专利名称：花生条纹病毒的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒的检测方法，尤其涉及一种基于环介导逆转录等温扩增技术 的花生条纹病毒的检测方法。
背景技术：
花生条纹病毒(Peanut stripe virus，PStV)引起的花生条纹病病毒，广泛分布在 东亚和东南亚花生生产国，近些年传播到美国、印度和塞内加尔，引起国际社会的关注。PStV是我国花生生产上分布最广泛的一种病毒病害，在我国北方花生主产区，一 般发病率在50%以上，不少地块达到100%，早期感病可以造成20%左右花生产量损失。 PStV存在不同症状类型株系，在中国占优势的轻斑驳株系，由于引起花生症状较轻，并且与 其它花生病毒症状类似，不易分辨。由此对花生的带毒情况及时准确了解就显得尤为重要， 及时做好检测预报工作并对症用药成为重中之重。目前主要利用RT-PCR方法对PStV进行 检测。RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。 首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技 术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克 隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。但 是RT-PCR技术成本高，不适合大批量检测样品。
发明内容
本发明的技术效果能够克服上述缺陷，提供一种花生条纹病毒快速检测方法，其 基于环介导逆转录等温扩增技术，能够快速、准确检测出花生条纹病毒。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案其包括如下步骤A.采集花生叶片；B.提取叶片样品的总RNA;C.建立25 μ 1环介导逆转录等温扩增反应体系；D.恒温反应，观察反应结果。本发明是对目前PStV检测方法的改进和补充，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优 势。主要体现在以下方面(1)扩增反应只有在4条引物完全与靶序列的六个结合区匹配的 情况下才能顺利进行，增强了检测反应的特异性，减少了干扰；(2)该技术省略了单独的逆 转录和巢式PCR的两次扩增步骤，只需一步就可以完成实验操作，没有核酸的变复性过程， 减少了 RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性；(3)扩增过程在恒温 进行，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求；(4)较RT-PCR技术缩短了检测所需时间。环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)技术采用一套分别识别目的基因中6个区段的 内、外引物，加入逆转录酶，通过Bst DNA聚合酶的链置换及恒温扩增功能进行核酸扩增反 应，反应产物由茎环状重复序列组成，在凝胶电泳中呈特殊的阶梯状条带。与RT-PCR方法相比，RT-LAMP技术特异性强、灵敏度高，操作简单方便，反应时间缩短，无需贵重的仪器，反 应结果肉眼即可鉴别，在基层检测中具有相当的优势。 通过Blast、DNAStar和Primer5. 0程序，选择花生条纹病毒PStV的CP基因保守 序列，设计4条特异性引物，包扩2条外引物(F3、B3)和2条内引物(FIP、BIP)。引物具体 序列如下
引物名称序列(5’——3’ )
F3GATTGCTCCGGAATTTGAGG
Β3GTGCCTTTCAGTATTCTCGC
FIPGCTTCCCTTGCACGATCTGATG--CTAGCTCGCTACGCTTTCG
BIPAGTAGCACAGATGAAGGCAGCA--CCACATTCCCATCAAGTCCA
恒温反应的温度为60°C -68°C ；恒温反应的时间为30-90分钟。建立了如下检测过程利用Trizol RNA提取方法，获得待测样品的总RNA，进行 RT-LAMP反应，反应结果进行1. 5%琼脂糖电泳检测；或加入荧光染料SYBRGREEN I，肉眼观 测。本发明主要用于花生条纹病毒快速、准确检测，可用于基层及检疫部门及时检测 预警，并尽早防患于未然，减少花生带毒数量，及时防治健康花生植株的感染。本方法方便 检疫部门及基层及时测定花生花纹病在花生中的病情，阻止带病植株危害健康植株，防止 病毒的扩散，做好疫情预报及预防工作。
具体实施例方式实施例1本方法包括如下步骤A.采集可能感染PStV的花生叶片；B.用TransGen公司的Trizol试剂，按照使用说明，利用Trizol RNA提取方法，提 取叶片样品的总RNA ；C.建立25 μ 1 RT-LAMP反应体系，见下表，阴性对照中总RNA用水代替ComponentVolume
总 RNA5 μ 1
