一种肛瘘补片或栓、制备方法及其应用与流程

本发明属于生物医用材料的组织工程技术领域，具体涉及一种肛瘘补片或栓、制备方法及其应用。

背景技术：

肛瘘是肛周皮肤和直肠/肛管相通的一种慢性感染性管道，由内口、瘘管及外口三部分组成。大多数肛瘘为原发性肛瘘，即源于肛门腺的非特异性感染，形成肛门周围脓肿后的一种发展结果。肛瘘临床表现为反复发作的肛周感染、破溃流脓，长期不愈的病人可以发生肛周癌。肛瘘是常见的直肠肛管疾病之一，任何年龄都可发病，以30-50岁的男性多见，男：女为2：1。Sainio报告每年的发生率为8.6/10万。

目前肛瘘的传统治疗方法有以下所述的瘘管切除、瘘管切开、挂线疗法、瘘道旷置引流术、经肛直肠黏膜瓣内口修补术等方式。

肛瘘切开术：是将瘘管全部切开开放，通过肉芽组织生长使伤口愈合的方法，适用于低位肛瘘治疗，因瘘管在外括约肌深部以下，切开后只损伤外括约肌皮下部和浅部，不会出现肛门失禁。但存在创伤大、愈合时间长缺点。

肛瘘瘘管切除术：最早由Parks提出，作为一种治疗经括约肌高位瘘的手术方式。将瘘管管壁全部切除，直至健康组织，并使创面成为内小外大，以利引流。目前较适用于因炎性肠病、结核等疾病引起的继发性肛瘘，并常与其他术式联合应用。但同样存在创伤大、愈合时间长缺点。

挂线疗法：是目前临床上应用最广的手术方法，尤其适用于高位单纯性肛瘘。它是利用拉紧的橡皮筋使结扎处组织发生血运障碍，逐渐缺血坏死。由于挂线会导致局部纤维化和瘢痕形成，使组织在被切割过程中，基底创面同时开始逐渐愈合，从而避免肛门括约肌被切断后回缩，造成术后肛门失禁。但术后容易复发，复发率在2％-15％；此外，对于一些复杂性肛瘘的病人，由于手术导致术后肛门失禁的可能性较大。

肛瘘切除黏膜瓣成形术：Aguilar等借助插入瘘管的探针切开皮肤肛管和黏膜直到内口，从切开的内口远端开始游离黏膜和部分内括约肌，做成占直径周径1/3底宽上窄，呈梯形的中厚层黏膜瓣(包括部分内括约肌)，然后缝闭因内括约肌缺损的内口，抬高黏膜瓣覆盖内口，再将瓣缝到肛管末端，外面伤口开放引流，每天冲洗。但此术式的疗效存在争议，近年有研究报道其复发率较高，肛门失禁率最高可达到30％-40％以上。

生物蛋白胶治疗肛瘘：生物蛋白胶已广泛应用于手术创面止血、管道封填等多个学科领域。1992年，Hjortmp等首次应用纤维蛋白胶治疗会阴瘘获得成功。方法多是先用探针确定内口及外口，以刮匙搔扒瘘管内肉芽组织，再以双氧水及生理盐水反复冲洗后，注入生物蛋白胶，以肠线缝合关闭两端瘘口。生物蛋白胶在肛瘘的治疗上具有无副反应、无痛、操作简单、无肛门功能障碍等优点，但根据文献报道，成功率差异很大，愈合率从14％～90％不等，其复发率在15％～86％之间。而Buchanan通过对猪的肛瘘模型的组织学研究，发现术后瘘管周围出现的慢性炎症细胞的浸润，说明机体对纤维蛋白胶有排斥反应，这也会使其有效成分迅速减少，使治愈率降低。

生物材料填充治疗肛瘘：2005年，美国学者Lynn Oconnor等应用猪小肠黏膜制作的生物材料通过填塞的方法治疗20例因克罗恩病引起的肛瘘取得了成功(治愈率80％)，该方法具有痛苦小，成功率高，复发率小的优点，其有效性还须进一步研究。但该材料制作过程复杂，价格昂贵(约1万元人民币)。

上述方法共同的缺点是创伤大、愈合时间长(6-8周伤口愈合期)，部分病人可出现肛门功能受损(在高位复杂性肛瘘可大10-15％)，甚至大便失禁。而肛瘘术后创面愈合的快慢直接影响患者的生活质量及日常工作，传统的切开/切开挂线方式是将所发现的瘘道全部打开，创伤范围大且患者术后恢复周期长。因此，现有技术中面临的难题包括：如何有效减少切开范围以降低内口长时间开放所致的粪便及细菌进入瘘道导致的感染，从而有效缩短愈合时间；如何有效减少瘢痕，从而减少肛门变形；如何降低术后疼痛、控便能力、换药时间及影响工作时间等肛瘘相关症状。

针对上述问题，本领域出现了使用脱细胞异体真皮基质填塞治疗肛瘘的报道，由于治疗具有创伤小、痛苦轻、愈合快、低花费、无毒无排斥反应等特点，该治疗技术成为肛瘘患者临床治疗的一个新的选择。

公开号为CN101322856的中国专利申请记载了一种治疗肛瘘的生物填塞引流物，所述生物填塞物由脱细胞真皮制备获得，但所述制备中包括了将脱细胞真皮组织干燥后粉碎，再通过制备好的模具压制成生物填塞引流物的操作。上述粉碎塑形破坏了脱细胞真皮自然的组织结构，不利于新生细胞在真皮三维框架内生长，同时也破坏了组织原有的弹性、拉伸强度等自然属性，不利于手术操作使用，影响治疗效果。

