物质内包囊泡及其制造方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2011年5月23日，申请号为201180034554. 8,发明名称为"物 质内包囊泡及其制造方法"的申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种在空隙部中内包物质的囊泡及其制造方法。
[0003] 具体而言，涉及一种简便且有效地制造使将物质包含、负载于通过高分子的自组 装而得到的空囊泡的空隙部的囊泡（物质内包囊泡）的方法和通过这种方法而得到的新型 的物质内包囊泡。
【背景技术】
[0004] 已知通过使一级结构被精密地控制的高分子进行自组装，而能够形成囊泡。这种 囊泡可以进行多样的分子设计，同时具有除高分子原本具有的性质以外呈现新的功能的可 能性，因此，研宄了作为药物递送系统（Drug Delivery System :DDS)的载体或生物材料、功 能性材料等的利用。
[0005] 在专利文献1(日本特开平8-188541号公报）中由本发明的部分发明人等公开了 一种使具有非荷电链段和荷电链段的嵌段共聚物自组装而成的静电结合型高分子胶束药 物载体。
[0006] 在非专利文献 1 (Schlaad H. et al.，Macromolecules, 2003, 36 (5)，1417-1420)中 公开有一种使由聚（i，2-丁二烯）嵌段及聚（甲基丙烯酸铯）（步y (七シクAy夕夕y u-卜））嵌段构成的嵌段共聚物和由聚苯乙烯嵌段及聚（1-甲基-4-乙烯基吡啶鑰碘化 物）嵌段构成的嵌段共聚物进行自组装而成的被称为聚合物囊泡的囊泡。
[0007] 在专利文献2(国际公开第2006/118260号小册子）中由本发明的部分发明人等 公开了一种使具有非荷电亲水性链段和阳离子链段的第一嵌段共聚物（例如PEG-聚阳离 子等）和具有非荷电亲水性链段和阴离子链段的第二嵌段共聚物（例如PEG-聚阴离子等） 进行自组装而成的囊泡。
[0008] 在非专利文献 2 (Anraku Y.et al.，J. Am. Chem.Soc.，2010, 132(5)，1631-1636)中 由本发明的部分发明人等公开了一种使具有非荷电亲水性链段和荷电链段的嵌段共聚物 (例如PEG-聚阳离子等）与携带同所述荷电链段相反的电荷的荷电共聚物（例如聚阴离子 等）进行自组装而成的囊泡。
[0009] 一般认为，通过高分子的自组装而得到的上述的各种囊泡，可将各种 物质包含、负载于其空隙部（关于综述，参照非专利文献3 (H. Nyin et al. Soft Matter，2006,2,940-949)以及非专利文献4( " y步y - A応用?新展開"，秋吉一成等主 编，工^ - ?工只，2005年））。
[0010] 作为制造在空隙部中内包有物质的囊泡（以后，有时表示为"物质内包囊泡"） 的方法，代表性的方法为如下方法：将应内包的物质（以后，有时表示为"被内包物质"） 与作为膜的构成要素的高分子或者预形成的高分子膜一起混合，并同时进行利用自组 装的囊泡的形成和物质向空隙部的封入（以后，有时表示为"同时混合法"）。作为具体 例，可以举出：乳化法（参照非专利文献5(F.Szoka，Jr et alMProc.Natl.Acad.Sci-USA， 197875(9)4194-4198)) 或脂质有机溶液滴加法 （参照非专利文献 6(Batzri，S.et al.，Biochim.Biophys Acta 1973,298,1015-1019))等。
