一种工频电磁场发生装置与铂类药物的组合方法与流程

本发明属于生物技术与医疗技术领域，涉及物理学、生物学与医学交叉领域，尤其涉及一种工频电磁场发生装置与铂类药物的组合方法。

背景技术：

低频电磁场频率在300千赫(kHz)之内，不具有热效应但具有生物学效应，其机制尚不明，可能与作用于带电荷的大分子并改变其功能状态有关。磁场对肿瘤的抑制作用已有广泛报道(参见Artacho-Cordón Francisco等，2013，Int J Mol Sci；Tofani S，2015，Curr Topics in Med Chem)。欧盟与美国FDA已批准肿瘤治疗性磁场发生设备(以色列Novocure公司)用于多形性神经胶质母细胞瘤的临床治疗，该技术特征是采用100-300kHz的磁场(参见美国专利US8019414，US8019414，US8406870)。中国专利中也提出了多种具有肿瘤抑制效应的磁场加载方法，其中包括大于0.4特斯拉(T)的强磁场(参见中国专利90100152.X)和脉冲磁场(参见中国专利94111668.9)。在该领域的研究和应用中，电磁场自身属性与作用对象、方式不同，包括时间、强度、脉冲频率、载波频率、间隔时间等参数不同，会产生不同的生物效应。而且磁场的生物物理作用机制复杂，并非单一分子通路起作用，故对磁场的生物学效应，包括抑制肿瘤细胞的效应，并没有统一的和完整的认识。具体效果需针对某种特定的磁场加载方式和特定的作用对象来进行甄别验证。

有一种特殊的加载方式，将直流电产生的静态磁场与超低频交流电产生的交变磁场叠加。在理论上，这种叠加磁场对自由基孤对电子单线态-三线态跃迁的影响最大，可能增加跃迁几率，延长自由基的半衰期，扩大其生物效应(参见Tofani S,1999，Physica Medica；Barnes FS等，2015，Bioelectromagnetics)。

目前肿瘤治疗通常采用有创的手术治疗以及无创的放化疗。放疗可为全身性或局部性。化疗分为靶向与非靶向。对于放化疗抵抗并且目前没有有效靶向药物的病例，临床上亟待发现新的治疗方法，尤其是无创、低毒副作用的方法。在低频电磁场作用于动物和人类的过程中，尚未发现明显的全身性毒副作用(参见Tofani S等,2002,IEEE Transactions on Plasma Science；Ronchetto F等，2004，Bioelectromagnetics)。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种工频电磁场发生装置与铂类药物的组合方法，组合使用产生的效应大于铂类药物与磁场单独使用时。

本发明提供的工频电磁场发生装置与铂类药物的组合方法，通过以下步骤实现：

构建工频电磁场发生装置，采用工频50/60Hz电源，通过直流与交流自耦变压器不断改变电压，从而在辐照部件内部产生叠加的静态(来自DC)与交变(来自AC)电磁场，加载磁场平均强度为5.5毫特斯拉(mT)，对于辐照部件上受照物每天总辐照时间为60-120分钟；将铂类药物施于辐照部件上的受照物，铂类药物选用顺铂、卡铂、奥沙利铂等其它铂类药物，使用方式和剂量为：体外作用浓度为500nM，每天加药一次，体内作用剂量为20mg/kg，每周给药3次，此为在顺铂有效剂量范围内选取的较低剂量。

所述工频电磁场发生装置，由工频电源1、第一自耦变压器2(交流AC)、第二自耦变压器3(直流DC)、第一二极管电桥4、第二二极管电桥5，第一组线圈6、第二组线圈7、辐照部件8、电压检测部件9、磁场检测部件10、测温部件11和终端电脑12组成，工频电源1分别与第一自耦变压器2和第二自耦变压器3的一端连接，第一自耦变压器2和第二自耦变压器3的另一端分别与第一二极管电桥4和第二二极管电桥5连接，第一二极管电桥4的另一端与第一组线圈6连接，第二二极管电桥5的另一端与第二组线圈7连接，辐照部件8置于第一组线圈6和第二组线圈7之间，电压检测部件9一端分别与第一组线圈6和第二组线圈7连接，另一端与终端电脑12连接，磁场检测部件10和测温部件11各自一端分别与辐照部件8相连，各自的另一端分别与终端电脑12相连。

辐照部件有两种，第一种为细胞辐照平台，针对细胞培养板和培养皿设计，由隔板一、隔板二、以及位于两个隔板之间的载物台组成，细胞培养板放置于载物台之上，隔板一和隔板二间距为12.9厘米，载物台高度可调，保证细胞培养板底部位于辐照区域正中位置。第二种辐照部件为动物辐照平台，主要针对小鼠设计，由隔板一、隔板二、以及位于两个隔板之间的6个动物辐照小室组成，组成动物辐照小室的部件包括前挡板、后挡板、中间隔板、以及小室隔板一、小室隔板二、小室隔板三、小室隔板四，其中前挡板和后挡板钻多个小孔作为透气孔，以免动物发生缺氧，隔板一和隔板二间距为12.9厘米，6个辐照小室位于辐照区域正中位置，每轮辐照可处理6只小鼠。辐照部件的材料选用透明树脂板，可以清洗与紫外消毒。

