专利名称：一种水稻snare蛋白基因的抗病性基因工程应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻SNARE蛋白基因0sSYP71的基因工程应用，属于基因工程领 域，具体涉及水稻抗病相关的SNARE蛋白。
背景技术：
SNARE(goluble_M_ethyl_maleimide_sensitive fusion protein attachment proteini^c印tor)蛋白是介导真核生物细胞囊泡运输的一类蛋白，负责囊泡膜和目标膜 的融合，这类蛋白的结构在真核生物中是高度保守的。Uemura等(2004， Uemura T， Ueda T， Ohniwa RL， Nakano A， Takeyasu K， Sato MH(2004). Systematic analysis of SNARE molecules in Arabidopsis :dissection of th印ost—golgi network in plant cells. Cell Struct Funct， 29 :49-65)对拟南芥中的68个SNARE蛋白的结构域进行分析，将其划 分为四类Qa-SNAREs、 Qb-SNAREs、 Qc-SNAREs和R-SNAREs。 SNARE蛋白一般以形成SNARE 复合体形式参与囊泡运输的膜融合过程，复合体成员通常包括一个Qa-SNARE蛋白(含有 Qa-SNARE结构域)、 一个SNAP25类蛋白(含有Qb-和Qc-SNARE结构域)和一个R-SNARE蛋 白(含有R-SNARE结构域)，有时复合体中SNAP25类蛋白被两个各含有Qb-和Qc-SNARE结 构域的蛋白所替代(Fukudaet al. ， 2000， Fukuda R， McNew JA， Weber T， Parlati F， Engel T，Nickel W，Rothman JE， sollner TH(2000). Functionalarchitecture of an intracellular membrane t-SNARE. Nature, 407 :198-202)。研究发现，植物中的SNARE蛋白促进植物细 胞板形成，能与离子通道蛋白相互作用，有利于植物的正常生长发育，能提高植物的抗病性 及参与植物的向重力性作用。植物SNARE蛋白不仅对植物生长发育起作用，在抵御生物 与非生物胁迫过程中也起重要的作用(Pratelli et al. ，2004 Pratelli R， Sutter JU， Blatt MR(2004)A new catch inthe SNARE. Trends Plant Sci 9(4) :187-195)。 Collins 等 (2003 CollinsNC， Thordahl-Christensen H， Lipka V， Bau S， Kombrink E， Qiu J， Hiickelhoven R， Stein M， Freialdenhoven A， SomervilleSC， Schulze-Lefert P(2003) SNARE—protein—mediated disease resistance at the plant cell wall. Nature 425: 973-977)在研究与大麦非寄主抗性相关基因HvSyp121时，发现其突变体叶片被侵染 部位聚集大量载着&02的囊泡，推测突变体细胞中囊泡未能与质膜融合，11202介导的抗 病信号传导途径受阻，使得病原菌分泌的有毒物质进入植物体内致病(Dangl et al.， 2001 Dangl 几，Jones JD(2001)Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature 411 :826-833 ;Tsanko et al. ，2005Tsanko SG， Jacques H(2005) Hydrogen peroxide as a signal controlling plant programmed cell death. J Cell Biol 168(1) :17-20)。表明植物中SNARE蛋白与植物的基本抗病性即非寄主抗性相关。
发明内容
技术问题 本发明的目的在于公开水稻SNARE蛋白基因0sSYP71的抗病性基因工程应用，该
3基因来自水稻，可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，进行植物品种改良。
技术方案 水稻SNARE蛋白基因0sSYP71的基因工程应用，包括 1)总RNA的提取选用水稻抗稻瘟病菌品种"黑壳子粳"(太湖流域粳稻地方品种)， 待水稻幼苗长至3-4叶期，用稻瘟病菌孢子(5X104！111—1)接种处理，24小时后立即取叶片液 氮冷冻，保存于-8(TC冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1. 5mL EP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量； 2)水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的克隆以拟南芥基因AtSYP71 (Suwastika etal. ，2008 S丽stika N， Uemura T， Shiina T， Sato MH， Takeyasu K (2008) SYP71 ， a plant—specific Qc—SNARE Protein, reveals dual localization to the plasma membrane and the endoplasmic reticulum in Arabidopsis.Cel1 structure andfunction 33 :185-192)序列为探针，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到 1134bp水稻SNARE蛋白基因0sSYP71的全长序列，并设计两端引物
PI:5-TTGCTTGCTTCCTCCCG-3，
P2 :5-TGTTTGATACGCTCTTGCTAA-3。 将步骤1)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶进 行PCR扩增，PCR程序如下94 °C预变性5分钟，94 °C变性45s ， 56 °C复性lmin， 72 °C延伸 1. 5min， 35个循环后，72"延伸5min，最后Tag酶72"保温10min。扩增片段大小为1134bp， 末端加A后克隆至pGEM-T载体，委托上海生工公司测序获得水稻SNARE蛋白基因0sSYP71 的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ; 3)植物表达载体的构建根据水稻SNARE蛋白基因0sSYP71的cDNA序列SEQID NO. 1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上分别引入限制 性内切酶位点Kpn I和Xba I， P3和P4引物序列为
