg、少于50mg、少于75mg、少于100mg、少于500mg、少于750mg、少于1g或多于1g。可以通过多种施用途径施用，但静脉内、鞘内、鼻内和/或脑脊液内通常用作施用途径。
在一些实施方案中，所公开的EV在中风或创伤后24小时内施用。然而，在一些实施方案中，所述EV在中风或创伤至少1、2、3或4周后施用。在一些实施方案中，所公开的EV以相隔1、2、3或更多天的多次剂量施用。在一些情况下，如神经退行性疾病的情况下，EV在疾病过程中连续施用(例如，每1、2、3或4周一次)。
EV可能装载有小分子、反义寡核苷酸、siRNA、肽、靶向的蛋白质或抗体、参与神经退行性过程的肽或肽翻译产物。
在某些实施方案中，公开的EV装载有另外的生物活性剂或与另外的生物活性剂共同施用，特别是可用于治疗神经变性疾病的药剂。
术语“共同施用”、“共同给药”或“组合疗法”用于描述其中使用至少两种有效量的活性化合物/组合物治疗神经损伤和/或神经退行性疾病的疗法。虽然术语共同施用优选包括同时向受试者施用EV和至少一种另外的活性化合物，但不一定要将化合物/组合物同时施用于患者，仅需要有效量的个体化合物/组合物同时存在于患者体内。因此，术语共同施用包括其中EV和生物活性剂大致同时(同时地)给药，或一种比另一化合物/组合物早约1分钟至数分钟至约8小时，约30分钟至约6小时，约一小时至约4小时，或甚至更早给药，如本发明另外描述，包括早多达一天或明显更多的时间给药。
可以与EV一起加载或共同给药的药剂可以包括，例如用于阿尔茨海默病的aricept、namenda、多奈哌齐、excelon、razadyne、加兰他敏、利伐斯的明、美金刚、二氢麦角碱、namzaric及其混合物，用于帕金森病的比哌立登，阿扑吗啡、苯海索、卡比多巴/左旋多巴、rasagline、belladona、左旋多巴、苯扎托品、恩他卡朋、司来吉兰、利伐斯的明、普拉克索、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、罗匹尼罗、卡比多巴/恩他卡朋/左旋多巴、金刚烷胺、tolcopone、trihexiphenidyl及其混合物，用于治疗亨廷顿病的丁苯那嗪、氟哌啶醇、氯丙嗪、奥氮平、氟西汀、舍曲林、去甲替林、苯并二氮卓类、帕罗西汀、文拉法辛、β-阻断剂、锂、丙戊酸盐、卡马西平、肉毒菌毒素及其混合物，用于治疗运动神经元疾病的抗胆碱能药、抗惊厥剂、抗抑郁剂、苯并二氮杂环庚三烯、解充血药、肌肉松弛剂、疼痛药、刺激剂及其混合物，用于治疗脊髓小脑共济失调的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI’s)、选择性去甲肾上腺素-5-羟色胺再摄取抑制剂(SNRI’s)、乙酰唑胺、巴氯芬、氯硝西泮、氟桂利嗪、加巴喷丁、美克洛嗪、美金刚、昂丹司琼、东莨菪碱、莫达非尼、阿莫达非尼、金刚烷胺、阿托西汀、安非他酮、肉毒碱、肌酸、莫达非尼、阿莫达非尼、pyrudistigmine、司来吉兰、文拉法辛、去甲文拉法辛、丁螺环酮、利鲁唑、伐尼克兰、美金刚、巴氯芬、替扎尼定、欣百达、乐瑞卡、乙酰唑胺、卡马西平、氯硝西泮、异烟肼、屈昔多巴、麻黄碱、氟氢可的松、米多君、左旋多巴、普拉克索、氟西汀、正乙酰基半胱氨酸、巴氯芬、丹曲林钠、地西泮、罗匹尼罗、替扎尼定、三己芬迪、clonazepine、氟桂利嗪、左乙拉西坦、扑米酮、托吡酯、丙戊酸、苯妥英、4-氨基吡啶及其混合物，和用于治疗脊髓性肌萎缩的利鲁唑。治疗中风的药物包括水杨酸盐，如阿司匹林、血栓溶解剂(阿替普酶)和血小板聚集抑制剂(氯吡格雷)，等等。
更一般地，非甾体类抗炎药(NSAIDS)和其它抗炎剂可用于治疗如本发明所述的神经退行性疾病。
本发明描述的EV的活性可以通过本领域已知的方法来评估。用于治疗的EV的量不仅可以随制备EV的特定细胞而变化，还可以随着给药途径、被治疗的病症的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且可以是最终由监护医生或临床医师决定。然而，一般而言，剂量可以在每天约0.01mg/kg至约10mg/kg体重的范围内。
鉴定用于治疗脊髓损伤、中风、外伤性脑损伤和/或神经退行性疾病(其通过调节疾病相关蛋白及其生物活性片段的活性和表达而发生)的本发明方法中的EV可以通过在多种筛选技术中的任一种中筛选EV活性而制备。可以对整个EV或其内含物进行筛选。在这种筛选试验中使用的片段可以在溶液中游离、附着于固体支持物上、携带在细胞表面上、或位于细胞内。生物活性的阻断或减少或疾病相关蛋白质、EV和/或EV的一种或多种组分之间的结合复合物的形成可以通过本领域可用的方法测量。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，其他实施方案在以下权利要求的范围内。
实施例
进行了研究以确定EV是否为神经干细胞带来旁分泌益处，和是否在最佳体外神经培养条件和神经干细胞治疗的治疗结果中起作用。该研究的目的是确定是否有可能从神经谱系的人干细胞，特别是神经祖细胞和/或分化的有丝分裂后神经元细胞中分离出EV。EV从源于人多能干细胞系或分化的神经元细胞(β-III微管蛋白(Tuj1)+、MAP2+、Oct4-)的神经祖细胞(SOX 1+和2+，OCT4-；hNP1TM ArunA Biomedical)；hN2TM ArunA Biomedical)中纯化。
实施例1：