公开号为CN103272276的中国专利申请记载了使用来源于动物小肠粘膜下层组织制备的脱细胞组织材料治疗肛瘘的生物栓，所述生物栓用于患者肛瘘治疗时，由于组织来源为近交系动物，存在免疫原性风险，且缺少异体真皮组织更优的细胞外基质结构特征。

王振军(中国临床医生，2008年第36卷第8期)、赵宝忠(求医问药，2011年第9卷第7期)、曾华(实用中西医结合临床，2012年第12卷第5期)、林家威(微创医学，2013年第8卷第6期)等研究者尝试使用脱细胞异体真皮基质填塞治疗肛瘘均取得了相较于手术治疗较好的效果，上述研究使用的脱细胞异体真皮基质来自市售产品，根据该产品相关的专利(ZL00120211.1)描述可知，该专利制备用作细胞种植框架和植入体的生物细胞外基质，主要制备方法包括固定剂固定、碱性溶液去细胞、氨基酸溶液孵育等，该专利中未提及用于肛瘘等疾病的治疗，由于肛瘘为管腔结构，尤其是瘘管较长、管腔较宽的严重肛瘘患者，异体真皮基质需要保持一定的韧性和牵拉性，才能避免出现撕裂脱除等现象。该专利制备方法中并未针对上述技术问题提出对应处理。

技术实现要素：

本发明为解决上述技术问题，提供了一种具备较高的韧性、弹性等生理特征更易于肛瘘患者尤其是严重肛瘘患者使用的脱细胞异体真皮基质及其相关产品。

为克服以上现有技术中肛瘘治疗方法的不足，本发明汲取生物蛋白胶和Lynn Oconnor的生物材料经验，引入蛋白酶消化处理和表面活性剂高渗联合处理、交联剂交联处理、氨基酸溶液营养等多步骤协同操作，发明制作了脱细胞异体真皮基质材料，并将其剪裁成肛瘘栓进行肛瘘的填塞治疗。脱细胞异体真皮基质取材于人体皮肤组织，经特殊的理化、生化处理，去除了可能引起免疫排异反应的所有成份，但完整地保留了原有组织的纤维立体支架结构，植入后很快有新生血管和成纤维细胞长入，取得了良好的临床效果。

本发明提供一种脱细胞异体真皮基质，其特征在于其是由异体皮经过蛋白酶溶液消化处理、含表面活性剂的高渗盐溶液脱细胞处理、交联处理、DNA降解处理、氨基酸营养处理获得。

本发明提供一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，具体步骤包括：

步骤一，将异体皮原料投入盛有蛋白酶溶液的容器中，浸泡振荡处理，得半成品A；

步骤二，将半成品A投入盛有含有表面活性剂和高渗盐溶液的容器中，超声浸泡处理；更换表面活性剂和高渗盐溶液，超声浸泡处理；重复该操作多次，得半成品B。

步骤三，将半成品B用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品C；

步骤四，将半成品C投入盛有交联剂溶液的容器中，浸泡,得半成品D；

步骤五，将半成品D取出投入盛有生理盐水溶液容器中浸泡，得半成品E；

步骤六，将半成品E投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，浸泡处理，得半成品F；

步骤七，将半成品F用生理盐水浸泡振荡处理，得半成品G；

步骤八，将半成品G取出，用氨基酸溶液浸泡后，投入盛有生理盐水溶液容器中，静置，得半成品H；

步骤九，将半成品H取出，包装，灭菌，得成品I。

本发明制备的脱细胞异体真皮基质的缝合强度为16N-20N、拉伸强度为3.0MPa-7.0MPa、拉伸伸长率为10％-28.9％。

在某些实施方式中，前述步骤一所述的蛋白酶选自胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶或其组合；优选地，所述蛋白酶溶液为0.1-0.3％胰蛋白酶-dispase酶溶液(w/v)，其中，胰蛋白酶与dispase酶的质量比是2-3:0.1-1.8，溶液pH值为7.0-8.0；最优选胰蛋白酶与dispase酶的质量比是2:1；或所述蛋白酶溶液为0.1-0.4％胰蛋白酶-木瓜蛋白酶溶液(w/v)，其中，胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为2-3:0.1-1.8，溶液pH值为6.0-8.0；或所述蛋白酶溶液为0.1％-0.3％胰蛋白酶-菠萝蛋白酶溶液(w/v)，其中，胰蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为2-3:0.1-1.8，溶液pH值为7.0-8.0。

在某些实施方式中，前述步骤二中表面活性剂和高渗盐溶液的配方是含有0.1-0.3g/L聚乙二醇与SDS，或含有0.1-0.3g/L聚乙二醇与Triton X-100的高渗盐溶液，其中，聚乙二醇选择分子量400-2000，聚乙二醇与SDS或与Triton X-100的质量比选择为40-60:60-40，高渗盐为50mM tris-HCl，1M氯化钠，10mM EDTA；优选聚乙二醇与SDS或与Triton X-100的质量比为50-60:50-40。

在某些实施方式中，前述步骤四中交联剂溶液的配方是用京尼平、戊二醛、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、一水吗啉乙磺酸中的一种或多种作为交联剂，交联剂与异体皮原料质量比为0.1-4：1；优选交联剂溶液的配方是用京尼平与选自戊二醛、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、一水吗啉乙磺酸任一作为交联剂，其中，京尼平与另一交联剂的质量比为1-6:1。上述低毒性的交联剂，在提高交联度的同时，进一步降低了产品的细胞毒性。

在某些实施方式中，前述步骤六中DNA水解酶溶液的配方是DNA水解酶浓度为2-10g/L，pH7.0-8.0；优选浓度为3-8g/L。

在某些实施方式中，前述步骤八中氨基酸溶液选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸、或其组合配制而成，氨基酸浓度为0.5-2g/L；优选由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸按照3-4:1.1-1.3:1.0-1.6：0.96-1.16:0.07-0.08质量比配制；更优选所述比例为3.3:1.1:1.3：0.96:0.07，氨基酸浓度为0.6-1.6g/L。

