一种采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用纳米膜浓缩尿提取微囊泡的方法，首先，收集人的晨尿，低速离心，收集上清液；其次，把上清液经过纳米膜浓缩，透析滤过，除去水分和可溶性蛋白，收集纳米膜中的上清液；然后，将上清液超速离心，收集沉淀，用超纯水重悬，即得到尿微囊泡；本发明方法能够迅速提取尿样本中的微囊泡，为临床和基础科学研究提供准确的信息，为实现快速、大规模处理尿样本提供了可能。
【专利说明】一种采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微囊泡提取【技术领域】，具体涉及一种采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法。
【背景技术】
[0002]尿液作为一种无损伤的尿蛋白生物标记物的来源，越来越多的引起大家的兴趣。尿微囊泡是由肾小管上皮细胞分泌，释放进入尿道的囊泡，因此，有可能携带有肾脏结构和功能损伤的分子标记物。蛋白组学方法已经鉴定出尿中大量高丰度蛋白，尿微囊泡所含有的信息被认为是疾病的候选生物标记物。尿微囊泡蛋白组学的开发有助于理解泌尿系统尿微囊泡的生物学功能，更有利于理解相关疾病病理生理机制，也是寻找疾病发病机制过程中的尿生物标记物的靶点。
[0003]外泌体(Exosomes)是一类起源于内吞体系统，由细胞多囊体通过质膜融合的方式而分泌的直径在40_100nm之间的微囊泡。Exosomes最初被发现是在1981年，由Trams等在研究正常细胞和肿瘤细胞脱落小体的5’核苷酸外切酶的活性时，电镜下发现直径在500-1000nm的囊泡中还有很多次级囊泡，和直径大约40nm的囊泡。Exosomes由脂质双层、跨膜蛋白和含有蛋白的亲水核、mRNAs和miciORNAs组成，能够作为细胞间的载体，通过货物载体功能，传递生物的、生理的和病理的信息。exosomes参与细胞内信号转导。依赖于其起源，exosomes能够调节免疫调节过程、建立肿瘤逃逸机制和介导再生和退化过程。exosomes是由分子组成的复杂的细胞间信号器，具有多种功能，是潜在的临床诊断新工具，潜在的新的疾病治疗靶点。
[0004]国内外目前报道的尿微囊泡提取技术主要是超速离心法。超速离心法适用于小量尿样本的处理，一般不超过5mL尿液，该方法需要200000g的超速离心机，密度梯度离心,价格昂贵，不能一次性处理大量样本。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法，该方法能够一次性处理大量样本，且样本处理量大，所需仪器相对成本较低，处理流程简便。
[0006]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:一种采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法，含以下步骤:
[0007](I)低速离心，选取新鲜晨尿标本，采用低速离心机，离心后，收集上清液；
[0008](2)纳米膜浓缩，将步骤(I)中获得的上清液倒入纳米膜中浓缩，透析滤过除去水分和可溶性蛋白，待溶液滤过到靠近纳米膜底部时，加入超纯水洗脱，进一步除去尿液中的可溶性蛋白，纯化尿微囊泡，收集上清液；
[0009](3)超速离心，将步骤(2)获得的上清液，采用超速离心机离心后，收集离心管底部尿沉淀，用超纯水重悬后即得到尿微囊泡。
[0010]本发明步骤(I)中低速离心时离心机的相对离心力RCF为2000g，温度为室温，离心时间为30min。
[0011]本发明首先采用低速离心以去除样本中的细胞碎片、细菌等杂物。
[0012]本发明步骤(I)中采用的新鲜晨尿标本为人的新鲜晨尿，未添加防腐剂，室温放置不超过3个小时，或者保存于4°C冰箱，如需运输，需加入干冰。
[0013]本发明步骤(2)中待溶液优选滤过到靠近纳米膜底部3?5cm处时，优选加入200mL超纯水洗脱，进一步除去尿液中的可溶性蛋白，纯化尿微囊泡,优选收集5mL上清液。
[0014]本发明步骤(2)中所述纳米膜的截留分子量优选为lOOOkDa。