[0011] 但是，在同时混合法中，被内包物质的存在对利用自组装的囊泡的形成造成影响， 存在阻碍囊泡的形成的情况或即使形成囊泡，物质也未被内包于空隙部的情况。另外，也存 在如下问题：多在成膜中使用有害的有机溶剂，工艺变得繁杂的同时被内包物质容易因有 机溶剂而受到损伤。进而，还存在如下问题：难以形成具有均匀的粒径、结构的囊泡，为了 确保这种均匀的粒径、结构，不得不追加其它工序，工艺变得繁杂。因此，该方法的通用性不 足，作为制造各种物质内包囊泡的手法不实用。
[0012] 另一方面，作为主要对中空颗粒的物质封入中所使用的手法，有在之后向既存中 空颗粒的空隙部导入被内包物质，进行包含、负载的方法（以后，有时表示为"后负载法"） (例如参照非专利文献 7 (W. Tong et al. J. Phys. Chem. B, 2005, 109, 13159-13165)等），也 可考虑将这种方法应用于囊泡。
[0013] 但是，在将后负载法应用于囊泡的情况下，需要用于越过空囊泡的膜而将被内包 物质导入于空隙部的办法。例如一般的手法有：使空囊泡膨胀而使膜松弛，将被内包物质从 产生的膜的间隙中浸透而导入空隙部后，使膜收缩而防止被内包物质的脱落的手法；在空 囊泡的膜上形成孔，通过该孔将被内包物质导入空隙部后，密闭该孔而防止被内包物质的 脱落的手法等。但这些手法均极其繁杂，在实用化方面非常不利。另外，一般认为，在被内 包物质的封入、负载时，既存的空囊泡的粒径、结构被破坏的可能性高，非常不实用。
[0014] 另外，关于脂质体等的脂质双层囊泡，也报告有在脂质双层膜中嵌入通道蛋 白质等手法（参照非专利文献 8(Ranquin A，Versees W，Miere W，Steyaert J，Gelder PV.Therapeutic Nanoreactors:Combining Chemistry and Biology in a Novel Triblock Copolymer Drug Delivery System. Nano Lett. 2005;5:2220-4))，但除工艺仍然极其繁杂 以外，通用性也极低，仍不实用。
[0015] 因此，需要一种简便且有效地制造在通过高分子的自组装而得到的囊泡的空隙部 中内包有物质的物质内包囊泡的方法。
[0016] 另外，关于用于在空隙部分包含、负载有效成分的空囊泡，在有效成分的负载的稳 定性方面也存在改善的余地，另外，也难以负载多个有效成分。
[0017] 因此，需要开发一种有效成分的负载稳定性和多个成分的负载控制性得到改善的 新的囊泡。
[0018] 现有技术文献
[0019] 专利文献
[0020] 专利文献1 :日本特开平8-188541号公报
[0021] 专利文献2 :国际公开第2006/118260号小册子
[0022] 非专利文献
[0023] 非专利文献 1 :Schlaad H. et al.，Macromolecules, 2003, 36 (5)，1417-1420
[0024] 非专利文献 2 :Anraku Y. et al.，J. Am. Chem. Soc.，2010, 132 (5)，1631-1636
[0025] 非专利文献 3 :H. Nyin et al. Soft Matter, 2006, 2, 940-949
[0026] 非专利文献4 y示y -a応用?新展開"，秋吉一成?辻井薰主编，工^ 4 一 ?工只，2005年
[0027] 非专利文献 5:F.Szoka，Jr.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 197875(9)4194-4198
