去细胞神经水凝胶用于制备周围神经损伤修复组合物的用途的制作方法

本发明属于生物医用复合材料领域，具体涉及去细胞神经水凝胶用于制备周围神经损伤修复组合物的用途

背景技术：

以壳聚糖、胶原等生物材料为基质制备的生物水凝胶不仅在化学性质上具有良好的生物相容性，在物理性质上又类似于细胞外基质，因此被广泛应用于创面敷料、组织工程支架等领域。而在水凝胶当中负载各种神经营养因子能进一步促进神经的生长。

CN102657874A公开了一种用于修复神经损伤的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1RNAi复合物及其制备方法。该文献公开了采用Lingo-1RNAi联合水凝胶生物支架及释放的策略，RNAi干扰Lingo-1协同水凝胶促进脊髓损伤轴突再生。

CN103951831A公开了一种丝胶蛋白水凝胶的制备方法，该方法首先称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，经过LiBr或LiCl提取，透析纯化得到非降解的质量百分浓度为0.1～4％的丝胶蛋白水溶液；然后将丝胶蛋白水溶液浓缩至1.5～10.0％，向浓缩后的丝胶蛋白水溶液中加入交联剂(每1mL丝胶蛋白水溶液加入2～500μL的交联剂)，充分混匀后置于4～45℃下5秒～36小时，得到水凝胶。

CN105169483A公开了一种利用脱细胞技术处理天然的组织或器官，经过后续打粉、酶消化处理得到脱细胞基质溶液，通过温和的条件即可将脱细胞基质溶液制备得到各种形状和性质的脱细胞基质凝胶，该发明制备方法制备得的脱细胞基质凝胶可用于可注射凝胶以及可加工成型凝胶两个方面，并且形成的凝胶具有微观的纳米纤维结构，该微观结构对于调节细胞的行为具有积极效应。但该技术方案中并未公开该脱细胞基质凝胶能够修复周围神经组织损伤。

人工合成的水凝胶由于成份简单，难以仿生神经再生的复杂微环境。添加各种神经营养因子的水凝胶虽然可以促进轴突的生长，但同时也促进了神经元过度分支以及神经突起之间相互形成突触，对中枢神经来说神经元之间的突触形成是神经组织发挥正常功能的必要条件，但对外周神经来说，如果神经纤维在走形过程中相互之间形成大量的突触连接则会造成病理性神经痛和神经瘤影响神经正常的感觉和运动功能，如何优化水凝胶的生物学功能使其适应周围神经再生需求将是未来的研究方向。

技术实现要素：

为解决现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种能够仿生周围神经再生微环境，促进神经纤维再生和髓鞘化的同时抑制异常突触的形成，减少病理性神经痛和神经瘤的发生率提高神经再生质量的周围神经损伤修复组合物。

本发明提供了一种去细胞神经水凝胶用于制备周围神经损伤修复组合物的用途。

所述去细胞神经水凝胶的制备方法包括以下步骤：

1)取新鲜周围神经，在手术显微镜下剪去表面的脂肪组织和部分神经外膜，将处理后的神经置蒸馏水中震荡、漂洗6h；

2)萃取：将神经放入3％的Triton X100水溶液中振荡12h，然后在蒸馏水中漂洗3次，再放入4％的脱氧胆酸钠水溶液中室温下震荡24h，最后在蒸馏水中漂洗3次；如此循环两次萃取过程；