人多能干细胞[参见Chambers等，Methods Mol Biol，2016.1307：p.329-43]细胞系在缺乏血清的培养基如MTeSR或E8中使用无饲养层条件培养，所述培养基可从供应商如Stem Cell Technology购买，或在由敲除血清替代物(KSR)培养基(DMEM＝F12,2mM L-谷氨酰胺，0.1mM MEM非必需氨基酸，50U/mL青霉素，50mg/mL链霉素和20％KSR)(均来自Gibco，Carlsbad，CA)和4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子bFGF(R&D Systems，Minneapolis，MN)组成的培养基中培养。细胞在丝裂霉素-C(Sigma，St.Louis，MO)有丝分裂灭活的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上培养，或无饲养层(feeder)培养，其被手动或酶促解离，并且每2-5天传代至新饲养层。对在条件培养基中的hPSC的无饲养层培养，将在MEF上生长的细胞用PBS(不含Ca2+和Mg2+)洗涤一次，然后用0.25％胰蛋白酶(Gibco)温育直至MEF层开始脱离培养皿。在搅动它以释放附着的干细胞后，丢弃漂浮的MEF层，将其收集、离心并重新悬浮于MEF条件培养基(CM)中。通过将20％KSR培养基置于MEF中24小时，然后用另外的4ng/mL bFGF补充收集的培养基来制备CM。将细胞铺在涂布有层粘连蛋白底物(1mg/cm2；Sigma)的组织培养皿上并生长至约90％融合。将细胞传代至少三次以使MEF污染最小化[参见Boyd等人，Tissue Eng Part A，2009.15(8)：p.1897-907，Mumaw，等人，Microsc Microanal，2010.16(1)：p.80-90和Young等，Neuroscience，2011.192：p.793-805]。无论采用哪种培养方法，所有培养基都会被收集起来，并从培养基收集EV并用于治疗患者。
手动传代至新鲜饲养细胞上后，使hESC在ES培养基中增殖7天(阶段1)。然后用DN2、MEDII或ES培养基再诱导细胞分化7天(阶段2)。DN2培养基是补充有N2(Gibco)、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素(P/S)和4ng/ml bFGF的基于DMEM/F12的培养基。用于该研究的MEDII培养基是补充有50％(除非另有说明)条件培养基的DN2培养基。为了理解并遵循这里应用的分化步骤，在不同的时间间隔检查了表型标记物表达。在第1、2和3阶段，收集种群并观察标记物Musashi-1、Nestin和Oct-4。还对贴壁细胞群体进行了免疫细胞化学分析。用Nestin和Oct-4对两个阶段的细胞进行双染色，并在荧光显微镜下观察与形态学相关的免疫细胞化学检查。然后使用流式细胞术对显示表型差异的组进行这些相同标记物的定量分析。除非另有说明，所有实验都重复三次。手动传代至新鲜饲养细胞后，使hESC在ES培养基中增殖7天(阶段1)。然后用DN2、MEDII或ES培养基再诱导细胞分化7天(阶段2)。DN2培养基是补充有N2(Gibco)、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素(P/S)和4ng/ml bFGF的基于DMEM/F12的培养基。用于该研究的MEDII培养基是补充有50％(除非另有说明)条件培养基的DN2培养基。在第1、2和3阶段，收集种群并观察标记物Musashi-1、Nestin和Oct-4。还对贴壁细胞群体进行了免疫细胞化学分析。用Nestin和Oct-4对两个阶段的细胞进行双染色，并在荧光显微镜下观察与形态学相关的免疫细胞化学检查。然后使用流式细胞术对显示表型差异的组进行这些相同标记物的定量分析。除非另有说明，所有实验都重复三次。
手动传代至新鲜饲养细胞上后，使hESC在ES培养基中增殖7天(阶段1)。然后用DN2、MEDII或ES培养基再诱导细胞分化7天(阶段2)。DN2培养基是补充有N2(Gibco)、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素(P/S)和4ng/ml bFGF的基于DMEM/F12的培养基。用于该研究的MEDII培养基是补充有50％(除非另有说明)条件培养基的DN2培养基(上述)。在第1、2和3阶段，收集种群并观察标记物Musashi-1、Nestin和Oct-4。还对贴壁细胞群体进行了免疫细胞化学分析。用Nestin和Oct-4对两个阶段的细胞进行双染色，并在荧光显微镜下观察与形态学相关的免疫细胞化学检查。然后使用流式细胞术对显示表型差异的组进行这些相同标记物的定量分析。除非另有说明，所有实验都重复三次。
允许hPSC在hPSC培养基(任何上述那些)中作为单层或作为拟胚体增殖约5至10天(阶段1)。然后用培养基(典型为补充有N2(Gibco)、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素(P/S)和通常4ng/ml bFGF的基于DMEM/F12的培养基)诱导细胞分化。观察Nestin和Oct-4，并形成神经菊形团(rosettes)。神经菊形团被分离(人工或酶促)，并且还在粘附的菊形团群体上进行了免疫细胞化学分析。两个阶段的细胞都是双染色的并且是Nestin+和Oct-4，并且在荧光显微镜下观察与形态学相关的免疫细胞化学检查[Shin等，Stem Cells，2006.24(1)：p.125-38]。从大多数污染细胞中分离出的菊形团被认为是人神经祖细胞。简而言之，将hNP细胞在多聚鸟氨酸(20mg/mL)/层粘连蛋白(Sigma-Aldrich，Inc.)(5mg/mL)包被的平板上或其他ECM如Matrigel上生长，并在含有2mM L-谷氨酰胺和20ng/mL b-FGF的培养基中保持和扩展。hNP细胞大约每48小时传代一次并在手动解离后以1:2分开[参见Mumaw等人，同上，Young等人，Id.和Dhara等人，Methods Mol Biol，2011.767：第343-54页]。
