发明设涉及生物材料领域，具体设计一种同种异体植入性生物材料的制备方法。
背景技术：
羊膜是胎膜的最内层，属于生物膜中的一种，是一类天然细胞外基质类生物衍生材料。羊膜由滋养细胞层分化而来，表面光滑，半透明，有韧性及弹性，厚度为0.02-0.50mm，主要由I、III 型纤维胶原蛋白构成，含有少量的VI、V 型胶原，其中含有多种生长因子，如成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)、转移生长因子-β(transforming growth-β，TGF-β)、促进血管生成的血管内皮生长因子(VEGF)，还含有纤维连接蛋白(fibronectin,FN) 等。羊膜不表达HLA-A、B、C 及DR 抗原或β2 微球蛋白，透明且无血管、淋巴和神经组织，其抗原性远低于普通组织。大量研究表明，羊膜具有良好的细胞相容性和组织相容性，并具有部位特异的组织再生能力，为一新型的生物衍生材料。
羊膜作为生物材料应用于基础及临床已经有多年的历史。早在20 世纪初期就有用含羊膜的胎膜供体移植于烧伤和溃疡创面的报道，随后在颅脑外科、腹腔外科、妇产科及眼科均有其应用的报道。具体来说其主要用途有：①用于眼睛表面疾病如角膜修复、先天性青光眼、角膜溃疡等；②用于修补鼓膜损伤；③用于外科手术后预防粘连；④用于烧伤后表面覆盖等。
然而，目前对羊膜的处理大多含有使用机械力刮除方法，使羊膜存在细胞残留、机械性能不足以及降解周期较短等缺陷，限制了其临床应用范围。根据临床报道，由于羊膜细胞的存在，在眼科，羊膜植片可能会发生植片排斥反应、植片脱落、移位溶解、感染等并发症，其安全性存在一定的风险。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种脱细胞生物羊膜的制备方法，摒弃了传统的机械力刮除的方法，采用了相对温和的化学处理方法，一方面能有效、彻底地除去羊膜中细胞残留等免疫原，另一方面还能较好的保留羊膜的生物活性和生物力学性能。
本发明的技术方案是：一种脱细胞生物羊膜的制备方法，包括羊膜的清洗、化学处理和冷冻干燥，其特征在于，该方法按以下步骤进行：
（1）将新鲜羊膜用生理盐水反复清洗，直至无残留血液；
（2）将步骤（1）所得的羊膜用过氧化氢溶液浸泡2小时；
（3）将步骤（2）所得的羊膜用分析纯的丙酮浸泡，水浴恒温震荡脱去脂肪成分；
（4）将步骤（3）所得的羊膜用十二烷基硫酸钠溶液浸泡16-20小时；
（5）将步骤（4）所得的羊膜用酒精浸泡16-20小时；
（6）将步骤（5）所得的羊膜用大量纯化水反复清洗至末道清洗液pH值为6.5-7.5；
（7）将步骤（6）所得的羊膜放入-70℃下的环境中冷冻16-25小时；
（8）将步骤（7）所得的羊膜放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥；
（9）将步骤（8）所得的羊膜进行辐照灭菌。
根据本发明的脱细胞生物羊膜的制备方法，较好的是，所述过氧化氢的质量分数为5%-25%。
根据本发明的脱细胞生物羊膜的制备方法，在一个优选的实施方案中，所述水浴恒温震荡的温度为25-37℃。
步骤（4）中所述十二烷基硫酸钠的质量分数为0.1%-0.5%。
根据本发明的脱细胞生物羊膜的制备方法，较好的是，所述酒精的质量分数为75-85%。
根据本发明的脱细胞生物羊膜的制备方法，在一个优选的实施方案中，所述冷冻干燥时间为24小时。
根据本发明的脱细胞生物羊膜的制备方法，较好的是，所述辐照灭菌的剂量为20-30kGy。