3)冻干：将萃取后的神经放入乙醇、二氯甲烷的混合溶液中脱脂，再次冻干后研磨成粉末；

4)溶解与消化：将冻干后的粉末加入盐酸溶液溶解后得到脱细胞基质，在脱细胞基质中加入胃蛋白酶得到消化液，室温下搅拌12-24h后，-40℃环境下储存待用；

5)用NaOH溶液调节使消化液pH＞8，再调至pH＝7.4，得到预凝胶溶液；在4℃下，将10xPBS加入到已调至中性的预凝胶溶液中。

6)将预凝胶溶液于37℃下培养，即得到去细胞神经水凝胶。

优选地，步骤3)中所述乙醇与二氯甲烷的体积比为1:2；

优选地，步骤4)中胃蛋白酶与脱细胞基质的质量比为1:10；

优选地，步骤5)中10xPBS与预凝胶溶液的体积比为1:9。

优选地，所述去细胞神经水凝胶用于促进轴突的延伸。

优选地，所述去细胞神经水凝胶用于促使细胞有序排列。

优选地，所述去细胞神经水凝胶用于促进施万细胞沿着轴突迁移贴附。

优选地，所述去细胞神经水凝胶用于促进施万细胞对神经突起的包卷。

优选地，所述去细胞神经水凝胶用于抑制神经突起之间形成突触。

优选地，所述去细胞神经水凝胶用于修复周围神经的方法如下：通过浸泡，涂抹或注射，填充到现有周围神经移植物的孔隙当中。

本发明的有益效果：

1)促进轴突的延伸以及髓鞘化，同时下调神经元的PSD95表达水平，抑制神经突起之间形成突触的能力。

2)电生理实验证明去细胞神经水凝胶虽然抑制神经元之间突触的形成但并不影响其动作电位的产生及沿轴突的传导，能够较好地修复周围神经损伤。

附图说明

图1是去细胞神经水凝胶对轴突生长的影响实验结果示意图；

图2是去细胞神经水凝胶对施万细胞排列的影响实验结果示意图；

图3是去细胞神经水凝胶对施万细胞沿着轴突迁移的影响实验结果示意图；

图4是去细胞神经水凝胶促进施万细胞包卷神经突起的实验结果示意图；

图5是去细胞神经水凝胶对DRG神经元体外形成突触能力的影响实验结果示意图；

图6是去细胞神经水凝胶对DRG神经元动作电位产生与EPSP的影响实验结果示意图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明：

实施例1：水凝胶的制备

去细胞神经水凝胶的制备方法如下：

1)取大鼠周围神经，在手术显微镜下剪去表面的脂肪组织和神经外膜，将处理后的神经置蒸馏水中震荡、漂洗6h；

2)萃取：将神经放入3％的Triton X100水溶液中振荡12h，然后在蒸馏水中漂洗3次，再放入4％的脱氧胆酸钠水溶液中室温下震荡24h，最后在蒸馏水中漂洗3次；如此循环两次萃取过程；

3)冻干：将萃取后的神经放入乙醇、二氯甲烷的混合溶液中脱脂，其中乙醇与二氯甲烷的体积比为1：2，然后冻干后研磨成粉末；

4)溶解与消化：将冻干后的粉末加入盐酸溶液溶解后得到脱细胞基质，在脱细胞基质中加入胃蛋白酶得到消化液，其中胃蛋白酶与脱细胞基质的质量比为1：10，室温下搅拌24h后，-40℃环境下储存待用；

5)用NaOH溶液调节使消化液pH＞8，再调至pH＝7.4，得到预凝胶溶液；在4℃下，将10xPBS加入到已调至中性的预凝胶溶液中，其中10xPBS与预凝胶溶液的体积比为1：9。

6)将预凝胶溶液于37℃下培养，即得到去细胞神经水凝胶。

实施例2：去细胞神经水凝胶对轴突生长的影响试验

取出生1天的大鼠DRG组织，分别种植在预先包被去细胞神经水凝胶(实施例1制备得到)、Ⅰ型胶原，两种不同水凝胶的6孔板中，37℃培养48h后PH显微镜观察拍照，实验结果如图1所示。

图中，A表示去细胞神经水凝胶包被的培养板上可见神经突起以DRG组织块为中心呈放射状长出，以组织块边界为参考绘制内圆，以神经突起生长可达最远处为半径绘制同心外圆。B表示局部放大图显示神经突起生长及细胞迁移情况，以DRG边界为起点测量神经突起所及最远处的距离。C、D分别显示光镜下的神经突起及NF200免疫荧光标记后的轴突。统计分析结果(E)显示去细胞神经水凝胶(1.35±0.13mm n＝5)促轴突再生能力与Ⅰ型胶原(1.45±0.22n＝5)类似，(P>0.05，无统计学差异)。结果表明：去细胞神经水凝胶具有与Ⅰ型胶原类似的促轴突延伸的能力。

实施例3：去细胞神经水凝胶对施万细胞排列的影响试验

将DRG组织块消化为单细胞悬液(主要包含DRG神经元与施万细胞)，分别种植在去细胞神经水凝胶(实施例1制备得到)、Matrigel(#356234，BD)及Ⅰ型胶原三种不同水凝胶预处理的24孔板中，贴壁培养2天+髓鞘化培养7天后观察。结果如图2所示。

由图知，去细胞神经水凝胶环境能诱导梭形细胞(经图3证明为施万细胞)线性排列呈现串珠样结构(箭头标记处)，视野中少见裸露的神经突起。而在Matrigel和Ⅰ型胶原包被的培养板中梭形细胞排列紊乱，同时可见大量裸露的神经突起。结果表明：去细胞神经水凝胶能够促使施万细胞有序的排列。