优选地前述步骤一中的浸泡振荡为浸泡3-6小时，振荡转速为50-200rpm，重复操作1-3次。

优选地前述步骤二中的超声浸泡条件为：30-60KHz，100-400W，超声5-10分钟，浸泡2-4小时，重复2-4次。

优选地前述步骤三中的振荡处理条件为振荡2小时，更换生理盐水，继续振荡处理，重复该操作4-6次。

优选地前述步骤四中的浸泡时间为3-6h。

优选地前述步骤五中的浸泡时间为8小时，浸泡次数为6-9次，浸泡温度为5-10℃。

优选地前述步骤七的条件为生理盐水浸泡10-12小时，振荡处理；更换生理盐水，振荡处理，重复该操作2-4次。

优选地前述步骤一、三、七中振荡转速为50-200rpm。

优选地前述步骤九的包装为将半成品H装入包装袋中，封口包装完毕；所述灭菌为钴-60照射，照射剂量为20-30kGy。

本发明还提供所述脱细胞异体真皮基质在制备治疗肛瘘的生物材料中的应用，所述治疗肛瘘的生物材料包括但不限于肛瘘补片、肛瘘栓等。将脱细胞异体真皮基质根据临床试剂的需要在无菌等合适的条件下制作成治疗肛瘘的补片或进一步制成肛瘘栓等方法和技术均属于本领域所公知的。

本发明另一方面提供一种肛瘘栓的制备方法，其是将前述制备获得的脱细胞异体真皮基质制成肛瘘栓。肛瘘栓的制备过程可选择为将脱细胞异体真皮经圈成圆锥形的细长圆锥体，再冻干而成。肛瘘栓优选成细长圆锥体，其尺寸大小可以根据肛瘘患者的严重程度及管腔大小裁减制作成适宜成品，通常圆锥体的底面直径0.4-2cm，高为8-12cm。

本发明另一方面提供一种肛瘘补片的制备方法，其是将前述制备获得的脱细胞异体真皮基质制成，所述肛瘘补片尺寸适宜制作成肛瘘栓使用，优选尺寸为宽1-5cm，长3-10cm。

本发明另一方面提供一种脱细胞异体真皮基质或肛瘘补片或肛瘘栓，所述脱细胞异体真皮基质或肛瘘补片或肛瘘栓根据前述方法制备获得。

本发明另一方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含前述的脱细胞异体真皮基质或肛瘘补片或肛瘘栓。试剂盒可根据具体需要进一步包含消化酶溶液冻干粉、手术刀片、无齿镊子、注射器、注射器针头、无菌水等相关配套器械或材料。

本发明另一方面提供一种治疗肛瘘疾病的应用。所述应用包括使用本发明制备的脱细胞异体真皮基质治疗肛瘘疾病，或使用本发明制备的脱细胞异体真皮基质制备治疗肛瘘的生物材料。上述治疗方法可选为填充法或填塞法。上述肛瘘可选为高位复杂性肛瘘或低位单纯性肛瘘；尤其是针对瘘管较长或瘘管管腔宽大的患者，更优选针对瘘管较长，直接切开易造成肛门变形和愈合时间延长的患者或瘘管管腔宽大，瘘壁自然愈合缓慢的患者或瘘道弯曲患者。

本发明所述的脱细胞异体真皮基质或肛瘘栓或肛瘘片在使用前需先进行如下操作：使用生理盐水浸泡2-3次，每次10-15分钟。

本发明制备方法针对肛瘘疾病的治疗需要改进和优化了制备工艺，包括引入蛋白酶消化组织细胞，利用表面活性剂和高渗盐在超声条件下进行脱细胞处理，并进一步与交联剂、氨基酸营养液等协同使用，联合选择DNA去除等操作，获得了适宜用于肛瘘治疗的脱细胞异体真皮基质材料。

对于外科手术使用的生物材料来讲，通常希望其具有某些特殊的机械性能以满足特定的使用用途。尤其是一些薄片组织材料，应当具有足够的强度来承受预期用途。对于肛瘘患者而言，由于肛瘘为管腔结构，尤其是瘘管较长、管腔较宽的严重肛瘘患者，异体真皮基质需要保持一定的韧性、牵拉性和柔软度，才能避免出现撕裂脱除等现象。通常使用脱细胞异体真皮基质材料进行肛瘘填塞治疗时，需要对基质材料的生物特性及术中可操作性进行评估。评估标准主要考虑脱细胞异体真皮的韧性和弹性，是否能够缝合、牵拉，便于临床操作。常规的分级包括满意、较满意、一般、不满意。满意：材料韧性和弹性良好、操作简单、便于缝合、牵拉；较满意：材料韧性和弹性尚可、操作尚可、适合缝合、牵拉；一般：材料韧性和弹性一般、缝合操作一般；不满意：材料韧性和弹性较差、临床使用可操作性差。

本发明通过蛋白酶处理脱细胞组织产品能够提高组织产品机械性能，如获得较好的弹性和韧性，提高组织的拉伸、撕裂、缝合强度；进一步的，使用交联剂处理增加胶原的强度，使真皮材料的力学性能更适用于肛瘘手术；同时交联剂的处理还能够延长组织在体内的降解和消化，利于血管化和组织转轨，适宜肛瘘患者较长时间使用组织材料的需求；同时混合氨基酸浸泡也能够进一步提高脱细胞异体真皮基质的柔韧性。进一步的，本发明将提高组织产品机械性能的方法与脱细胞异体真皮制备方法进行融合，并进行工艺的调整和改进，如将酶处理步骤与表面活性剂高渗溶液处理步骤进行顺序调整将会影响终产品的性能，在脱细胞处理中使用超声浸泡以及混合氨基酸溶液浸泡有利于改善终产品的性能等等。经过对工艺操作的不断筛选和优化，最终获得了本发明制备脱细胞异体真皮基质的方法，所述方法获得的脱细胞异体真皮基质其缝合强度为16N-20N、拉伸强度为3.0MPa-7.0MPa、拉伸伸长率为10％-28.9％，均能够满足前述肛瘘治疗用生物材料的生物特性和术中可操作性，达到满意级别，临床实验表明取得了很好的手术和治疗效果。