P3 :5-AGGTACCATGAGCGTGATCGACAT-3，
P4 :5-ATCTAGATCACTTTTTTAGAACATTG-3 以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，扩增片段大小为 821bp(包含0sSYP71的编码区序列且两端引入了酶切位点)，将该片段克隆至中间载体 pGEM-T，利用引入的限制性内切酶位点Kpn I和Xba I进一步将0sSYP71克隆到双元表达 载体pCAMBIA1301，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确； 4)转基因植株的获得将步骤3)获得的表达载体pCAMBIA1301转入农杆菌 LBA4404 ，进 一 步转入水稻感稻瘟病菌品种"苏御糯"，对获得的转基因植株进行PCR ， Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价，将生长至3_4叶期的转基因T2 代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病 斑长度，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。
有益效果 1、本发明公开了水稻SNARE蛋白基因0sSYP71及其所编码的蛋白质。水稻SNARE 蛋白基因0sSYP71为水稻中首次报道，基因芯片和mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接 种诱导，转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病菌的抗性。因此有望可作 为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。
2、本发明的0sSYP71基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密 码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉 米、小麦等单子叶植物。 3、对获得的转基因植株进行PCR， Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗 病性评价。将生长至3-4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植 株的平均病级数为2. 1级，发病叶片平均病斑数目为4. 2个及病斑平均长度为0. 47mm，而对 照植株的平均病级数为7级以及发病叶片平均病斑数目为42个及病斑平均长度为5. OOmm， 结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。 4、利用本发明0sSYP71基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种
启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载
体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可
使用选择性标记包括具有抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如P-葡糖醛酸糖苷酶
GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。 所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌
介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
具体实施例方式
1)选用水稻品种"黑壳子粳"(为太湖流域粳稻地方品种，为抗稻瘟病菌品种)， 待水稻幼苗长至3-4叶期后，用稻瘟病菌孢子进行接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷 冻，保存于-8(TC冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1. 5mL EP管 (TRIzol Reagents,购自Invitrogen， USA)，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量。
以拟南芥基因AtSYP71 (Swastika et al.，2008 Suwastika N，Uemura T，Shiina T， Sato MH， Takeyasu K(2008)SYP71， a plant-specific Qc-SNARE Protein, reveals dual localization to the plasma membrane and the endoplasmic reticulum in Arabidopsis. Cell structure and function 33 :185-192)序列为探针，搜索水稻基因组 序列和EST序列数据库，拼接得到1134bp水稻SNARE蛋白基因0sSYP71的全长序列，并设 计两端引物PI :5-TTGCTTGCTTCCTCCCG-3， P2 :5-TGTTTGATACGCTCTTGCTAA-3，以总RNA反转 录合成的cDNA第一链为模板用高保真Pfu酶(购自Roche)进行PCR扩增，PCR程序如下 94t:预变性5分钟，94t:变性45s，56t:复性lmin，72t:延伸1. 5min， 35个循环后，72"C延伸 5min，最后Tag酶(购自天根公司，北京)72。C保温10min。扩增片段大小为1134bp，末端加 A后克隆至pGEM-T载体(购自Promega)，委托南京金思特公司测序获得水稻SNARE蛋白基 因0sSYP71的cDNA序列。 分析上述获得的水稻SNARE蛋白基因0sSYP71的cDNA序列SEQ ID NO. 1及其编 码蛋白SEQ ID N0.2，该基因编码的蛋白序列与拟南芥AtSYP71蛋白序列的一致性为55X， 在C端都存在保守结构域Qc-SNARE结构域和跨膜结构域。 2)用步骤1)中设计的引物P1、P2进行半定量RT-PCR分析接种处理后水稻3_4叶 期地上部幼苗的表达，结果表明，接种稻瘟病菌孢子3小时后0sSYP71的表达增强，接种处 理24h后表达增强最明显，经灰度扫描分析，其mRNA表达量为对照的4倍，表明0sSYP71基 因的表达与稻瘟病菌处理有关。