所述的通过直流与交流自耦变压器不断改变电压，在辐照部件内部产生直流与交流叠加的电磁场，具体通过以下步骤实现：分为T1-T8共8个时间段，T1时间段直流电压为3毫伏(mV)，产生静态电磁场强度为2.97毫特斯拉(mT)，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；T2时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为2.5mV，产生交变电磁场平均强度为2.47mT；T3时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；T4时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为2.5mV，产生交变电磁场平均强度为2.47mT；T5时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1mV，产生交变电磁场平均强度为1.08mT；T6时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；T7时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1mV，产生交变电磁场平均强度为1.08mT；T8时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；辐照区域内部不同位置总磁场强度相同，T1至T8时间段平均磁场强度为5.5mT；T1-T8时间段每次改变电压持续辐照3.5-10分钟，每轮辐照时间累计30-90分钟，每天辐照2-4轮，对于细胞和动物每天总辐照时间为60-120分钟。

本发明方法通过体内外实验，发现肿瘤治疗性电磁场与铂类化疗药物如顺铂联用，可增强抗肿瘤效果，而非简单叠加。

因此，本发明具有如下有益效果：(1)装置采用独特的工频，并将静态(直流)与交变(交流)电磁场同时加载，装置产生的磁场强度均匀，高度可控，实施方便；(2)生物体所受干扰小，无创伤；(3)可增强铂类化疗药物的疗效，对多种肿瘤具有显著的抑制作用；(4)可降低顺铂的剂量，降低毒副作用。

附图说明

图1是本发明磁场发生装置结构示意图。

图2是本发明装置辐照部件之一，置于磁场中的细胞辐照平台示意图。

图3是本发明装置辐照部件之二，置于磁场中的动物辐照平台示意图。

图4是本发明电磁场加载方式的主要参数，即直流与交流电压变化方案与产生的对应电磁场强度，其中交流电压为平均值。

图5是本发明针对体外培养的肾母细胞瘤细胞系G401的效果图。

图6是本发明针对体外培养的神经母细胞瘤细胞系CHLA255的效果图。

图7是本发明针对体内生长肾母细胞瘤G401的效果图。

图8是本发明针对肾母细胞瘤G401模型小鼠肝肾功能影响的效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1，本发明磁场发生装置与铂类药物组合方法

本方法通过以下步骤实现：构建工频电磁场发生装置，采用工频50/60Hz电源，通过直流与交流自耦变压器不断改变电压，从而在辐照部件内部产生叠加的静态(来自DC)与交变(来自AC)电磁场，加载磁场平均强度为5.5毫特斯拉(mT)，对于辐照部件上受照物每天总辐照时间为60-120分钟；将铂类药物施于辐照部件上的受照物，铂类药物选用顺铂、卡铂、奥沙利铂等其它铂类药物，使用方式和剂量为：体外作用浓度为500nM，每天加药一次，体内作用剂量为20mg/kg，每周给药3次，此为在顺铂有效剂量范围内选取的较低剂量。

参见图1，工频电磁场发生装置，由一个工频电源1、第一自耦变压器2(交流AC)、第二自耦变压器3(直流DC)、第一二极管电桥4、第二二极管电桥5，第一组线圈6、第二组线圈7、辐照部件8、电压检测部件9、磁场检测部件10、测温部件11和终端电脑12组成，工频电源1分别与第一自耦变压器2和第二自耦变压器3的一端连接，第一自耦变压器2和第二自耦变压器3的另一端分别与第一二极管电桥4和第二二极管电桥5连接，第一二极管电桥4的另一端与第一组线圈6连接，第二二极管电桥5的另一端与第二组线圈7连接，辐照部件8置于第一组线圈6和第二组线圈7之间，电压检测部件9一端分别与第一组线圈6和第二组线圈7相连，另一端与终端电脑12相连，磁场检测部件10和测温部件11各自一端分别与辐照部件8相连，各自的另一端分别与终端电脑12相连。

参见图2、图3，辐照部件8有两种，第一种为细胞辐照平台，针对细胞培养板和培养皿设计，由隔板一13、隔板二14、以及位于两个隔板之间的载物台15组成，细胞培养板放置于载物台之上，隔板一13和隔板二14间距为12.9厘米，载物台高度可调，保证细胞培养板底部位于辐照区域正中位置。