与现有技术相比，本发明具有显著的优点和有益效果。本发明脱细胞异体真皮充填修复的真皮填塞法(试验组)与传统切开法的标准治疗方案(对照组)相比，试验组平均愈合时间比对照组短6.5862天；术后3个月试验组瘢痕长度比对照组短1.4607；试验组发生轻微肛门变形的概率比对照组低43.22％。同时，临床试验显示，在术后1周、术后14天、21天和3个月的访视中，试验组与对照组的综合评分有显著差异，试验组术后的综合得分显著低于对照组，且在术后第21天的随访结束时试验组所有病例得分都趋于零；提示采用真皮治疗后，肛瘘相关症状要显著轻于对照组。

本发明的脱细胞异体真皮基质治疗肛瘘相对于传统手术治疗方法及现有同类真皮材料具有以下优点：(1)显著的简易和微创性：本方法简单易行、手术侵袭小、术后痛苦轻，不损害肛门功能也不会造成肛门畸形；(2)成功率高：本方法截至目前术后3个月愈合成功率为100％；(3)低花费和显著的社会效益：本方法治疗的病人与常规治疗病人的花费基本持平，但由于愈合快，可为每例病人节约3-4周的工作时间，具有显著的社会和经济效益；(4)具有良好的安全性，无细胞毒性和排斥反应；(5)采用本发明制备方法制作的脱细胞异体真皮质地柔软、有较强的韧性和牵拉性，可以满足肛瘘手术中牵拉、缝合的张力，不会出现撕裂脱出等现象；(6)本方法产品具备良好的组织相容性，所有患者真皮植入处生长良好，没有发现局部红肿、溢出脓性分泌物现象，后续亦未发生排异反应。

本发明产品适宜各种肛瘘患者的治疗，尤其适宜严重肛瘘患者的治疗，如以下情况：(1)瘘管较长，直接切开易造成肛门变形和愈合时间延长的患者；(2)特别适合瘘管管腔宽大，瘘壁自然愈合缓慢的患者；(3)瘘道弯曲患者。

附图说明

图1是本发明实施例5中脱细胞异体真皮充填修复的真皮填塞法(试验组)与传统切开法的标准治疗方案(对照组)的创面愈合效果分析结果。具体为试验组和对照组术后14天(d14)、术后21天(d21)、术后3个月(m3)的生存曲线进行比较，结果显示术后主要访视点两组愈合率分别为：图1A所示的术后14天(试验组6.90％，对照组3.33％)、图1B所示的术后21天(试验组75.86％，对照组16.67％)、图1C所示的术后3个月(试验组100％，对照组96.67％)；采用Log-rank检验，第二周的两组生存曲线无统计学差异，第三周和第3个月的两组生存曲线有统计学差异，试验组的生存曲线高于对照组，即试验组疗法优于对照组疗法。

图2是本发明实施例5中脱细胞异体真皮充填修复的真皮填塞法(试验组)与传统切开法的标准治疗方案(对照组)的瘢痕及肛门变形情况分析结果。图2A显示试验组手术切开当时瘘道切口及走向，可清楚看到瘘道较长；图2B显示试验组长瘘道使用真皮可帮助愈合而不用切开，预后良好，无瘢痕和变形；图2C显示对照组传统切开的大创面，瘘道全部打开创伤大且愈合困难。结果显示试验组采用真皮治疗肛瘘，可以有效减少瘢痕，没有明显的肛门变形，由于填塞真皮后加速愈合，从而保证了肛瘘治愈的稳定性。同时，试验组由于切开范围小，避免了对照组瘘道全部切开的大创面，而这种大创面的愈合是极难恢复的。

图3是本发明实施例5中脱细胞异体真皮充填修复的真皮填塞法(试验组)与传统切开法的标准治疗方案(对照组)的术后疼痛、控便能力、换药时间及影响工作时间等肛瘘相关症状的分析结果。图3A是分值与症状关系图，得分越低说明术后相关症状越轻，反之则差；总体分值越接近“0”，术后症状对日常生活造成的影响越小。临床试验显示，在术后1周、术后14天、21天和3个月的访视中，试验组与对照组的综合评分有显著差异，各访视点两组平均分值比较如图3B所示，能够看出，试验组术后的综合得分显著低于对照组，且在术后第21天的随访结束时试验组所有病例得分都趋于零；提示采用真皮治疗后，肛瘘相关症状要显著轻于对照组。

图4是本发明实施例6中脱细胞异体真皮充填修复的真皮填塞法的临床实例一。图4A为患者术前创面；图4B为术中探查及形成切口，术后次日创面；图4C为术后14天愈合，21天创面痕迹；图4D显示术后3月瘢痕不明显。结果显示，该患者术后21天观察创面愈合良好，无肛门变形，无周围组织和全身的反应，患者肛周功能恢复良好。术后3个月随访，伤口完全愈合，无明显瘢痕、无肛门变形，手术区域与周围组织已无明显差别。