[0028] 非专利文献 6 :Batzri, S. et al.，Biochim. Biophys Acta 1973, 298, 1015-1019
[0029] 非专利文献 7 :W. Tong et al.，J. Phys. Chem. B, 2005, 109, 13159-13165
[0030] 非专利文献 8 :Ranquin A et al.，Nano Lett. 2005 ;5:2220-4
【发明内容】
[0031] 发明要解决的课题
[0032] 本发明的课题在于提供一种简便且有效地制造在通过高分子的自组装而得到的 囊泡的空隙部中内包有物质的物质内包囊泡的方法。
[0033] 另外，本发明的其它的课题在于提供一种有效成分的负载稳定性和多个成分的负 载控制性得到改善的新的囊泡。
[0034] 用于解决课题的手段
[0035] 鉴于上述课题，本发明的发明人等进行了潜心研宄，结果发现，准备规定的结构的 空囊泡，将其与被内包物质一起在水性介质中进行混合，由此可得到在囊泡的空隙部中内 包有物质的物质内包囊泡。本方法尽管简单，但通过后负载法也可以有效地在空囊泡内导 入被内包物质，同时也几乎不损伤囊泡的结构。这是极其令人吃惊的见解。
[0036] 另外，本发明的发明人等在上述方法的开发过程中，发现了在膜内含有核酸的新 型的囊泡。
[0037] 即，本发明在于提供一种制造在空隙部中内包有物质的物质内包囊泡的方法，该 方法含有如下工序：准备空囊泡的工序，所述空囊泡具有膜并具有被所述膜包围的空隙部， 所述膜含有具有非荷电亲水性链段和第一荷电链段的嵌段共聚物即第一聚合物，和具有携 带与所述第一荷电链段相反电荷的第二荷电链段的第二聚合物；将所述空囊泡及所述物质 在水性介质中进行混合的工序。
[0038] 在本发明的方法中，所述混合可通过选自由搅拌、振荡、碰撞构成的组的手法进 行。
[0039] 在本发明的方法中，所述空囊泡的所述膜可具有由外层、中间层及内层构成的三 层结构。
[0040] 在本发明的方法中，所述物质可选自由生物分子、有机化合物及无机物质构成的 组。
[0041] 在本发明的方法中，第一聚合物可为含有非荷电性亲水性链段及阴离子链段的嵌 段共聚物，第二聚合物可为含有非荷电性亲水性链段及阳离子链段的嵌段共聚物，和/或 含有阳离子链段但未含有非荷电性亲水性链段的聚合物。
[0042] 在本发明的方法中，第一聚合物可为含有非荷电性亲水性链段及阳离子链段的嵌 段共聚物，第二聚合物可为含有非荷电性亲水性链段及阴离子链段的嵌段共聚物，和/或 含有阴离子链段但未含有非荷电性亲水性链段的聚合物。
[0043] 在本发明的方法中，所述阴离子链段可为核酸。
[0044] 在本发明的方法中，所述阳离子链段可为聚胺。
[0045] 在本发明的方法中，所述非荷电亲水性链段可为聚亚烷基二醇。
[0046] 另外，本发明还在于提供一种囊泡，该囊泡含有膜、被所述膜所包围的空隙部和所 述空隙部内所内包的物质，其中所述膜包含具有非荷电亲水性链段和第一荷电链段的嵌段 共聚物即第一聚合物，和具有携带与所述第一荷电链段相反电荷的第二荷电链段的第二聚 合物。
[0047] 在本发明的囊泡中，所述膜可具有由外层、中间层及内层构成的三层结构。
[0048] 在本发明的囊泡中，所述物质可选自由生物分子、有机化合物及无机物质构成的 组。
[0049] 在本发明的囊泡中，第一聚合物可为含有非荷电性亲水性链段及阴离子链段的嵌 段共聚物，第二聚合物可为含有非荷电性亲水性链段及阳离子链段的嵌段共聚物，和/或 含有阳离子链段但未含有非荷电性亲水性链段的聚合物。
[0050] 在本发明的囊泡中，第一聚合物可为含有非荷电性亲水性链段及阳离子链段的嵌 段共聚物，第二聚合物可为含有非荷电性亲水性链段及阴离子链段的嵌段共聚物，和/或 含有阴离子链段但未含有非荷电性亲水性链段的聚合物。