[0015]当采用的纳米膜的截留分子量太低时，所获得的尿微囊泡纯度不够，含有分子量较大的可溶性蛋白，我们采取的纳米膜最大截留分子量，选择为IOOOkDa,只有当纳米膜的截留分子量约为IOOOkDa时，结合低速离心机和超速离心机，能提取出较纯的尿微囊泡。
[0016]本发明步骤(3)中超速离心机离心时，离心机的相对离心力RCF为至少40000g，离心温度为4°C，离心时间为I?2小时。
[0017]本发明步骤(3)中超速离心机离心时，离心机的相对离心力RCF优选为40000?lOOOOOg，离心温度为4°C，离心时间为I?2小时。
[0018]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
[0019](I)本发明处理方法简便:超速离心法处理大量尿标本时如50mL，需要先将尿液真空干燥至5mL (—般是原体积的10%)，再进行超速离心，提取尿微囊泡；而本发明中则结合纳米膜浓缩法利用纳米膜透析的同时除去了大量的水分，方便快捷；
[0020](2)本发明方法特异性强:现有技术中超速离心法真空干燥过程中不可避免的会弓I起温度的改变，可能会破坏尿微囊泡的膜，损失部分微囊泡；
[0021](3)本发明方法节省时间:超速离心法各个流程下来所花费时间较长，处理一个样品一般需要3-5天的时间，而本发明中的纳米膜浓缩法只需要2天的时间；
[0022](4)本发明方法经济费用低:超速离心法需要200000g的超速离心机，价格昂贵，而本发明中的纳米膜浓缩法只需要40000g的离心机，能节省经济费用。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是实施例1-3中尿微囊泡的40000倍透射电镜图；
[0024]图2是实施例1-3中尿微囊泡的50000倍透射电镜图；
[0025]图3是实施例1-3中NanoSight观察到的尿微囊泡的粒径浓度图,其中横坐标代表粒径0_900nm,纵坐标代表囊泡浓度,单位IO6个/mL ;
[0026]图4是实施例1-3中NanoSight观察到的尿微囊泡的视频截图，图中白色球形亮点即为囊泡；
[0027]图5是实施例1-3中NanoSight观察到的尿微囊泡的粒径相对强度图，其中横坐标为粒径0-900nm，纵坐标为相对强度；
[0028]图6是实施例1-3中NanoSight观察到的尿微囊泡的粒径相对强度三维图。
【具体实施方式】
[0029]实施例1
[0030]本实施例提供的采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法，具体含以下步骤:[0031](I)低速离心:取IOOmL健康志愿者的晨尿标本,进行研究,低速离心机(Allegra?X-22Centrifuge, Beckman Coulter),相对离心力(RCF) 2000g,室温，30 分钟，除去细胞碎片、细菌等杂物，收集上清液；
[0032](2)纳米膜浓缩:将低速离心收集的上清液全部倒入纳米膜中，透析滤过，待溶液滤过到纳米膜底部3-5cm处时，加入200mL超纯水洗脱，进一步除去尿液中的可溶性蛋白，纯化尿微囊泡，收集5mL上清液；
[0033]其中纳米膜透析时可以采用简易的纳米膜浓缩装置，可以使用时自己搭配，具体可以包括漏斗I个，纳米膜长度30?35cm，IOOOmL量筒一个，通用型膜夹(UniversalClosures) 一个,封口膜(2cmX6cm)两片。
[0034]关于纳米膜购自仕必纯(上海)贸易有限公司Spectrum Labs Inc，其截留分子量为 IOOOkDa0
[0035](3)超速离心:采用超速离心机，RCF40000g，4°C，2小时，丢弃上清液，收集离心管底部尿沉淀，即尿微囊泡，ImL超纯水重悬；
[0036]超速离心前，最好利用分析天平对所有样本进行两两配平，保证不损伤分析天平的轴，要求做到精确到小数点后3位(μ g)。
[0037](4)透射电镜观察:取步骤(3)中制备的尿微囊泡20 μ L，点样于铜网，5分钟后，予3% (W/V)磷钨酸负染2分钟，超纯水洗涤两遍，干燥5分钟后检测，调节透射电镜焦距，观察尿微囊泡的形态和粒径，具体结果见图1-2中所示，从图1-2可以看出，尿微囊泡分布均匀，呈杯状或圆形，粒径在30?lOOnm。