图5是本发明实施例6中脱细胞异体真皮充填修复的真皮填塞法的临床实例二。图5A为患者术前探查，截石位7点距肛缘3cm处可见外口，瘘道长约4cm；图5B为患者在腰麻下行脱细胞异体真皮肛瘘填塞术；图5C显示术后3周创面愈合良好，无排异；图5D显示术后3月与周围组织已无明显差别。结果显示，该患者术后21天观察创面愈合良好，无肛门变形，无周围组织和全身的反应，患者肛周功能恢复良好。术后3个月随访，伤口完全愈合，无瘢痕、变形情况，手术创面与周围组织已无明显差别。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1脱细胞异体真皮基质的制备方法

本发明提供一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，具体的，优选制备实施例包括按顺序进行下列步骤：

将原料投入到0.2％胰蛋白酶-dispase酶溶液(w/v)浸泡振荡，其中，胰蛋白酶与dispase酶的质量比是2:1，用PBS缓冲溶液调pH值至7.4，振荡转速为100rpm,浸泡4小时，即得半成品A。

将半成品A投入盛有含有表面活性剂和高渗盐溶液的容器中，超声浸泡，得半成品B。超声浸泡条件为：40KHz，220W，超声6分钟，浸泡3小时，重复3次；含有表面活性剂和高渗盐溶液的配方是含有0.2g/L聚乙二醇与SDS其中，聚乙二醇选择分子量为1500，聚乙二醇与SDS的质量比为60:40，高渗盐为50mM tris-HCl，1M氯化钠，10mM EDTA。

将半成品B取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中，振荡，每振荡2小时，更换生理盐水溶液一次，共振荡4次，振荡转速为100rpm,得半成品C。

将C投入盛有交联剂溶液的容器中，浸泡4小时，交联剂为京尼平与1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，京尼平与1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量比为5:1，交联剂与异体皮原料质量比为0.8：1，浸泡5小时,得半成品D。

将D取出，投入另一盛有生理盐水溶液容器中5℃浸泡56小时，每隔8小时换一次生理盐水溶液，即得半成品E。

将半成品E取出，投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，25℃浸泡4小时，得半成品F，DNA水解酶溶液的浓度是5g/L，用PBS缓冲溶液调pH至7.2。

将半成品F取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中，振荡，每振荡2小时，更换生理盐水溶液一次，共振荡3次，振荡转速为100rpm,得半成品G。

将半成品G取出，投入盛有氨基酸溶液的容器中，于5℃条件下浸泡3次，每次浸泡2.5小时，将处理后的半成品G取出，投入生理盐水溶液中，即得半成品H，氨基酸溶液的浓度为1.5g/L，氨基酸溶液的配方是由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸按照3.3:1.1:1.3：0.96:0.07质量比配制。

将半成品H取出装入包装袋中，铺平，封口，进行钴-60照射，照射剂量为20-30kGy,取出，终得成品I。

实施例2脱细胞异体真皮基质的制备方法

本发明提供一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，具体的，优选制备实施例包括按顺序进行下列步骤：

将原料投入到0.3％胰蛋白酶-木瓜蛋白酶溶液(w/v)，浸泡振荡，其中，胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比是2.5:1，用PBS缓冲溶液调pH值至7.2，振荡转速为100rpm,浸泡4小时，即得半成品A。

将半成品A投入盛有含有表面活性剂和高渗盐溶液的容器中，超声浸泡，得半成品B。超声浸泡条件为：50KHz，220W，超声5分钟，浸泡2小时，重复4次；含有表面活性剂和高渗盐溶液的配方是含有0.2g/L聚乙二醇与Triton X-100其中，聚乙二醇选择分子量为1000，聚乙二醇与Triton X-100的质量比为50:50，高渗盐为50mM tris-HCl，1M氯化钠，10mM EDTA。

将半成品B取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中，振荡，每振荡2小时，更换生理盐水溶液一次，共振荡4次，振荡转速为100rpm,得半成品C。

将C投入盛有交联剂溶液的容器中，浸泡4小时，交联剂为京尼平与N-羟基丁二酰亚胺，京尼平与N-羟基丁二酰亚胺的质量比为6:1，交联剂与异体皮原料质量比为0.6：1，浸泡5小时,得半成品D。

将D取出，投入另一盛有生理盐水溶液容器中5℃浸泡56小时，每隔8小时换一次生理盐水溶液，即得半成品E。

将半成品E取出，投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，20℃浸泡4小时，得半成品F，DNA水解酶溶液的浓度是6g/L，用PBS缓冲溶液调pH至7.2。

将半成品F取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中，振荡，每振荡2小时，更换生理盐水溶液一次，共振荡3次，振荡转速为100rpm,得半成品G。

将半成品G取出，投入盛有氨基酸溶液的容器中，于4℃条件下浸泡3次，每次浸泡3小时，将处理后的半成品G取出，投入生理盐水溶液中，即得半成品H，氨基酸溶液的浓度为1.5g/L，氨基酸溶液的配方是由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸按照4:1.3:1.0：1.16:0.08质量比配制。

将半成品H取出装入包装袋中，铺平，封口，进行钴-60照射，照射剂量为20-30kGy,取出，终得成品I。

实施例3脱细胞异体真皮基质的制备方法

本发明提供一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，具体的，优选制备实施例包括按顺序进行下列步骤：

将原料投入到0.2％胰蛋白酶与菠萝蛋白酶溶液(w/v)浸泡振荡，其中，胰蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为1:1，用PBS缓冲溶液调pH值至7.4，振荡转速为100rpm,浸泡4小时，即得半成品A。

将半成品A投入盛有含有表面活性剂和高渗盐溶液的容器中，超声浸泡，得半成品B。超声浸泡条件为：60KHz，220W，超声8分钟，浸泡3小时，重复2次；含有表面活性剂和高渗盐溶液的配方是含有0.2g/L聚乙二醇与SDS其中，聚乙二醇选择分子量为2000，聚乙二醇与SDS的质量比为60:40，高渗盐为50mM tris-HCl，1M氯化钠，10mM EDTA。