实施例4：去细胞神经水凝胶对施万细胞沿轴突迁移的影响试验

设三组处理组：去细胞神经水凝胶处理组、Matrigel处理组和Ⅰ型胶原处理组，三组实验分别使用去细胞神经水凝胶(实施例1制备得到)、Matrigel、Ⅰ型胶原铺板后培养施万细胞和DRG神经元。以NF200标记轴突(绿色)，MBP标记施万细胞(红色)，Hoechst33342标记细胞核(蓝色)，探讨三种物质对施万细胞沿着轴突迁移的影响，实验结果以免疫荧光图片显示，见图3。

图中显示了轴突与施万细胞的分布关系，其中去细胞神经水凝胶处理组(A1-A4)可见大量施万细胞贴附在轴突表面，而Matrigel处理组(C1-C4)和Ⅰ型胶原处理组(D1-D4)施万细胞与轴突相互独立分布。统计学分析结果(E)显示了贴付在轴突上的施万细胞占所有施万细胞的比例。结果表明：去细胞神经水凝胶促进施万细胞沿着轴突迁移贴附。

实施例5：去细胞神经水凝胶促进施万细胞包卷神经突起的试验

DRG与施万细胞在去细胞神经水凝胶(实施例1制备得到)、Matrigel、Ⅰ型胶原三种不同水凝胶预包被的培养板中贴壁培养2天+髓鞘化培养14天后行固定包埋，超薄切片(50nm)透射电子显微镜观察，结果如图4所示。

图中，A-G展示了去细胞神经水凝胶组神经突起与施万细胞的关系，A纵切面可见施万细胞(深色)沿着神经突起(浅色)外围将其包卷；B是突触样结构；C-F分别显示神经突起被施万细胞包卷及形成髓鞘的情况；G示意神经突起被施万细胞包卷的三种不同程度：全包卷(数字1)半包卷(数字2)裸露(数字3)；柱状图(H)显示去细胞神经水凝胶组有更多的神经突起被施万细胞全包卷和半包卷，相应的去细胞神经水凝胶组裸露神经突起所占比例47.0％要明显低于Matrigel组的70.1％，和Ⅰ型胶原组的67.7％，P<0.05，。结果表明：去细胞神经水凝胶能促进施万细胞对神经突起的包卷。

实施例6：去细胞神经水凝胶对DRG神经元体外形成突触能力的影响试验

将DRG神经元与施万细胞分别放在去细胞神经水凝胶(实施例1制备得到)、去细胞脊髓水凝胶、细胞外基质(Matrigel)和Ⅰ型胶原铺板的培养皿中培养7天，以Synapsin-1(红色)标记突触前成分，NF200(绿色)标记神经纤维，Hoechst-33342标记细胞核(蓝色)。结果如图5所示。

A-D显示Synapsin-1呈点状分布于较细的神经突起，及神经突起之间交叉部位。E显示了蛋白质印迹法(Western blot)定量检测DRG神经元被不同水凝胶处理后PSD95和syanpsin-1蛋白表达水平。F显示了Westernblot定量检测成年SD大鼠脊髓和坐骨神经组织中PSD95和syanpsin-1蛋白表达水平。统计学结果(G)显示去细胞神经水凝胶处理能明显降低DRG神经元PSD95表达水平。统计学结果(H)显示突触前成份蛋白Synapsin-1无明显改变。结果表明：去细胞神经水凝胶能够下调神经元的PSD95表达水平，抑制神经突起之间形成兴奋性突触，即去细胞神经水凝胶能够抑制周围神经损伤修复过程中异常突触的形成，减少神经瘤和神经痛的发生率，但如果用于中枢神经系统，其突触抑制作用会降低中枢神经元的可塑性。

实施例7：去细胞神经水凝胶对DRG神经元动作电位产生与EPSP的影响试验

去细胞神经水凝胶对DRG神经元动作电位产生与EPSP的影响，如图6所示，A1-A3分别显示去细胞神经水凝胶(实施例1制备得到)、Matrigel和Ⅰ型胶原环境中培养的神经元均检测到了三种典型的动作电位。B1显示去细胞神经水凝胶环境中DRG神经元的EPSP波形。B2显示去细胞脊髓水凝胶环境中DRG神经元的EPSP波形。统计结果C显示去细胞神经水凝胶处理明显降低了DRG细胞EPSP的波幅(n＝5；p<0.01)。结果表明：细胞神经水凝胶虽然抑制神经元之间突触的形成但并不影响其动作电位的产生及沿轴突的传导，能够较好地修复周围神经。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。