本发明的技术原理：摒弃了机械力刮除的传统方法，采用了相对温和的化学处理的方法，可以有效地除去羊膜中的上皮细胞层、纤维母细胞层和海绵层，达到消除或减弱抗原性的目的，从而减弱羊膜在移植时引起的免疫排斥反应；同时又能有效地保留基底膜中的各种胶原蛋白，可以较好地保留羊膜的生物活性。另外采用辐照的方式灭菌，能够进一步降低羊膜的免疫原性，使植入的羊膜能够被宿主细胞所适应，大大降低免疫排斥反应。
本发明的有益效果在于将新鲜羊膜用生理盐水清洗干净，洗去羊膜上的残留血液，再依次用过氧化氢、丙酮、十二烷基硫酸钠、酒精处理，能够有效地去除羊膜中的细胞膜和细胞基质等免疫原，大大降低了羊膜的免疫原性，同时通过深低温冷冻和冷冻干燥处理，可以进一步的降低羊膜的免疫原性，一方面能够降低免疫排斥反应，另一方面还能较好的保留羊膜的生物活性和生物力学性能。此外，本发明设计的化学处理方法步骤简单移行，有利于实现规模化生产操作。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
将新鲜羊膜先用大量生理盐水冲洗至无残留血迹，将其放入质量体积比为5:1的、质量分数为5%的过氧化氢溶液中浸泡2小时；然后羊膜放入质量体积比为5:1的分析纯的丙酮中，水浴恒温震荡2小时，脱去脂肪成分；再将所得的羊膜用质量体积比为5:1的、质量分数为0.15%的十二烷基硫酸钠溶液浸泡18小时；再用质量体积比为5:1的、质量分数为75%的酒精浸泡18小时脱去水分后用大量的纯化水反复冲洗羊膜直至末道清洗液的pH值在6.5-7.5之间。
将清洗完成后的羊膜平铺在不锈钢冻干盘上面，放入-70℃以下的环境中冷冻24小时，然后将其放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。冷冻干燥结束后在万级洁净环境中将其分割和包装，最后将其进行辐照灭菌（剂量为25kGy）,即可得到脱细胞生物羊膜成品。
实施例2
将新鲜羊膜先用大量生理盐水冲洗至无残留血迹，将其放入质量体积比为6:1的、质量分数为5%的过氧化氢溶液中浸泡2小时；然后羊膜放入质量体积比为6:1的分析纯的丙酮中，水浴恒温震荡2小时，脱去脂肪成分；再将所得的羊膜用质量体积比为6:1的、质量分数为0.2%的十二烷基硫酸钠溶液浸泡18小时；再用质量体积比为5:1的、质量分数为75%的酒精浸泡18小时脱去水分后用大量的纯化水反复冲洗羊膜直至末道清洗液的pH值在6.5-7.5之间。
将清洗完成后的羊膜平铺在不锈钢冻干盘上面，放入-70℃以下的环境中冷冻24小时，然后将其放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。冷冻干燥结束后在万级洁净环境中将其分割和包装，最后将其进行辐照灭菌（剂量为25kGy）,即可得到脱细胞生物羊膜成品。
实施例3
将新鲜羊膜先用大量生理盐水冲洗至无残留血迹，将其放入质量体积比为6:1的、质量分数为10%的过氧化氢溶液中浸泡2小时；然后羊膜放入质量体积比为6:1的分析纯的丙酮中，水浴恒温震荡2小时，脱去脂肪成分；再将所得的羊膜用质量体积比为6:1的、质量分数为0.25%的十二烷基硫酸钠溶液浸泡18小时；再用质量体积比为5:1的、质量分数为75%的酒精浸泡18小时脱去水分后用大量的纯化水反复冲洗羊膜直至末道清洗液的pH值在6.5-7.5之间。
将清洗完成后的羊膜平铺在不锈钢冻干盘上面，放入-70℃以下的环境中冷冻24小时，然后将其放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。冷冻干燥结束后在万级洁净环境中将其分割和包装，最后将其进行辐照灭菌（剂量为25kGy）,即可得到脱细胞生物羊膜成品。