将半成品B取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中，振荡，每振荡2小时，更换生理盐水溶液一次，共振荡4次，振荡转速为100rpm,得半成品C。

将C投入盛有交联剂溶液的容器中，浸泡4小时，交联剂为京尼平与戊二醛，京尼平与戊二醛的质量比为3:1，交联剂与异体皮原料质量比为0.9：1，浸泡4小时,得半成品D。

将D取出，投入另一盛有生理盐水溶液容器中5℃浸泡64小时，每隔8小时换一次生理盐水溶液，即得半成品E。

将半成品E取出，投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，25℃浸泡4小时，得半成品F，DNA水解酶溶液的浓度是5g/L，用PBS缓冲溶液调pH至7.2。

将半成品F取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中，振荡，每振荡2小时，更换生理盐水溶液一次，共振荡3次，振荡转速为100rpm,得半成品G。

将半成品G取出，投入盛有氨基酸溶液的容器中，于5℃条件下浸泡3次，每次浸泡2.5小时，将处理后的半成品G取出，投入生理盐水溶液中，即得半成品H，氨基酸溶液的浓度为2g/L，氨基酸溶液的配方是由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸按照3.6:1.2:1.2：1.0:0.07质量比配制。

将半成品H取出装入包装袋中，铺平，封口，进行钴-60照射，照射剂量为20-30kGy,取出，终得成品I。

实施例4脱细胞异体真皮基质的生物学性能检测

对实施例1-3制备获得的脱细胞异体真皮基质的机械特性等生物学性能进行测试，性能指标包括拉伸强度、缝合强度、拉伸延长率、含水量、DNA残留量，具体检测结果如表1所示。结果显示，本发明产品韧性和弹性良好、便于缝合、牵拉，能够满足肛瘘治疗需要。

表1脱细胞异体真皮基质检测结果

注：“-”表示没有数据。

实施例5脱细胞异体真皮基质用于临床填充治疗肛瘘

将前述实施例1-3制备的脱细胞异体真皮基质制备成肛瘘栓用于临床治疗肛瘘。

1.临床一般资料

选择确诊肛瘘并且肛缘外瘘管长度在3cm-6cm范围内，需实施手术治疗、符合入组条件的患者共60例，包括男44例，女16例，年龄22-62岁。其中：

试验组30例；对照组30例。试验组1例患者因在手术探查过程中瘘道完全切开，不适宜进行脱细胞异体真皮植入，予以剔除；实际总有效病例为59例。

2.临床试验方法

2.1试验方法

(1)研究方法

因此，本试验采用多中心、随机、对照的优效性试验设计，与公认的标准手术治疗方案进行对照，观察应用脱细胞异体真皮治疗肛瘘的有效性及安全性。

(2)试验分组及病例分配

本试验在以往临床证据的基础上，按照公认的标准治疗方案(传统肛瘘切开或切开挂线手术)治疗。基于公认有效、类同可比的原则，将符合入选标准的病例作为受试对象，随机分为试验和对照两组。对照组采用标准治疗方案(简称传统切开法)。试验组治疗方案中对瘘道未切开部分联合应用脱细胞异体真皮充填修复(简称真皮填塞法)。对照组病例和试验组病例的分配比例为1：1。

(3)样本量计算

据文献报道：切开挂线术创面愈合时间为20.5±2.2，依照优效性试验两组比较均数的样本含量估计方法计算所得单组所需样本量为25例，考虑到脱组及失访因素(按20％计)，单组所需样本量为30例；试验总样本量为60例。

2.2伦理学要求

本临床试验遵循赫尔辛基宣言和中国有关临床试验研究规范、法规进行。在试验开始之前，经各研究单位医院伦理委员会批准认定该试验方案后实施。

每一位患者入选本研究前，研究医师以书面文字形式向其或其指定代表完整、全面地介绍本研究的目的、程序和可能的风险及预期的收益，让患者知道他们有权随时退出本研究；入选前与每位患者签署一份知情同意书，并保存于研究档案中。

3.所采用的统计方法及评价方法

3.1统计分析方法

统计分析数据集：

(1)全分析集(Full Analysis Set，FAS)人群

FAS是指对所有经随机化分组，进入试验，至少有1次疗效评定的受试者，构成本研究的全分析集人群。

(2)符合方案集(Per-Protocol Set，PPS)人群

PPS是指对所有符合研究方案、研究期间未使用禁止用药、完成CRF规定填写内容、未严重违反试验方案的病例进行分析。

(3)安全性(Safety Set，SS)人群

SS是指对所有经随机化分组，并进行了至少一次安全性评估的受试者，构成本研究的安全性人群。

统计分析采用SAS 9.13统计分析软件进行计算。

3.2评价方法

3.2.1有效性指标

主要疗效数据集为FAS分析人群，同时也对疗效的PPS人群进行分析。

所有的统计检验均采用双侧检验，P值≤0.05被认为所检验的差别有统计意义。计量资料采用均数、标准差、中位数、最大值、最小值进行统计描述；计数资料或等级资料采用频数(构成比)进行统计描述。计数资料的比较用卡方检验，等级资料的比较用非参数检验。

不同治疗组各次就诊的计量资料将采用均数±标准差、中位数、最大值、最小值、四分位间距进行统计描述。与筛选期基础值进行比较，采用配对t检验或符号秩和检验比较组内前后差异。两组治疗前后的变化采用t检验或非参数检验进行比较。