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3)根据步骤1)得到的0sSYP71的全长序列(见SEQ ID NO. 1)，设计扩增出完整
编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上分别引入限制性内切酶位点Kpn I
和Xba I， P3和P4引物序列为P3 :5-AGGTACCATGAGCGTGATCGACAT-3,P4 :5-ATCTAGATCACTTTTTTAGAACATTG-3 以步骤1)中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，扩增片段大小为821bp(包 含0sSYP71的编码区序列且两端引入了酶切位点)，将该片段克隆至中间载体pGEM-T， 利用引入的限制性内切酶位点Kpn I和Xba I进一步将OsSYP71克隆到双元表达载体 pCAMBIA1301 (上海二医新生基因科技有限公司)，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框 架正确，再将其转入农杆菌LBA4404，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种"苏御糯"(太湖流 域粳稻地方品种)，对获得的转基因植株进行PCR， Southern杂交以及RT-PCR验证后进行 水稻的抗病性评价。将生长至3-4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7 天后调查植株的平均病级数为2. 1级，发病叶片平均病斑数目为4. 2个及病斑平均长度为 0. 47mm，而对照植株的平均病级数为7级以及发病叶片平均病斑数目为42个及病斑平均长 度为5. OOmm，结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。
综上所述，本发明人提供的0sSYP71基因是首次在水稻中分离的新基因，为水稻 中首次报道，其功能与水稻抗病性相关，可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进 行植物品种改良。可利用本发明OsSYP71基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用 任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子， 该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞 的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖 苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表 达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪 法、花粉管通道法或其它方法转化植物。序列表〈110〉南京农业大学〈120〉 一种水稻SNARE蛋白基因的抗病性基因工程应用〈130〉说明书〈140>00〈141>2010-01-14〈160>6〈170>PatentIn version 3. 4〈210>1〈211>1134〈212>DNA〈213〉0ryza sativa(水稻)〈220〉〈221>5' UTR〈222〉 (1) (90)
〈220〉〈221>CDS〈222>(91). (897)〈220〉〈221>3'UTR〈222〉 (898) .,(1134)〈400>1ttgcttgcttcctcccgaat cctcgcctcg atctcgctcg cgggcgggcg gagggatcgt60gatcgggatcgggatcgggg gcgcgcgaag atg age gtg ate gac ate etc3Cg
114Met Ser Val lie Asp lie LeuThr1 5egggtgg￡lCtec ate tgc朋g朋g tec gac朋g tec gac gtc gag agg162ArgValAspSer lie Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Tyr Asp Val Glu Arg1015 20etc朋cggcgcc aac gtc gcc ggc gag gac ccc ttc gcc cgc etc tec210LeuAsnGlyAla Asn Val Ala Gly Glu Asp Pro Phe Ala Arg Leu Tyr253035 40ggctecategac gcc gac ate aac gaa tgc gtc gag aaa gcg gag gcg258GlySerlieAsp Ala Asp lie Asn Glu Cys Val Glu Lys Ala Glu Ala4550 55gcg朋gCElggag aag aac cgc gcc acg gtg gtc gcg etc aac gcg gag306AlaLysGinGlu Lys Asn Arg Ala Thr Val Val Ala Leu Asn Ala Glu6065 70ateeggCg￡lacc aag gcc aag etc gtc gag gag gac ctg ccc aag ctg354lieArgArgThr Lys Ala Lys Leu Val Glu Glu Asp Leu Pro Lys Leu7580 85CElgcgcetcgCg Ctg朋g朋g gtC 333 ggg CtC 3C3 3朋gag g朋etc402GinArgLeuAla Leu Lys Lys Val Lys Gly Leu Thr Lys Glu Glu Leu9095 100gcg3CCcgtagt gat ctg gtt get gcc tte ccc gat aga ata caa tea450AlaThrArgSer Asp Leu Val Ala Ala Leu Pro Asp Arg lie Gin Ser105110 115 120ateCC3gatggt agt tea agt gca aag aaa aat ggg act tgg ggc gcc498lieProAspGly Ser Ser Ser Ala Lys Lys Asn Gly Thr Trp Gly Ala125130 135teateccgt act ggt gga gcc att aag ttt gac act tct gat ggc546SerGlySerArg Thr Gly Gly Ala lie Lys Phe Asp Thr Ser Asp Gly