或者，可以通过使用Activin/Nodal途径和/或BMP信号传导的抑制剂抑制SMAD信号来刺激神经诱导(抑制剂的实例可以是Noggin，SB431542[Chambers，等人，Nat Biotechnol，2009.27(3)：p.275-80]，化合物C[Zhou等，Stem Cells，2010.28(10)：第1741-508页]或单独或组合的其它策略)。在存在或不存在Sonic Hedgehog的情况下，细胞可以在基质胶或其他细胞外基质中，在AB2、Neurobasal或上文列出的其他培养基中培养[Chambers等人，同上，和Zhou等人，同上]。
在上述不含bFGF和LIF的维持培养基中，hNP细胞在多聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被的平板或其他ECM如Matrigel上分化成神经元。或者添加LIF或EGF，使hNP细胞在这两种条件下分化1至7周[Mumaw等人，Id.和Dodia，等人，PLoS One，2011.6(8)：p.e232669]。
在神经元分化(例如hNP细胞在多聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被的平板上分化为神经元)1-4周后(在不含bFGF或bFGF和LIF或EGF的维持培养基中的两种条件下)，通过将神经元细胞(neural to cells)从hNSC维持培养基转移到补充有1％FCS(Gibco)的基础培养基(DMEM HAM's F12培养基，谷氨酰胺，青霉素/链霉素)中来诱导星形细胞分化。参见Mumaw等，同上和Young等，同上。最后，通过用含有10％FCS的基础培养基代替维持培养基来实现多线性分化。在45-50天后，对于神经胶质标记物S100β和波形蛋白，培养物几乎100％呈阳性[Palm，等人，Sci Rep，2015.5：p.1632110]。
或者，hNP细胞如作为贴壁单层培养物在增殖培养基中繁殖(如AB2TM,ANSTMNeurobasalTM,1×B27,1×GlutamaxTM,P/S,FGF2(10ng/mL)，如所述(Shin等，Id.)，且通过去除FGF分化。对于hNP细胞的星形细胞分化，向神经元分化培养基中加入重组蛋白如BMP2，以及化学物质的组合如氮胞苷、曲古抑菌素A或类似分子，保持1-5天，在期间改变完全培养基，变为单独补充分子或组合补充分子的分化培养基。细胞在分析前在处理的第5、15或30天收集，或在分化的d6或d10进行冷冻保存。对于冷冻保存，细胞用AccutaseTM解离并在含有10％DMSO的分化培养基中冷冻[Majumder等，Stem Cell Res，2013.11(1)：第574-86页]。
当如上所述在没有饲养层的情况下培养的hPSC达到约90％融合时，用PBS++(具有Ca2+和Mg2+)洗涤100mm培养皿并用10mL新鲜的内皮生长培养基2微血管(EGM2-MV)(Lonza；5％FBS，专有的内皮基底培养基2(EBM2)基础培养基和bFGF、VEGF、EGF和R3-IGF-125的浓缩物)代替。培养基每2-3天更换一次，历经20-30天。在hESC向上皮片转换完成后，将细胞用胰蛋白酶传代至T75烧瓶并生长至融合。为了扩大初始细胞培养物，将细胞传代并以每烧瓶约4x 104个细胞/cm2的目标密度接种。对于随后的实验培养，将细胞以106个细胞＝T75培养瓶(大约1.3x 105个细胞/cm2)进行传代培养并在5-7天内生长至融合[Boyd等人，Id]。
实施例2：
方法
在培养基更换24小时后从融合培养物收集细胞培养基，并在-20℃冷冻。培养基在4℃融化过夜，并在EV纯化之前通过0.22μm Steriflip设备过滤。
超速离心法提纯细胞外囊泡
根据Théry,C.等人,Isolation and Characterization of EVs from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids,in Current Protocols in Cell Biology.2001,John Wiley&Sons,Inc.中公开的方案，从细胞培养基中分离细胞外囊泡。简言之，将过滤的培养基以300xg连续离心10分钟，并将上清液转移到新鲜管中以2,000xg离心10分钟。然后将收集的上清液以10,000xg离心30分钟，并将所得上清液收集到新管中。为了标记EV，将DiI以10μM的终浓度添加到纯化的上清液中，并在室温下温育30分钟。将上清液分配到11.5ml Sorvall Ultracrimp管中并密封，然后转移到Sorvall T880固定角转子中，在4℃以100,000×g离心70分钟。小心取出上清液，将沉淀的物质重新悬浮于PBS中并转移至另一个Ultracrimp管中，并再次在4℃以100,000×g离心70分钟。除去PBS并将来自每个管的沉淀物质再悬浮于100μl PBS中。合并来自相同细胞类型的所有纯化的EV，研磨并分装到不含DNA酶/RNA酶的试管(20-50μl等分试样)中以在-20℃下储存。
通过超滤的胞外囊泡纯化