不同治疗组各次就诊的计数资料采用频数(构成比)进行统计描述。各组治疗前后的变化采用χ2检验或Fisher确切概率法或非参数检验。

3.2.2安全性指标

(1)与安全性有关的实验室检查

对实验室检查以治疗前后交叉表(根据临床判断)的形式列出所有完成的检查项目，并列出疗后异常的检查项目。

(2)不良事件

试验期间所有不良事件的种类、严重程度及与试验药物的关系等将列表描述。不良事件将按全部不良事件、相关不良事件分类列表给出。

4.临床评价标准及随访

4.1临床评价指标制定依据

肛瘘的传统治疗方法是瘘管切除、瘘管切开挂线等手术方式，其缺点是创伤大、愈合时间长、肛门功能受损，影响正常的工作和生活。因此，围绕肛瘘治疗存在的问题，我们制定了试验的临床评价指标。将创面愈合时间、术后外观及肛瘘相关症状作为临床试验有效性的评价；通过对血尿常规、肝肾功能以及创面分泌物和排异反应的监测，评价临床试验的安全性；同时试验过程中所使用脱细胞异体真皮的韧性和弹性，以及能否缝合、牵拉也会影响材料填塞瘘道后的愈合效果，因此我们增加了对产品术中可操作性的评价。

4.2有效性评价标准

主要指标：创面愈合时间

次要指标：

(1)术后外观评价：瘢痕长度、肛门变形；

(2)肛瘘相关症状评价：疼痛、控便、换药时间及影响工作时间等肛瘘相关症状进行观察，以评分方式进行综合评定，对两组在各访视点的总分值及其变化趋势进行比较分析。

4.3安全性评价标准

(1)术前一般体检项目，如血压、心率、体温等；

(2)血、尿常规及肝肾功能检查，手术前、手术后各检查一次。

(3)记录试验期间不良反应发生情况，重点观察：伤口不愈合、感染(分泌物情况：渗出、溢脓)、有无排异等。

4.4产品术中可操作性评价标准

评价脱细胞异体真皮(简称真皮)的韧性和弹性、能够缝合、牵拉，便于临床操作；

分为满意、较满意、一般、不满意。

满意：材料韧性和弹性良好、操作简单、便于缝合、牵拉；

较满意：材料韧性和弹性尚可、操作尚可、适合缝合、牵拉；

一般：材料韧性和弹性一般、缝合操作一般；

不满意：材料韧性和弹性较差、临床使用可操作性差。

4.5临床随访

根据临床治疗经验，肛瘘切开/切挂线手术后，创面愈合较长的时间在30天左右，平均在20天；若利用脱细胞异体真皮填塞治疗，应能缩短愈合时间；因此通常情况下，治疗所需的最长周期为一个月；伤口愈合后，试验设定的各观察项目均能完成。尽管脱细胞异体真皮作为真皮缺损的替代和修复材料已在临床使用多年，但尚未在肛瘘手术中大量使用，因此将临床随访时间定为3个月，以使研究数据更为完善。

5.临床试验结果

本试验共入组受试者60例，试验组30例，对照组30例；其中试验组1例病人因在手术过程中发现不适合入组本试验被剔除(术中发现两瘘管并行，导致瘘道完全切开，不适合真皮填塞，予以剔除)。实际有效病例为59例，试验组29例，对照组30例，均完成了全部访视及疗效评价。(表2)

表2病例分布情况表

对入组病例的安全性、有效性进行分析比较，对实验组和对照组两组性别、年龄、身高、体重、过敏史、瘘道总长等项目基线情况进行分析比较。结果显示，试验组与对照组各指标差异均无统计学意义，组间具有可比性。

以创面愈合时间、愈合率为主要疗效指标，以瘢痕长度、肛门变形、肛瘘相关症状、疼痛程度、控便能力、换药累计时间、影响工作时间等作为次要指标，测定数据(具体数据略)，并对数据进行分析比较。

6.临床试验效果分析

6.1创面愈合效果分析

肛瘘术后创面愈合的快慢直接影响患者的生活质量及日常工作，传统的切开/切开挂线方式是将所发现的瘘道全部打开，创伤范围大且患者术后恢复周期长；采用真皮填塞瘘道，可有效减少切开范围、消除了内口长时间开放所致的粪便及细菌进入瘘道导致的感染，可有效缩短愈合时间。

通过比较两组愈合时间，试验组10～40(19.6±5.7)天，对照组18～56(26.2±8.4)天，试验组比对照组短6.6天，其95％可信区间为(-10.3665，-2.8059)；采用双侧T检验，P＝0.001，二者具有显著差异，说明采用真皮填塞瘘道可明显缩短愈合时间。

分别对试验组和对照组术后14天(d14)、术后21天(d21)、术后3个月(m3)的生存曲线进行比较，如图1A-C所示。术后主要访视点两组愈合率分别为：术后14天(试验组6.90％，对照组3.33％)、术后21天(试验组75.86％，对照组16.67％)、术后3个月(试验组100％，对照组96.67％)；采用Log-rank检验，第二周的两组生存曲线无统计学差异，第三周和第3个月的两组生存曲线有统计学差异，试验组的生存曲线高于对照组，即试验组疗法优于对照组疗法。

6.2瘢痕及肛门变形情况分析

对比两组术后3个月(试验组0.43±0.18cm，对照组1.89±1.31cm)的瘢痕长度，采用双侧T检验，P值为0.001，说明二者之间有显著差异。

对比两组术后3个月肛门变形情况，试验组无变形病例28例(96.6％)，对照组无变形病例16例(53.3％)，结果采用卡方检验，得χ2＝14.53，P＝0.000，显示二者具有显著差异。

上述结果提示，采用真皮治疗肛瘘，可以有效减少瘢痕，没有明显的肛门变形，主要是由于填塞真皮后加速愈合，从而保证了肛瘘治愈的稳定性。同时，由于切开范围小(图2A、图2B)，避免了瘘道全部切开的大创面，而这种大创面的愈合是极难恢复的(图2C)。