[0038]采用透射电镜观察之前，要求对所收集的尿微囊泡进行蛋白定量，取10μ g/mL的尿微囊泡进行形态学观察。蛋白定量可以采取Bradford考马斯亮蓝法对所收集的尿微囊泡进行蛋白定量，取BSA作为标准品，等比稀释，绘制标准曲线，根据标准曲线检测待测样品的尿微囊泡蛋白浓度；重复三次测量，取平均值。
[0039](5)NanoSight检测:用超纯水稀释尿微囊泡，等比稀释，稀释为200倍，针筒上样，每次2?3m，上样前后均用超纯水清洗检测槽；调整NanoSight仪器参数，至合适焦距，对微囊泡进行分析记录。检测结果见图3-6中所示，从图3-6中可以看出，尿微囊泡的粒径主峰在102nm，没有杂峰，样品较纯，图4中显示，图中亮点即为尿囊泡，图5中显示样品的粒径/相对强度图，其中横坐标为粒径0-900nm，纵坐标为相对强度，可见IOOnm粒径的囊泡占大多数；图6是样品的粒径/相对强度三维图，从6中也可以看出IOOnm粒径的囊泡占大多数。
[0040](6)检测结果
[0041]透射电镜下尿微囊泡成杯状或球形，分布均匀，具体可见图1-2中所示。
[0042]尿微囊泡的粒径平均值为102nm，具体可见图3中所示。
[0043]尿微囊泡分布均匀，布朗运动显著。
[0044]所观察到的尿微囊泡的数量为3.8X 108/mL，由于样品稀释200倍，故原样品的尿微囊泡的数据应该为7.6X KT/mL。
[0045]实施例2
[0046]本实施例提供的采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法，具体含以下步骤:
[0047](I)低速离心:取IOOmL健康志愿者的晨尿标本,进行研究,低速离心机(Allegra?X-22Centrifuge, Beckman Coulter),相对离心力(RCF) 2000g,室温，30 分钟，除去细胞碎片、细菌等杂物，收集上清液；
[0048](2)纳米膜浓缩:将低速离心收集的上清液全部倒入纳米膜中，透析滤过，待溶液滤过到纳米膜底部3-5cm处时，加入200mL超纯水洗脱，进一步除去尿液中的可溶性蛋白，纯化尿微囊泡，收集5mL上清液；
[0049]关于纳米膜购自仕必纯(上海)贸易有限公司Spectrum Labs Inc,其截留分子量为 IOOOkDa0
[0050](3)超速离心:采用超速离心机，RCF60000g，4°C，1.5小时，丢弃上清液，收集离心
管底部尿沉淀，即尿微囊泡，ImL超纯水重悬；
[0051](4)透射电镜观察:取步骤(3)中制备的尿微囊泡20 μ L，点样于铜网，5分钟后，予3% (W/V)磷钨酸负染2分钟，超纯水洗涤两遍，干燥5分钟后检测，调节透射电镜焦距，观察尿微囊泡的形态和粒径，具体结果见图1-2中所示，从图1-2可以看出，尿微囊泡分布均匀，呈杯状或圆形，粒径在30?lOOnm。
[0052](5)NanoSight检测:用超纯水稀释尿微囊泡，等比稀释，稀释为200倍，针筒上样，每次2?3m，上样前后均用超纯水清洗检测槽；调整NanoSight仪器参数，至合适焦距，对微囊泡进行分析记录。检测结果见图3-6中所示，从图3-6中可以看出，尿微囊泡的粒径主峰在102nm，没有杂峰，样品较纯，图4中显示，图中亮点即为尿囊泡，图5中显示样品的粒径/相对强度图，其中横坐标为粒径0-900nm，纵坐标为相对强度，可见IOOnm粒径的囊泡占大多数；图6是样品的粒径/相对强度三维图，从6中也可以看出IOOnm粒径的囊泡占大多数。
[0053](6)检测结果
[0054]透射电镜下尿微囊泡成杯状或球形，分布均匀，具体可见图1-2中所示。
[0055]尿微囊泡的粒径平均值为102nm，具体可见图3中所示。
[0056]尿微囊泡分布均匀，布朗运动显著。
[0057]实施例3
[0058]本实施例提供的采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法，具体含以下步骤:
[0059](I)低速离心:取IOOmL健康志愿者的晨尿标本,进行研究,低速离心机(Allegra?X-22Centrifuge, Beckman Coulter),相对离心力(RCF) 2000g,室温，30 分钟，除去细胞碎片、细菌等杂物，收集上清液；
[0060](2)纳米膜浓缩:将低速离心收集的上清液全部倒入纳米膜中，透析滤过，待溶液滤过到纳米膜底部3-5cm处时，加入200mL超纯水洗脱，进一步除去尿液中的可溶性蛋白，纯化尿微囊泡，收集5mL上清液；
[0061]纳米膜购自仕必纯(上海)贸易有限公司Spectrum Labs Inc,其截留分子量为IOOOkDa0
[0062](3)超速离心:釆用超速离心机，RCF100000g，4°C，l小时，丢弃上清液，收集离心管底部尿沉淀，即尿微囊泡，ImL超纯水重悬；
[0063](4)透射电镜观察:取步骤(3)中制备的尿微囊泡20 μ L，点样于铜网，5分钟后，予3% (W/V)磷钨酸负染2分钟，超纯水洗涤两遍，干燥5分钟后检测，调节透射电镜焦距，观察尿微囊泡的形态和粒径，具体结果见图1-2中所示，从图1-2可以看出，尿微囊泡分布均匀，呈杯状或圆形，粒径在30?lOOnm。
[0064](5)NanoSight检测:用超纯水稀释尿微囊泡，等比稀释，稀释为200倍，针筒上样，每次2?3m，上样前后均用超纯水清洗检测槽；调整NanoSight仪器参数，至合适焦距，对微囊泡进行分析记录。检测结果见图3-6中所示，从图3-6中可以看出，尿微囊泡的粒径主峰在102nm，没有杂峰，样品较纯，图4中显示，图中亮点即为尿囊泡，图5中显示样品的粒径/相对强度图，其中横坐标为粒径0-900nm，纵坐标为相对强度，可见IOOnm粒径的囊泡占大多数；图6是样品的粒径/相对强度三维图，从6中也可以看出IOOnm粒径的囊泡占大多数。
[0065](6)检测结果
[0066]透射电镜下尿微囊泡成杯状或球形，分布均匀；具体可见图1-2中所示。
[0067]尿微囊泡的粒径平均值为102nm，具体可见图3中所示。
[0068]尿微囊泡分布均匀，布朗运动显著。
[0069]以上列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法，其特征是含以下步骤: (1)低速离心，选取新鲜晨尿标本，采用低速离心机，离心后，收集上清液； (2)纳米膜浓缩，将步骤(1)中获得的上清液倒入纳米膜中浓缩，透析滤过除去水分和可溶性蛋白，待溶液滤过至靠近纳米膜底部时，加入超纯水洗脱，进一步除去尿液中的可溶性蛋白，纯化尿微囊泡，收集上清液； (3)超速离心，将步骤(2)获得的上清液，采用超速离心机离心后，收集离心管底部尿沉淀，用超纯水重悬后即得到尿微囊泡。
2.根据权利要求1所述的采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法，其特征是:步骤(1)中低速离心时离心机的相对离心力RCF为2000g，温度为室温，离心时间为30min。
3.根据权利要求1所述的采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法，其特征是:步骤(2)中采用的纳米膜的截留分子量为1000kDa的纳米膜。
4.根据权利要求1所述的采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法，其特征是:步骤(3)中超速离心机离心时，离心机的相对离心力RCF至少为40000g，离心温度为4°C，离心时间为1~2小时。
5.根据权利要求4所述的采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法，其特征是:步骤(3)中超速离心机离心时，离心机的相对离心力RCF为40000g~100000g，离心温度为4°C，离心时间为1~2小时。
【文档编号】G01N1/34GK103900890SQ201410083345
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】哈利·郝瑟福, 邹和群, 李永强, 谷东风, 姜勇, 卢卡·穆桑特 申请人:南方医科大学第三附属医院