根据被开发用于纯化心肌细胞衍生的细胞外囊泡的步骤进行细胞外囊泡的超滤。将Amicon Ultra-15 100kDa分子量截留滤器用10ml PBS润湿并在摇摆转子中以4,000xg离心10分钟。丢弃PBS并将细胞培养基以约15ml/管加入过滤器中并以4,000xg离心10分钟。当过滤干细胞衍生的细胞外囊泡时，由于较少的培养基在第一轮中被保留在过滤器中，因此将另外15ml的培养基加入到过滤器中，因此对H9来源的NP、星形胶质细胞和MSC细胞系过滤了约30ml的总培养基，而对于SH SY5Y细胞只过滤了15ml的培养基；过滤器中的培养基以4,000×g以5分钟增量离心，以获得约1ml保留物。然后将其移至1.5ml试管中进行DiI标记(10μM，30分钟)，或对于未标记的纯化用PBS稀释至15ml，并洗涤两次，然后重复5分钟离心增量直至得到1-1.5ml的最终体积。然后将纯化的胞外囊泡制备物从相同的细胞类型汇集并分散到约100μl等分试样(不含DNA酶/RNA酶的试管)中并储存于-20℃。
DiI-标记囊泡
通过超滤生成标记的囊泡。超滤完成后，将过滤渗余物移至离心管中，并将10μM DiI加入上清液中保持30分钟。在此期间将PBS加入过滤装置以防止过滤器变干。用标记试剂温育后，将上清液转移回过滤装置中并用PBS(约45ml)洗涤三次以除去游离标记。最后一次洗涤后，将渗余物浓缩至约1ml，将其等分并储存于-20℃。
电子显微镜
将囊泡制剂与4％多聚甲醛(PFA)1:1混合(最终得到2％PFA)并温育15分钟。将5μl固定的囊泡悬浮液液滴转移至Formvar涂覆的网格20分钟，然后通过转移至PBS液滴洗涤。将网格转移到1％戊二醛滴液中5分钟，然后移入数滴水中以除去残留的戊二醛，然后转移到草酸铀酰。网格在80kV电子显微镜下成像。
结果
尽管最初的报道表明神经祖细胞比其他细胞类型分泌少的EV更，但是细胞的超微结构分析揭示了来自于内吞的突出囊泡(图2A-2C)，并且许多与细胞外界膜紧密接近或相关联(图2D，2E)。多泡体(MVB)内的负载大小不同(图2B，2C)，偶尔可见到向囊泡中的出芽(箭头)。当较小囊泡移动到细胞外围时，其会融合成更大的MVB(图2F，2G)。可以从神经祖细胞的培养基中纯化并可视化囊泡(图2H)。这些数据表明神经祖细胞确实将细胞外囊泡释放到细胞培养基中，并且可以使用公开的EV纯化方案纯化这些囊泡。所有比例尺都是500纳米。
在认识到神经祖细胞具有产生EV(其可纯化和通过电子显微镜可视化)的能力之后，从多种细胞类型表征纯化的囊泡的过程开始于通过考马斯染色的蛋白质分析(图3A)、和通过BCA分析总蛋白质含量(图3B)。对来自相同ES细胞系的神经祖细胞、分化的神经细胞和星形胶质细胞比较蛋白质谱，且SH SY5Y细胞，一种人成神经细胞瘤细胞系被用作阳性对照。早期的实验表明蛋白质谱重叠，但是在神经祖细胞和分化的神经细胞中存在不同的蛋白质，尽管细胞具有相同的遗传起源。类似地，比较来自神经祖细胞的囊泡和来自相同遗传起源的星形胶质细胞的大小分布指示来自2种细胞类型的囊泡大小重叠(包括大比例的55nm囊泡)，但是存在不同的亚群，其在两种细胞类型之间变化，其中星形胶质细胞显示独特的囊泡大小，包括25nm群体和稍大的135nm群体(图3C，3D)。总之，这些数据表明负载物特异性靶向MVB，且这些负载物在分化过程中发生变化，证明了EV在整个发展过程中的细胞间通信作用。
为了确定是否有可能标记EV并显现其被另一细胞的摄取，将分化的神经细胞(在不含成纤维细胞生长因子(FGF)的分化培养基中6-8周)用星形胶质细胞衍生的囊泡在30秒至30分钟范围内的时间点处理，然后固定细胞，并用β-III微管蛋白染色。在最早的时间点，在细胞中发现很少的囊泡(图4A-4C)。到5分钟时，在培养物中就可以发现具有突出红色荧光的神经细胞，表明在这些细胞中存在囊泡摄取(图4D-4F)。
为了确定这些囊泡是否可以在受体细胞中产生作用，将分化的神经细胞用衍生自神经祖细胞、星形胶质细胞或MSC(全部源自相同ES细胞系)或SH SY5Y细胞的系列稀释浓度的囊泡处理。然后将这些细胞在10天内进行营养剥夺并分析神经突的长出。正如预期的那样，在仅接受PBS的孔中，单层被破坏并留下很少量细胞(图5D)。然而，接受最高浓度的来自神经祖细胞或星形胶质细胞的EV的细胞能够在这种营养剥夺下幸存下来，并且具有完整神经突的单层细胞大部分仍然完好(图5A，B)。用MSC衍生的EV处理的孔含有比未处理的孔更多的细胞，但是单层不再完整并且神经突大部分丢失(图5C)。这些数据表明囊泡处理在营养剥夺中保护了受体细胞，并且重要的是，表明细胞对来自不同细胞类型的囊泡响应不同，即使囊泡来自同基因或自体来源。
综合起来，这些数据支持亲本来源对得到的囊泡产生影响的观点。这对于考虑将细胞外囊泡作为可以被开发用于再生医学的治疗来源具有巨大的意义，并强调需要源自神经来源的囊泡以用于治疗CNS损伤和/或疾病。重要的是，这些数据还表明，不仅是神经元衍生的囊泡，胶质囊泡也提供了体外益处。
实施例3：
生物分布方法：通过单光子发射光谱的啮齿动物生物分布。在含有EV(～2.7x 1011囊泡/kg)的200μl剂量中加入1.5-2mCi的铟-111-oxine的PBS溶液，并在37℃温育20分钟。通过三次重复的PBS洗涤，通过Amicon 100kDa超滤装置去除游离铟。将收集的EV稀释至每剂量200μCi的放射性，并且在中风后1小时或24小时静脉内注射到小鼠尾静脉中。对照动物接受注射游离铟-111-oxine。在注射后1和24小时，通过Mediso的nanoScan microSPECT/CT系统采集全身和头部的单光子发射光谱(SPECT)图像，并且根据最大强度重建投影图像以确定脑和全身的放射性。
仔猪生物分布：如先前所述使用Centricon单元通过超滤浓缩EV，然后移到50ml falcon管以用于在黑暗中的DiR标记(5μM)30分钟。通过以100,000×g超速离心4小时收集标记的EV。将沉淀的EV用PBS洗涤并再次通过超速离心收集。基于NanoSightNS 300纳米粒子追踪分析，将EV再悬浮于PBS中并稀释成2.7x 1010个囊泡/kg体重(以200μl PBS)剂量用于各个仔猪。仔猪用异氟烷麻醉以用于静脉注射(尾静脉)、鼻内递送，脑脊液EV注射到蛛网膜下池，或直接注入脑实质。对于实质内注射EV，以每分钟5μl的流速递送。在EV递送完成30分钟后，动物通过异氟烷接着CO2窒息安乐死。取出脑、心脏、肝脏、肾、肺和脾，并使用Lumina IVIS(模型)成像以检测DiR荧光。