[0051] 在本发明的囊泡中，所述阴离子链段可为核酸。
[0052] 在本发明的囊泡中，所述阳离子链段可为聚胺。
[0053] 在本发明的囊泡中，所述非荷电亲水性链段可为聚亚烷基二醇。
[0054] 另外，本发明还在于提供一种囊泡，该囊泡具有膜并具有被所述膜包围的空隙部， 所述膜包含嵌段共聚物和核酸，所述嵌段共聚物具有非荷电亲水性链段和阳离子链段。
[0055] 在本发明的囊泡中，所述膜可具有由外层、中间层及内层构成的三层结构。
[0056] 在本发明的囊泡中，所述阳离子链段的阳离子基对所述核酸的磷酸基的摩尔比即 N+/P比可超过1. 0且低于3. 0。
[0057] 在本发明的囊泡中，所述非荷电亲水性链段可为聚亚烷基二醇。
[0058] 在本发明的囊泡中，所述阳离子链段可为聚胺。
[0059] 在本发明的囊泡中，所述膜还可含有交联剂。
[0060] 在本发明的囊泡中，所述交联剂对所述阳离子链段的阳离子基的摩尔比即CL/N 比可为0. 1以上。
[0061 ] 在本发明的囊泡中，所述交联剂可为戊二醛。
[0062] 本发明的囊泡可用作药物递送系统。
[0063] 发明效果
[0064] 根据本发明，可以简便且有效地制造在通过高分子的自组装而得到的囊泡的空隙 部中内包有物质的物质内包囊泡。另外，根据该方法，可提供一种具有可用性的新型的物质 内包囊泡。
[0065] 另外，根据本发明，也可提供一种具有新型的结构的囊泡，该囊泡利用含有规定嵌 段共聚物和核酸的膜包围空隙部。
【附图说明】
[0066] 图1(a)以及（b)是用于说明本发明的方法的图；
[0067] 图2是用于说明空囊泡的结构的图；
[0068] 图3(a)以及（b)是用于说明空囊泡的膜结构的一形态的图；
[0069] 图4(a)以及（b)是用于说明空囊泡的膜结构的其它的形态的图；
[0070] 图5(a)~（c)是用于说明膜内含核酸囊泡（膜内核酸含有<シ夕少）的膜结构 的一形态的图；
[0071] 图6 (a)以及（b)分别为表示膜内含核酸囊泡形成时的N+/P比与平均粒径及多分 散指数之间的关系的图表；
[0072] 图7 (a)是形成膜内含核酸囊泡的试样（N+/P比=1. 2)的透射型电子显微镜照片， 图7(b)是未形成膜内含核酸囊泡的试样（N+/P比=2. 0)的透射型电子显微镜照片；
[0073] 图8(a)~（d)均为经交联的膜内含核酸囊泡的相位差低温透射型电子显微镜照 片；
[0074] 图9(a)和（b)均为表示膜内含核酸囊泡的粒径以及形状的经时变化的图表；
[0075] 图10是表示膜内含核酸囊泡的RNAi活性的图表；
[0076] 图11 (a)和（b)均为表示利用膜内含核酸囊泡的siRNA的细胞内吞的图；
[0077] 图12是表示向膜内含核酸囊泡内包物质的图表；
[0078] 图13是实施例V-1的物质内包囊泡的粒度分布的图表；
[0079] 图14是实施例V-1的物质内包囊泡的利用FCS测定得到的衰减曲线的图表；
[0080] 图15是比较例v-1的物质内包囊泡的粒度分布的图表；
[0081] 图16(a)~（c)均为表示实施例VI-1的利用物质内包囊泡的体内活性的评价结 果的荧光照片；
[0082] 图17是实施例VI-1的物质内包囊泡的粒度分布的图表；
[0083] 图18是实施例VI-1的物质内包囊泡的利用FCS测定得到的衰减曲线的图表；
[0084] 图19是比较例VI-1的物质内包囊泡的粒度分布的图表；
[0085] 图20是实施例VII的物质内包囊泡的利用FCS测定得到的衰减曲线的图表；