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354045Glu CysValGluLys AlaGlu Ala AlaLysGinGluLysAsnArgAla505560Thr ValValAlaLeu AsnAla Glu lieArgArgThrLysAlaLysLeu65707580Val GluGluAspLeu ProLys Leu GinArgLeuAlaLeuLysLysVal859095Lys GlyLeuThrLys GluGlu Leu AlaThrArgSerAspLeuValAla100105110Ala LeuProAspArg lieGin Ser lieProAspGlySerSerSerAla115120125Lys LysAsnGlyThr TrpGly Ala SerGlySerArgThrGlyGlyAla130135140lie LysPheAspThr SerAsp Gly AsnPheAspAspGluTyrPheLys145150155160Gly ThrGluGluSer AsnGin Phe ArgArgGluTyrGluMetArgLys165170175Met LysGinAspGlu GlyLeu Asp lielieGlyGluGlyLeuGluThr180185190Leu LysAsnMetAla SerAsp Met AsnGluGluLeuAspArgGinVal195200205Pro LeuMetAspGlu MetAsp Glu LysValAspArgAlaAsnThrAsp210215220Leu LysAsnThrAsn ValArg Leu LysGluThrValLeuGinLeuArg225230235240Ser SerArgAsnPhe Cyslie Asp lieValLeuLeuCysVallieLeu245250255Gly lieAlaAlaTyr LeuTyr Asn ValLeuLysLys260265〈210>3〈211>17〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉引物Pl〈222〉 (1〕 (17)〈400>3ttgcttgctt cctcccg〈210>4
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〈211>21〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉引物P2〈222〉 (1) . (21)〈400>4tgtttgatac gctcttgcta〈210>5〈211>24〈212>DNA〈213〉人工合成<220>〈221〉引物P3〈222〉 (1) . (24)〈400>5aggtaccatg agcgtgatcgacat〈210>6〈211>26〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉引物P4〈222>(1). . (26)〈400>6atctagatca cttttttagaacattg
权利要求
水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的基因工程应用，包括1)总RNA的提取选用水稻抗稻瘟病品种“黑壳子粳”，待水稻幼苗长至3-4叶期，用稻瘟病菌孢子5×104ml-1接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于-80℃冰箱，取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量；2)水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的克隆设计两端引物P15-TTGCTTGCTTCCTCCCG-3，P25-TGTTTGATACGCTCTTGCTAA-3将步骤1)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶进行PCR扩增，PCR程序如下94℃预变性5分钟，94℃变性45s，56℃复性1min，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸5min，最后Tag酶72℃保温10min末端加A后克隆至pGEM-T载体，测序获得水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的cDNA序列SEQ ID NO.1；3)植物表达载体的构建根据水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的cDNA序列SEQ ID NO.1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上分别引入限制性内切酶位点Kpn I和Xba I，P3和P4引物序列为P35-AGGTACCATGAGCGTGATCGACAT-3，P45-ATCTAGATCACTTTTTTAGAACATTG-3以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsSYP71的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，利用引入的限制性内切酶位点Kpn I和Xba I进一步将OsSYP71克隆到双元表达载体pCAMBIA1301，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确；4)转基因植株的获得将步骤3)获得的表达载体pCAMBIA1301转入农杆菌LBA4404，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价，将生长至3-4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。
全文摘要
本发明公开了一种水稻SNARE蛋白基因的抗病性基因工程应用，属于生物技术领域。该基因的cDNA序列及其编码氨基酸序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.。本发明涉及基因OsSYP71为水稻中首次报道的Qc-SNARE蛋白基因，基因芯片结果和mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种诱导。转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病的抗病性。因此，OsSYP71可作为目的基因导入植物，提高植物的抗病性。
文档编号C12N15/82GK101787370SQ20101010826
公开日2010年7月28日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者孙姝璟, 张红生, 王州飞, 王建飞, 鲍永美, 黄骥 申请人:南京农业大学