小鼠：在紧接中风后(图6B)或中风后24小时(图6C)，在将游离的铟-111或铟-111标记的EV注射到小鼠尾静脉中，然后评估EV生物分布。注射后1小时(图6A、6B、6C，左图)和注射后24小时(图6A，6B，6C，右图)进行SPECT扫描。通过最大强度重建的图像表明，在初始时间点和24小时后(图6B，6C；全身扫描)，铟-111标记的EV在肺、肝、脾和肾脏中的整个身体的过滤器官中分布，而游离铟-111最初主要定位于肺部，24小时后分配到肝、脾和肾脏中(图6A；全身扫描)，这可指示通过肾脏系统的清除。独特地，标记的EV在注射后1小时内在脑中在靠近中区域风存在(当在中风后立即注射或中风后24小时注射时)(图6B，6C；圆圈)，表明由于血脑屏障破裂而从循环中进入，或者回归到受损组织，或两者的一些组合。在评估的任一时间点，游离铟都没有位于中风的组织(图6A，圆圈)。
独特性：这是第一次有人表明在中风后静脉内注射的EV实际上分布在梗塞的脑内和周围。大多数EV分布在心脏、肝脏、肺和肾等其他器官，我们有数据首次表明EV对中风后的免疫反应具有全身影响(其他部分的数据)。因此，外周EV的全身效应可对中风后的分子和表型益处产生积极影响。因此，EV可在损伤部位具有直接作用，这可以是通过局部免疫细胞或通过对神经元的直接作用，以及对免疫系统的全身影响。这是首次显示在大型动物脑中生物分布的数据。
仔猪：为了优化中风后EV至脑的递送，在未受伤仔猪中评估荧光标记(DiR，5μM)的生物分布。直接注入脑实质(图7，上图)或颅底蛛网膜下池的CSF(图7，下图)后，在脑内检测到标记的EV。这首次证明了大型动物研究中EV生物分布。
实施例4：
方法
小鼠模型
在中风手术前，中年C57/B6雄性小鼠(9-11个月的退休种畜)对胶带试验(ATT)预先训练3天(3次试验/天)。在诱导栓塞性中风后，小鼠被标记以用于鉴定、编号和随机化以在中风后治疗，对不同治疗组区块大小(block size)为4(来自同一笼的4只动物)。进行中风手术和脑血流量(CBF)的外科医生以及进行神经行为和神经功能缺损评分的研究者仍然对组的身份不知情。将接受的所有四种治疗剂解冻，分别于中风后2、14和38小时用剂量1、2和3进行静脉内注射。在中风后6和48小时测量相对脑血流量(CBF)。在中风后48小时评估神经功能缺损评分(NDS)；反映体感功能的ATT在中风后96小时在紧接安乐死之前进行。每天监测死亡率并记录直到第4天和安乐死之前。
栓塞性中风
在中风手术前20分钟将小鼠用丁丙诺啡(0.05mg/kg SC)镇静，并用3.5％异氟烷麻醉。手术过程中麻醉的手术平面保持1.5-2.0％。通过热调节手术垫使体温维持在37℃。通过在颈部腹侧的中线切口，评估右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。在CCA上放置一个临时的无创伤夹子，以防止导管插入时血液流失。将含有单一纤维蛋白富集块(9±0.5mm长度)的改良PE-10导管引入ECA并推入ICA。用100μL的PBS轻轻注射凝块，栓塞后立即取出导管，并闭合动脉伤口以防止失血。使用现场便携式单点皮质激光多普勒血流仪(PeriMed Inc.)证实了中风的诱导。最后，临时夹子被移除并且CCA中的血流恢复。使用#6无菌单丝尼龙缝线封闭手术部位，再次注射丁丙诺啡(0.05mg/kg SC)。小鼠被转移到干净的恢复笼中并维持动物体温。有意识的老鼠被转移到干净的常规笼子里，可以随意获得食物和水。根据需要提供NAPA凝胶和乳酸林格溶液，以防有任何脱水迹象；否则每隔12小时将1ml 37℃预热的常规无菌生理盐水进行SC注射。
激光散斑对比成像：
简言之，中风6小时后，使用异氟烷麻醉小鼠，同时体温保持在37±0.5℃。头骨剃毛，并制作中线皮肤切口以暴露中脑区域。使用具有70mW的用于照明的内置激光二极管和安装在头骨上方10cm的1388x 1038像素CCD照相机(速度19Hz，以及曝光时间6毫秒，1.3×1.3厘米)的PeriCam高分辨率激光散斑对比成像仪(LSCI；PSI系统，Perimed)获得灌注图像。分析获得的视频和图像以查看CBF的动态变化。缺血区域的整体灌注将与来自未损伤的对侧半球的同样大小的感兴趣区域进行比较以估计相对CBF。使用组织胶将皮肤伤口封闭。在中风后48小时，将皮肤伤口再次打开，清洁，暴露大脑中动脉区域以重复如前所述的LSCI程序。
神经缺陷评分(NDS)：
对治疗组不知情的研究人员在中风后48小时以5分制对小鼠的神经缺陷进行了评估，其中最高的数字表示最差的结果，数字较低表明更好的神经结果，根据以下标准：0，无缺陷(正常小鼠)；1，对侧前肢屈曲不足；2，屈曲不足伴随着侧向推力和躯干转向同侧(尾部保持时)的阻力减少；3，与分数2相同的所有缺陷，包括在笼内移动时向受影响侧绕圈非常显著，以及受影响侧的负重能力下降；4，所有缺陷如上，但很少愿意自发移动，宁愿保持休息；5，考虑终止并按照动物护理要求安乐死。
用于体感测试的ATT：
胶带测试(ATT)被用作体感运动功能的测试，并在紧接安乐死之前的中风后96小时进行。简而言之，通过将它们放入透明的丙烯酸酯盒(15cm×25cm)中，在手术前使空白小鼠适应试验过程3天。两片胶带(0.3cm x 0.4cm)被用作双侧触觉刺激，其通过将它们连接在每个前肢的远端-径向区域，以便覆盖无毛部分(3个垫，足底和小鱼际)。在180秒内，胶带移除时间被记录为感觉运动功能。如果小鼠在180秒内未能移除胶带，则会给予180秒的评分。因此，较短的时间分数表示较好的结果，而较长的时间表示较高缺陷的结果。