[0086] 图21(a) (b)均为实施例VII的物质内包囊泡的相位差低温透射型电子显微镜照 片；
[0087] 图22是表示实施例VIII的利用物质内包囊泡的体外活性的评价结果的图表；
[0088] 图23是表示因混合引起的空囊泡的结构变化的图表。
【具体实施方式】
[0089] [I:定义]
[0090] 在本说明书中，所谓"囊泡"是指具有单层（単7 乂 7 )结构的膜和被所述膜所包 围的空隙部（内水相）的基本结构体。
[0091] 在本说明书中，所谓基团的名称或作为其一部分的"烷基"表示一价的脂肪族饱和 烃基。只要没有特别说明，则烷基可以为链状，也可以为环状，还可以为链状和环状键合而 成的形状。链状烷基可以为直链状，也可以为支链状。环状烷基可以为单环式，也可以为复 环式，在复环式的情况下，可以为连接环，也可以为稠环，还可以为螺环。
[0092] 在本说明书中，所谓基团的名称或作为其一部分的"烷氧基"表示所述烷基键合于 二价的氧原子的一方的连接键而成的基团。
[0093] 在本说明书中，作为基团的名称或作为其一部分的"芳基"表示一价的芳香族烃 基。只要没有特别说明，则芳基可以为单环式，也可以为复环式，在复环式的情况下，可以为 连接环，也可以为稠环，还可以为螺环。
[0094] 在本说明书中，基团的碳原子数例如如"(^_12烷基"那样表示。在此"C i_12"是指该 烷基的碳原子数为1~12个。
[0095] 在本说明书中，所谓"卤原子"是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
[0096] 在本说明书中，所谓某基团"可以被取代"是指该基团所具有的1或2个以上的氢 原子可被1或2个以上的取代基（在2个以上的情况下，可以相同，也可以不同）取代。取 代基的最大数依据该基团所具有的结构及可取代的氢原子数，只要为该领域技术人员则可 以容易地确定。
[0097] 在本说明书中，所谓"取代基"只要没有特别说明，则选自卤原子、芳基、羟基、氨 基、羧基、氰基、甲酰基、二甲基缩醛甲酰基、二乙基缩醛甲酰基、心_ 6烷氧基羰基、C2_7酰胺 基、甲硅烷氧基、三（CV6烷基）甲硅烷氧基（在此，Cm烷基可以相同，也可以不同）以及甲 硅烷基氨基构成的组。
[0098] 在本说明书中，所谓"剪切应力"是指力的作用面的法线的方向和力的作用方向不 一致的应力成分。另外，作为"在剪切应力下混合"是指以剪切应力作用于作为混合对象的 物体的方式进行混合。在对含有物体（例如囊泡）的流体（例如水性介质）施加外力的 情况下，通常"剪切应力"作用于在该流体内存在的物体。因此，例如在对后述的混合对象 液（在水性介质中含有囊泡以及被内包物质的液体）施加外力进行混合的情况下，"剪切应 力"作用于其中所含的囊泡，这种混合是"在剪切应力下混合"。
[0099] 在本说明书中，所谓"RNAi "是指RNA干扰（RNA interference)。
[0100] 在本说明书中，作为"siRNA"（小干扰 RNA，small interfering RNA)是指与 RNAi 相关的低分子（通常为19~27碱基对，优选为21~23碱基对）双链RNA。
[0101] 以下，对本发明的实施方式进行说明。另外，以下的实施方式仅为例子，本发明可 以以任意方式进行实施。
[0102] [II :物质内包囊泡的制造方法]
[0103] (II-1:概要）