10 χ Bst Buffe2. 5 μ 1
dNTPs(10 mmol/L)2.5 μ 1 MgSO4 (100 mmol/L) 2 μ 1Β3、F3(10 pmol/ μ 1)0. 5 μ 1
ΒΙΡ、FIP (20 pmol/μ 1)2 μ 1
Betaine (5 μ mol/ μ L)5 μ 1
逆转录酶(IOU/juL)1 μ 1
Bst DNA polymerase (8U/ μL)1 μ 1
Total25 μ 1扩增反应中设计四条特异性引物，包扩两条外引物和两条内引物。两条外引物分 别为 F3、B3，其中 F3 的序列为 GATTGCTCCGGAATTTGAGG，B3 的序列为 GTGCCTTTCAGTATTCTCGC。 两条内引物分别为 FTP、BIP，其中 FIP 的序列为 GCTTCCCTTGCACGATCTGATG-CTAGCTCGCTACG CTTTCG, BIP 的序列为 AGTAGCACAGATGAAGGCAGCA-CCACATTCCCATCAAGTCCA。D. 65°C恒温反应60分钟后，观察反应结果。反应结果进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳， 如果出现连续的梯状条带，说明待测样品含有PStv,阴性对照无梯状条带。实施例2方法包括如下步骤A.采集花生叶片；B.提取叶片样品的总RNA;C.建立25 μ 1环介导逆转录等温扩增反应体系；D.恒温反应，观察反应结果。利用Trizol RNA提取方法，获得叶片样品的总RNA。恒温反应的温度为60°C。恒 温反应的时间为90分钟。直接在反应结果中添加SYBR GREEN I (Invitrogen)荧光染料， 肉眼观察阳性反应发出绿色特异性荧光，对照无绿色荧光。实施例3本方法包括如下步骤A.采集花生叶片；B.提取叶片样品的总RNA;C.建立25 μ 1环介导逆转录等温扩增反应体系；D.恒温反应，观察反应结果。
利用Trizol RNA提取方法，获得叶片样品的总RNA。恒温反应的温度为68°C。恒 温反应的时间为30分钟。反应结果进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，如果出现连续的梯状条带， 说明待测样品含有PStV，阴性对照无梯状条带。
权利要求
一种花生条纹病毒的快速检测方法，其特征在于包括如下步骤A.采集花生叶片；B.提取叶片样品的总RNA；C.建立25μl环介导逆转录等温扩增反应体系；D.恒温反应，观察反应结果。
2.根据权利要求1所述的花生条纹病毒的快速检测方法，其特征在于扩增反应中设计 四条特异性引物，包扩两条外引物和两条内引物。
3.根据权利要求2所述的花生条纹病毒的快速检测方法，其特征在于两条外引物分别 为 F3、B3，其中 F 3 的序列为 GATTGCTCCGGAATTTGAGG，B 3 的序列为 GTGCCTTTCAGTATTCTCGC。
4.根据权利要求2所述的花生条纹病毒的快速检测方法，其特征在于两条内引物分别 为 FIP、BIP，其中 FIP 的序列为 GCTTCCCTTGCACGATCTGATG-CTAGCTCGCTACGCTTTCG，BIP 的序 列为 AGTAGCACAGATGAAGGCAGCA-CCACATTCCCATCAAGTCCA。
5.根据权利要求1所述的花生条纹病毒的快速检测方法，其特征在于利用TrizolRNA 提取方法，获得叶片样品的总RNA。
6.根据权利要求1所述的花生条纹病毒的快速检测方法，其特征在于恒温反应的温度 为 60°C -68°C。
7.根据权利要求3所述的花生条纹病毒的快速检测方法，其特征在于恒温反应的时间 为30-90分钟。
8.根据权利要求1所述的花生条纹病毒的快速检测方法，其特征在于反应结果进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳。
9.根据权利要求1所述的花生条纹病毒的快速检测方法，其特征在于直接在反应结果 中添加SYBR GREEN I荧光染料。
全文摘要
本发明涉及一种病毒的检测方法，尤其涉及一种基于环介导逆转录等温扩增技术的花生条纹病毒的检测方法。本发明的花生条纹病毒的快速检测方法，包括如下步骤A.采集花生叶片；B.提取叶片样品的总RNA；C.建立25μl环介导逆转录等温扩增反应体系；D.恒温反应，观察反应结果。本发明主要用于花生条纹病毒快速、准确检测，可用于基层及检疫部门及时检测预警，并尽早防患于未然，减少花生带毒数量，及时防治健康花生植株的感染。本方法方便检疫部门及基层及时测定花生花纹病在花生中的病情，阻止带病植株危害健康植株，防止病毒的扩散，做好疫情预报及预防工作。
文档编号C12Q1/70GK101928783SQ201010107988
公开日2010年12月29日 申请日期2010年2月4日 优先权日2010年2月4日
发明者刘媛媛, 李向东, 樊堂群, 蒋春姬, 谢宏峰, 迟玉成 申请人:山东省花生研究所