安乐死和2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC)-染色：
TTC-染色区分中风后代谢活性(活的或半影(penumbra))和无活性(死的或核心)组织。TTC是一种无色溶液，通过各种脱氢酶(主要是活组织中的线粒体脱氢酶)的酶作用还原为红色的1,3,5-三苯甲瓒(TPF)，而核心(死亡组织)保持白色。因此，较大的白色区域表示较高的损伤和梗塞体积。在中风后96小时和进行ATT后，小鼠用异氟烷(5％)深度麻醉。通过直接心脏穿刺收集血液以分离并获得血清。用25ml冷的0.01M磷酸盐缓冲盐水(PBS)非常快速地灌注脑，新鲜收获并立即转移到金属小鼠脑基质中。观察梗塞区域，将5个刀片置于交替间隙中以获得2-mm冠状切片(每个脑4个切片)。将切片分别置于含有预热(37℃)的3ml 5％TTC的PBS(Sigma)溶液的35-mm培养皿中，在37℃保持20-30分钟，然后用冷PBS洗涤2次，并用10％福尔马林固定。为了成像，将固定切片从盘中取出并按顺序放置在高分辨率Cannon扫描仪上。裁剪图像并保存以供分析。使用灰度图像和Scion图像软件评估校正的梗塞体积，并表示为未损伤侧的体积百分比。
血样流式细胞术(Th17，Treg，M2)
在安乐死之前，收集血液并将纯化的细胞进行荧光激活细胞分选以鉴定全身性存在的免疫细胞群体，包括T-辅助(CD4+/FOX3P+)群体、调节性T-细胞(CD4+/IL17+)和M2巨噬细胞(IL10+/CD206+)群体。
结果
使用标准方法(参见制备部分)从同源衍生的星形胶质细胞祖细胞(APEX)、MSC(MSCEX)和神经祖细胞(NPEX)中纯化EV，通过纳米颗粒追踪分析(NanoSight-NS300)评估，并以单独剂量等分试样在-20℃储存直到它们在室温下解冻，随后在栓塞中风后立即在尾静脉注射。3种EV类型和PBS由不知情研究者在栓塞性中风后给予，分别在中风后2、14和28小时以约2.7x 1011个囊泡/kg(或载体)进行3次给药。在评估的所有参数中，APEX和NPEX都优于载体治疗的对照以及MSCEX治疗组。在安乐死之后立即使用2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC)来区分代谢活性(活的，红色的)和无活性的(死的，无色的)组织。重要的是，TTC表明在APEX或NPEXTM治疗后损伤和梗塞体积减少(图8A)，而MSCEX治疗与对照相当。在中风后96小时内，APEX和NPEX治疗分别使死亡率降低了20％和17％(图8B)。在中风后48小时评估神经缺陷(以5分量表，从无缺陷[0]随着严重性的增加到终末缺陷[5])，表明接受APEX或NPEX的小鼠的行为结果明显更好(图8D)。去除胶带(用作附着在每个前肢的远端-径向区域的双侧触觉刺激)的能力，也表明改善的感觉运动功能(图8E)。总之，这些数据表明，NPEX治疗的血栓栓塞性中风啮齿动物模型与同时的载体对照相比改善的存活、分子和功能性结果。
在安乐死之前96小时时间点的血细胞的流式细胞术分析表明神经细胞类型衍生的EV、APEX和NPEX治疗导致循环中保护性调节性T细胞的存在增加(图9A)，而MSCEX与对照无法区分。APEX和NPEX组中的促炎性T辅助细胞减少(图9B)，而这些组中的抗炎M2巨噬细胞增加(图9C)。综合起来，这些数据表明神经细胞类型衍生的EV通过调节中风后的免疫应答来发挥其部分或全部效应。
用于生产来自相同ES细胞系的同源(基因相同)衍生的神经祖细胞、星形胶质细胞祖细胞和MSC细胞的生产和质量控制方法产生独特的机会来比较来自这3种细胞类型的EV，而没有由于供体材料的来源引起的遗传变化的混杂变量。绝大多数干细胞衍生的EV文献都集中使用MSC衍生的EV。在这里，第一次评估了神经细胞衍生的EV(APEX和NPEX)，并与MSC衍生的EV进行直接比较。与MSCEX相比，神经衍生的EV(APEX和NPEX)的分子益处(梗塞体积)有显著改善，并且存活增加且功能性结果也有所改善。这些改进对于更容易死亡的老年动物是立即可见的。因此，没有其他研究组表明任何EV(MSC或神经)疗法在复制人类中风病症(栓塞性中风)和诸如年龄(中年小鼠)等共病因素中的因素的小鼠模型中具有如此明显和立即的改善。这些早期强效应只能用本发明所公开的神经EV获得。
这些研究表明，部分作用机制可为通过抑制炎症M1反应的免疫调节，包括但不限于抑制IL17细胞因子，同时可通过IL10或其他细胞因子增强M2反应。
实施例5：
猪模型，大脑中动脉(MCA)闭塞引起的缺血性损伤。
使用唯一完全开发的猪中风模型[1]，将兰德瑞斯阉猪(Landrace barrows)(5-6个月，150-170磅)如前所述受到损伤。简而言之，切除一部分颧弓，并将下面的肌肉抬高，背侧露出顶骨。在骨表面产生一个窗口以暴露硬脑膜。近端MCA被永久闭塞，导致跨越额叶的最尾部以及颞叶、顶叶和枕叶的突出部分的梗塞。
磁共振光谱学