[0104] 如上所述，作为物质内包囊泡的代表性的制造方法的同时混合法不仅在内包的成 功与否不可靠，而且难以确保被内包物质的稳定性以及囊泡的粒径、结构的均匀性，工艺也 具有繁杂性，因此作为制造各种物质内包囊泡的手法，在推广方面问题较多。另一方面，还 可以考虑利用主要用于中空颗粒的后负载法，但为了越过既存的空囊泡的膜而在空隙部导 入物质，需要空囊泡的膨胀引起的膜的松弛、对空囊泡的膜的孔形成、对脂质双层膜的通道 蛋白质的嵌入等繁杂的手法，不仅工艺极其繁杂，而且难以控制囊泡的粒径、结构，一般认 为非常不实用。
[0105] 相对于此，本发明的物质内包囊泡的制造方法（以后，有时简称为"本发明的制造 方法"。）为：准备规定的结构的空囊泡，将其与被内包物质一起在水性介质中进行混合，由 此制作在囊泡的空隙部中内包有物质的物质内包囊泡。尽管这种手法简便，但即使通过后 负载法也可有效地在空囊泡内导入被内包物质，囊泡的结构也几乎未受损。这是极其令人 吃惊的见解。
[0106] 关于本发明的制造方法的概要，以下，使用图1进行说明。需要说明的是，图1为 示意图，本发明并不限定于图1。
[0107] 如图1(a)所示，准备规定的结构的空囊泡1，其具有被膜la所包围的空隙部lb， 将所述空囊泡1与被内包物质9 一起在水性介质中进行混合。由此，如图1 (b)所示，被内 包物质9越过空囊泡1的膜la被导入空隙部lb，可得到在空隙部lb内包有被内包物质9 的物质内包囊泡1'。
[0108] 对于需要结构的高度控制的高分子自组装囊泡1，可用这种简便的手法将物质9 导入膜la内的空隙部lb并进行内包是极其令人吃惊的见解。本发明的制造方法基于这种 见解。
[0109] 以下，对本发明的制造方法进行详细叙述，但对空囊泡以及被内包物质的详细情 况另起一章进行后述，在此对其它的条件以及步骤进行说明。
[0110] (11-2 :空囊泡及被内包物质的混合）
[0111] 本发明的制造方法包括将空囊泡及被内包物质在水性介质中进行混合的工序 (另外，以后，有时将在此作为混合的对象的空囊泡及被内包物质包含于水性介质中的液体 称为"混合对象液"。）。
[0112] 进行混合的手法没有特别限制，用对水性介质施加外力的手法进行。即，在水性 介质中加入空囊泡及被内包物质并静置，使其自然扩散并混合的手法（以后，有时称为"静 置、扩散混合"。）被排除在外。作为对水性介质施加外力的混合法的例子，可以举出：搅拌、 振汤、碰撞等。
[0113] 作为利用搅拌的手法的例子，可以举出：将含有混合对象液的容器利用旋涡混合 器等使其旋转进行搅拌的手法或利用搅拌桨等将溶液直接进行搅拌的手法等。
[0114] 作为利用振荡的手法的例子，可以举出：将含有混合对象液的容器利用振荡机等 进行振荡的手法。
[0115] 作为利用碰撞的手法的例子，可以举出：利用超声波照射等对混合对象液施加振 动或其它的各种碰撞的手法等。
[0116] 通过这种混合，在囊泡空隙部中内包有物质，可制造物质内包囊泡。
[0117] 通过混合形成物质内包囊泡的原因尚未确定，但通过对水性介质施加外力，剪切 应力作用于空囊泡（因此，可以将对水性介质施加外力的混合换言之为在剪切应力下的混 合。）。一般认为，通过这种剪切应力，空囊泡的结构被搅乱而分解成大致均匀的小集合体， 其再次自组装使囊泡均匀地再生的同时将存在于水性介质中的被内包物质在囊泡再生时 封入囊泡内（这种机制也可从如下内容推测：在后述的参考实验中，确认到利用混合分解 囊泡而成的小聚集体。）。这是在通常的状态的囊泡上难以产生的现象，利用了这种现象的 本发明的制造方法可以说是极其崭新的方法。
[0118] 混合的条件没有限制，但若考虑上述机制，则优选水性介质中的空囊泡的结构被 充分搅乱的同时在搅乱后囊泡的结构可再生的程度的条件。通常混合成力作用于混合对象 液整体的程度即可，但优选混合成混合对象液整体大致均匀的程度。
[0119] 具体的混合的条件根