6.3肛瘘相关症状分析

对术后疼痛、控便能力、换药时间及影响工作时间等肛瘘相关症状进行观察，以评分方式进行综合评定，对两组在各访视点的总分值及其变化趋势进行比较分析，分值与症状的关系如图3A所示。图3A中得分越低说明术后相关症状越轻，反之则差；总体分值越接近“0”，术后症状对日常生活造成的影响越小。

临床试验显示，在术后1周、术后14天、21天和3个月的访视中，试验组与对照组的综合评分有显著差异，各访视点两组平均分值比较如图3B所示。通过图3B可以看出，试验组术后的综合得分显著低于对照组，且在术后第21天的随访结束时试验组所有病例得分都趋于零；提示采用真皮治疗后，肛瘘相关症状要显著轻于对照组。在术后1周时试验组的得分值均在3以内，说明术后恢复较快，1周时已基本不影响工作与生活；这为消除病人术后痛苦、赢得工作时间创造了条件。

6.4试验器材可操作性及组织相容情况分析

手术操作过程中，脱细胞异体真皮质地柔软、有较强的韧性和牵拉性，可以满足手术中牵拉、缝合的张力，没有出现撕裂脱出等现象。

所有患者真皮植入处生长良好，没有发现局部红肿、溢出脓性分泌物现象，随访结束时没有出现排异反应，说明组织相容性良好。

6.5安全性分析

本研究共纳入病例60例(试验组30例、对照组30例)；试验组1例患者(随机编号18)因在手术过程中瘘道完全切开，不适宜进行脱细胞异体真皮植入，在全分析集(FAS)人群和符合方案集(PPS)人群中予以剔除；在安全性(SS)人群中予以保留，安全性分析集共包含病例60例。试验期间未发生与植入材料相关的安全性风险，且真皮植入后能够显著加快组织愈合并具有良好的组织相容性，可证明脱细胞异体真皮使用的安全性。

7.临床试验结论

经过对59例临床确诊的肛瘘患者进行的随机对照临床研究，通过使用脱细胞异体真皮填塞瘘道与传统的切开/切开挂线手术方法治疗肛瘘疗效比较，得出如下研究结论：

①疗效可靠并且安全；

②真皮填塞组的创面愈合时间尤其是影响工作和扰乱生活的时间明显低于对照组；

③真皮填塞组无明显肛门变形，瘢痕长度较对照组明显缩短，提高了患者的生活质量；

④可以明显减轻患者术后的痛苦，较对照组术后大创面的相关不适症状显著改善；

⑤脱细胞异体真皮使用方便；材质强韧、柔软，可以满足手术中牵拉、缝合的张力；没有排异、异物刺激等不良反应。

本试验达到了预期的试验观察目的。尤其适合以下情况：(1)瘘管较长，直接切开易造成肛门变形和愈合时间延长的患者。(2)特别适合瘘管管腔宽大，瘘壁自然愈合缓慢的患者。(3)瘘道弯曲患者

实施例6脱细胞异体真皮基质用于临床填充治疗肛瘘的两例实例

将前述实施例1-3制备的脱细胞异体真皮基质用于临床治疗肛瘘具有良好效果，以下示例性给出两例典型临床实例。

病例1：男，59岁。该患者于2005年因肛瘘在二龙路医院手术，后因肛旁反复破溃流脓，于2011年10月14日入我院治疗。专科情况：肛门部视诊：肛门发育正常，可见多处外口破损、红肿。肛门部指诊：可及肛门左侧条索，范围自2点伸向6点。肛门镜检查：未见肿物，未见明确瘘口。经术前常规血生化检查符合入选标准，在患者签署知情同意书后，行肛瘘手术治疗，术中探查瘘口、探查瘘道，确定瘘道自2点开始，至4点处局部切开，自4点开始，至5点处局部切开，瘘道总长度10cm。对瘘道采用脱细胞异体真皮分两段进行填塞治疗，使用真皮面积5cm×1cm，术中使用可吸收缝合线缝合两段瘘道内口并固定真皮。图4A为术前创面；图4B为术中探查及形成切口，术后次日创面；图4C为术后14天愈合，21天创面痕迹；图4D显示术后3月瘢痕不明显。结果显示，该患者术后21天观察创面愈合良好，无肛门变形，无周围组织和全身的反应，患者肛周功能恢复良好。术后3个月随访，伤口完全愈合，无明显瘢痕、无肛门变形，手术区域与周围组织已无明显差别。

病例2：男，57岁。因“肛旁反复破溃流脓血6个月”以“肛瘘”于2012年2月22日收入院治疗。专科情况：肛门部视诊：肛门发育正常，截石位7点距肛缘3cm处可见一外口。肛门部指诊：外口处皮下可及索条状硬结通向肛内，轻度压痛。肛门括约肌功能正常，直肠中下段未及肿物，指套未染血迹。肛门镜检查：截石位3、7、11点齿线上直肠黏膜隆起，表面色暗红，无糜烂及出血点。经术前常规血生化检查符合入选标准，在患者签署知情同意书后，行肛瘘手术治疗，探查瘘口、确定瘘道，瘘道长度4cm，对瘘道采用脱细胞异体真皮进行填塞治疗，使用真皮面积4cm×1cm，术中使用可吸收缝合线缝合瘘道内口并固定真皮。图5A为术前探查，截石位7点距肛缘3cm处可见外口，瘘道长约4cm；图5B为患者在腰麻下行脱细胞异体真皮肛瘘填塞术；图5C显示术后3周创面愈合良好，无排异；图5D显示术后3月与周围组织已无明显差别。结果显示，该患者术后21天观察创面愈合良好，无肛门变形，无周围组织和全身的反应，患者肛周功能恢复良好。术后3个月随访，伤口完全愈合，无瘢痕、变形情况，手术创面与周围组织已无明显差别。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。