在GE 16通道固定位点Twin梯度Signa HDx 3.0Tesla MRI系统上在MCAO手术后24小时和90天进行磁共振成像(MRI)。在麻醉下，使用多通道相位阵列脊柱线圈进行神经颅脑的MRI，患者处于背卧位。获得标准的多平面MR脑成像系列。这些包括T2加权(T2w)、T2加权液体衰减反转恢复(FLAIR)和T1加权(T1w)FLAIR以及弥散加权成像(DWI)系列。以b＝0和b＝1000获得DWI。使用软件评估DWI、表观扩散系数(ADC)图和T1w-FLAIR图像，以观察脑梗塞的存在和脑半球体积的变化。具体而言，缺血区域的体积由DWI序列产生的ADC图手动获得。缺血区域由两个ADC数量减少水平限定，其中来自对侧脑半球的ADC数量提供正常的ADC值。在顺序ADC图像上手动追踪缺血区域(由具有80％和40％正常ADC值的那些定义)。每个区域乘以切片厚度以产生缺血组织体积。选择这种方法是因为它已被证明与组织学定义的区域有很强的相关性。通过类似的方法确定脑半球体积，由此在T1w FLAIR图像上定量脑半球体积(不包括脑沟和侧脑室空间)。将T2w FLAIR图像用作参照以区分填充有CSF的区域和高信号的实质区域(Platt，S.R.等，Experimental&Translational Stroke Medicine，2014.6：5)。
EV剂量和给药
在50-60ml PBS中含有约2.7x 1010个囊泡/kg的NPEX EV在4℃解冻，并在生物安全柜中使用无菌技术转移到60cc注射器中。颠倒样品至少25次，紧接着通过耳静脉导管静脉注射。在MCAO后2、14和24小时，猪接受3剂量(50-60ml)的NPEX或PBS(载体)。
动物评价和恢复
手术后，将动物转移到清洁的恢复围栏中并连续监测直至拔管。每15分钟记录直肠温度、心率和呼吸率(TPR)，直到猪清醒并且生命体征在正常限度内稳定。此后，TPR测量最初会缩短至1-2小时的间隔，除非生命体征偏离正常(例如发烧)，然后在随后的48小时内随着猪的恢复延长至更长的间隔。在最初的36小时内，猪从未在没有观察的情况下离开超过4小时，一般不超过2小时。除TPR外，记录的其他观察还包括从达到恢复直到动物第一次自己站立起来的时间，在帮助下饮水和吃东西的时间，和无帮助下饮水和吃东西的时间。还监测并记录诸如发烧(直肠温度103°F或更高)、旋转行为和癫痫发作等事件。
如表1所示，常规评估显示中风后用NPEX治疗的立即恢复的改善的存活和功能性结果。NPEX治疗组的存活明显较好，其中7只猪中有7只在中风后存活72小时以上，而对照组8只中仅存活5只。使用NPEX治疗的动物可独立站立的时间减少约2小时。在中风后72小时内非常普遍的发烧，在NPEX治疗组中7只动物中有4只具有一次或多次发热事件，而对照组中8只动物中有6只具有至少一次发热。无帮助下饮水和吃东西的时间、表现出旋转行为的动物数量和记录到癫痫发作活动的动物数量在组间相似。
如表2所示，与对照组相比，步态分析显示NPEX治疗猪的运动功能改善。在中风后7天，NPEX治疗的猪移动更快，且在它们运动跨跃过程中更具有节奏(节奏性)。由于右半球中风，左侧特定缺陷更为明显。左侧特定的测量结果表明步长更大、旋转时间更短、步幅更长以及旋转时间的摆动百分比。经治疗的动物在他们的步幅中移动时对每只脚施加更大的压力，并且显示后肢更明显地移动经过前肢(通过到达所证实)，这表明与对照相比更自然的运动。
结果
与对照相比，在28±4小时的初始MRI分析显示NPEX治疗的猪中损伤体积较小(图10A-10C)。同侧和对侧半球的体积测量指示NPEX治疗中风后后体积变化较小(图10D)，表明中风后头24小时在同侧半球中肿胀较少，与啮齿动物数据一致，表明免疫应答的早期调节并且还指示猪模型中的神经保护作用。生理参数，尤其是存活率，在诱发中风后72小时内也增加了。治疗的动物也能够比对照快约2小时实现无辅助站立。在中风后7天的步态分析显示运动功能改善，如通过以下检测到：增加的速度和节奏(节奏性)，在整个运动中施加到每只脚上的更多压力，以及步长和步幅增加，每次旋转站位(脚离地面)摆动的时间百分比增加，以及后肢延伸超过前肢的更明显的到达，如四足动物中预期的那样。
通过MRI T2和T2 FLAIR图像(图11)检测，NPEX治疗也对中风后12周动物的分子益处产生深远影响。死亡/濒临死亡的组织因治疗而减少，且受损组织(绿色痕迹)明显减少(主要涉及皮质组织)，同时与对照组相比大部分保留了心室的完整性。接受NPEX的动物在12周的研究中能够比接受对照治疗的动物在更大的梗塞尺寸(中风后24小时多达3.8cm3以上)存活下来。这可以是由于NPEX的抗炎特性导致中风严重程度降低并促进更好的长期结果，包括脑组织的完整性，以及行为和运动功能。
从来没有任何类型的EV在大型动物中改善了中风的结果或者就此而言的任何神经缺陷。与小动物一致，我们显示NPEX即时影响大脑，因此NPEX在猪和小鼠中快速起作用。我们不知道是否有任何其他研究表明EV对中风动物有如此快速的影响。NPEX立即改善存活和运动功能(动物恢复的速度，站立时间，平衡等)。大型动物中的分子和表型结果延伸到先前描述的啮齿动物数据，表明EV发挥更持久的神经保护作用。这种效应可部分归因于通过抑制中风后发生的免疫应答来调节继发性损伤级联反应，因为早在中风后24小时就可检测到分子和表型差异，并且随后对增强的M2反应产生影响，其是神经修复性的。始终观察到更持久的效果，其中NPEX治疗动物的步态得到改善。
总之，这是第一个表明动作机制在动物间是一致的中风研究，并且包括在具有与人类似结构的更复杂的脑中进行的研究。我们的体外人类细胞研究表明神经保护作用直接作用于受损的神经细胞，而小鼠和猪的研究则提示通过免疫系统进行保护。观察到两种物种中对神经修复机制的更长效作用，部分可以是由于Treg细胞的上调(迄今为止仅限于小鼠)。重要的是，不同于小鼠，猪脑与人脑具有许多同源性，包括白质比例、多脑回皮层的存在、细胞结构和大小。由于这些相似性，与啮齿动物相比，猪被认为是优越的模型系统，并且更可代表用治疗性的所产生的神经祖细胞衍生的EV治疗人缺血性中风的预期益处。
这可以是由于从神经祖细胞培养物产生大量EV的能力，大约是从MSC获得的产量的5倍。从培养物中始终以商业规模生产EV的能力要求产生EV的细胞依赖于严格的质量控制过程来处理细胞并纯化所得的EV。
实施例6：
初次过滤(步骤1，用于所有纯化方法)
从含有培养细胞的平板或烧瓶中收获培养基。将收获的培养基在初次过滤之前或之后在-20℃冷冻并在4℃解冻。过滤在无菌层流罩中完成，以尽量减少污染。收获的培养基通过0.22μm过滤器(EMD Millipore Stericup)的死端过滤而过滤。该初次过滤从收获的培养基中除去任何细胞碎片和/或死细胞。其允许EV和微囊泡通过达到滤液以进一步纯化。
Centricon超滤
经过初此过滤后，培养基已准备好进行二次过滤。该步骤采用了包括Centricon离心机装置在内的系统，该装置每次旋转可处理多达70ml的培养基。这个过滤过程使用100kDa过滤器来收集浓缩的EV。在此过程中，培养基通过4,000x g的离心强制通过过滤盘。一旦渗余物达到约250μL至5mL/装置，则使用大约90％的PBS+/+起始培养基体积进行缓冲液交换。将PBS+/+通过Centricon过滤器以2,000x g离心，直到渗余物达到每个过滤器装置250μL至1mL的体积。此时收集渗余物进行EV分析。采集样品立即进行纳米粒子追踪分析，且合并来自相同细胞类型的纯化的EV，研磨并分装入不含DNA酶/RNA酶的管中以在-20℃下储存。
Amicon搅拌细胞超滤
对于较大体积的超滤，使用Amicon搅拌池超滤装置，串联3个单元。每个基本单元都装有400毫升的培养基，并使用储库进一步扩大，以提高产量。该步骤使用包括压力容器和三个依次工作的EMD Millipore Stirred Cell Units(Fisher Scientific，USA)的系统。该步骤也使用死端过滤，其中培养基通过100kDa过滤盘(Fisher Scientific，USA)。在此过程中，使用由压缩氮气提供的25psi正压使培养基通过过滤盘。一旦渗余物达到50毫升/搅拌池单元，系统就会减压。然后使用50％的PBS+/+起始培养基体积进行缓冲液交换。使PBS+/+通过搅拌的细胞过滤器，直到渗余物达到每个过滤器单位50mL的体积。此时收集渗余物进行EV分析。采集样品立即进行纳米粒子追踪分析，且合并来自相同细胞类型的纯化的EV，研磨并分装入不含DNA酶/RNA酶的管中以在-20℃下储存。
成纤维细胞生长因子ELISA
为了确定hFGF2含量，将NPEXTM、APEX和MSCEX EV的冷冻保存样品在4℃解冻，并用等体积的EV裂解缓冲液裂解以释放外泌体内含物。使用可商购的人FGF2ELISA测定试剂盒(Thermo Scientific-目录号KHG0021)按照制造商方案分析裂解物的人FGF2。使用该试剂盒提供的FGF2标准物来产生标准曲线并定量测试样品中的FGF2。在NPEXTM样品中以490pG/mL检测到FGF2。在APEXTM或MSCEXTM样品中均未检测到FGF2。
质谱分析
为了将神经EV独特的蛋白质与MSC衍生的EV的蛋白质进行比较，使纯化的EV蛋白质通过Bioproximity，LLC进行质谱分析。
结果
如前所述使用超速离心和超滤方法。大体积纯化使用Amicon搅拌池系统在一个工作周内纯化超过24升的细胞培养基。
成纤维细胞生长因子ELISA结果
将蛋白质人成纤维细胞生长因子2(hFGF2)加入到hNP1TM培养基中以维持hNP1TM细胞的增殖状态。在hFGF2补充培养基中培养的hNP1TM细胞(NPEX)产生的EV可以积累/包含任何此hFGF2蛋白作为外泌体蛋白质内含物的一部分。测试NPEX EV(从活hNP1TM细胞培养物收集的hNP1TM培养基收获)中hFGF2的存在。这些纯化和冷冻保存的NPEXTM EV在解冻后含有可检测水平的hFGF2。另一方面，来自hAstroProTM人星形胶质细胞(APEX)和来自间充质干细胞(MSCEX)(其中细胞培养基未补充有hFGF2)的EV不含有任何可检测的hFGF2。综合起来，这些数据表明补充到培养基中的蛋白质被细胞摄取并且存在于富集的EV样品中，甚至在没有转染或其他技术以过表达细胞中的蛋白质的情况下。
质谱分析
图12是维恩图，显示NPEX、APEX和MSCEX囊泡独特和共享的蛋白质数量。所有这些囊泡共享2727种蛋白质(表3)。APEX和MSCEX共享2786种不在NPEX囊泡中的蛋白质(表4)。NPEX仅与MSCEX共享467种蛋白质(表5)，仅与APEX囊泡共享426种蛋白质(表6)。MSCEX有536种独特的蛋白质在APEX或NPEX囊泡中未被识别(表7)。APEX有596种蛋白质在NPEX或MSCEX囊泡中未被识别(表8)。NPEX具有1653种蛋白质在APEX或MSCEX囊泡中未被识别(表9)。
因此，所公开的EV基于它们所衍生的细胞的来源是独特的。此外，这些蛋白质可以用作识别EV的标签。
讨论
这是我们所知道的第一份文件，其在一定规模上需要Amicon搅拌池超滤装置，可在一周内从24升培养基中过滤和富集EV，所述量的培养基逻辑上无法通过超速离心机进行纯化，将需要大量的人力和多台离心机使用较小的Centricon/Amicon离心过滤装置。
在NPEXTM中包含来自细胞培养基的hFGF2，结合NPEX EV分布到CNS内的靶标的能力(如生物分布部分中所示)，表明这些EV可以潜在地递送hFGF2穿过血脑屏障以靶向CNS组织。这些结果表明向体内靶点(包括CNS)递送大分子，包括蛋白质(上述实施例中的hFGF2)的潜在方法，其使用细胞外囊泡(NPEXTM)，通过用感兴趣的分子补充EV源细胞(上文中的实施例中的hNP1TM)培养基。
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本发明引用的出版物及其引用的材料通过引用具体并入。
本领域技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定，本发明描述的本发明的具体实施方式的许多等同物。这样的等同物旨在由以下权利要求涵盖。