具体磁场加载方式采取如图2所示方案，采用工频50/60Hz电源，通过直流与交流自耦变压器不断改变电压，在辐照部件内部产生直流与交流叠加的电磁场，具体通过以下步骤实现：分为T1-T8共8个时间段，T1时间段直流电压为3毫伏(mV)，产生静态电磁场强度为2.97毫特斯拉(mT)，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；T2时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为2.5mV，产生交变电磁场平均强度为2.47mT；T3时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；T4时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为2.5mV，产生交变电磁场平均强度为2.47mT；T5时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1mV，产生交变电磁场平均强度为1.08mT；T6时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；T7时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1mV，产生交变电磁场平均强度为1.08mT；T8时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；辐照区域内部不同位置总磁场强度相同，T1至T8时间段平均磁场强度为5.5mT；T1-T8时间段每次改变电压持续辐照3.5-10分钟，将铂类药物施于辐照部件8上的受照物，铂类药物选用顺铂、卡铂、奥沙利铂等，每轮辐照时间累计30-90分钟，每天辐照2-4轮，对于细胞和动物每天总辐照时间为60-120分钟。所述受照物选用细胞或动物。

本实例作为联用药物选用顺铂，其化学式如下：

其它铂类药物，包括卡铂，奥沙利铂等与肿瘤治疗性磁场联用，亦属于本专利保护范围之内。

实施例2，本发明作用于培养的肾母细胞瘤细胞G401，对照组、辐照组、顺铂组、联用组分别处理，每个处理条件3个复孔，每天收集前一天处理的细胞，用活细胞计数仪计数，根据读数计算细胞数目，做出细胞增殖曲线和电磁场对细胞的抑制曲线。

具体实施过程如下：

细胞系和培养方法：肾母细胞瘤细胞G401，此细胞为贴壁细胞，用含10％胎牛血清的McCoy培养基培养于37℃孵箱，含5％二氧化碳和饱和水蒸气。

主要设备：工频电磁场发生装置，细胞培养箱，活细胞计数仪。

细胞活力实验：将肾母细胞瘤细胞G401以1×10^5个/孔的密度接种于6孔板，辐照组使用图1所示装置，按照图4所述方案处理细胞，每次改变电压作用3.5分钟，每轮作用时间共约30分钟，每天处理4轮，共2小时电磁场辐照时间；顺铂组加入顺铂(江苏豪森药业股份有限公司)，给药浓度为500nM，每天给药1次；联用组为辐照与顺铂联合使用，辐照加载方式与顺铂给药方式与单用组相同；对照组将细胞置于没有加载电磁场的线圈之间的置物台，每天2小时，并且加入与顺铂组同等体积的生理盐水；每天收集前一天处理的细胞，用活细胞计数仪计数，根据读数计算细胞数目，做出细胞增殖曲线和电磁场对细胞的抑制曲线。

统计分析：每种辐照条件重复3次，每次3个复孔，结果以平均值±标准误表示，结果做T检验，以P<0.05作为具有显著性差异指标。

如图5所示，左侧图为G401细胞增殖曲线，其中X轴为细胞处理天数，Y轴为细胞数，曲线一为对照组细胞增殖曲线，曲线二为辐照组细胞增殖曲线，曲线三为顺铂组细胞增殖曲线，曲线四为联用组细胞增殖曲线；右侧图为细胞抑制曲线，其中X轴为细胞处理天数，Y轴为细胞抑制率(％)，曲线一为辐照组细胞抑制率曲线，曲线二为顺铂组细胞抑制率曲线，曲线三为联用组细胞抑制率曲线；图中结果显示辐照组、顺铂组、联用组细胞增殖均减慢，细胞抑制率增加，其中联用组细胞增殖率最慢，抑制率最高。

实施例3，本发明作用于培养的神经母细胞瘤细胞CHLA255，对照组、辐照组、顺铂组、联用组分别处理，每个处理条件3个复孔，每天收集前一天处理的细胞，用活细胞计数仪计数，根据读数计算细胞数目，做出细胞增殖曲线和电磁场对细胞的抑制曲线。

具体实施过程如下：

细胞系和培养方法：神经母细胞瘤细胞CHLA255，此细胞为贴壁细胞，用含10％胎牛血清的McCoy培养基培养于37℃孵箱，含5％二氧化碳和饱和水蒸气。

主要设备：工频电磁场发生装置，细胞培养箱，活细胞计数仪。

细胞活力实验：将神经母细胞瘤细胞CHLA255以1×10∧5个/孔的密度接种于6孔板，辐照组使用图1所示装置，按照图4所述方案处理细胞，每次改变电压作用3.5分钟，每轮作用时间共约30分钟，每天处理4轮，共2小时电磁场辐照时间；顺铂组加入顺铂(江苏豪森药业股份有限公司)，给药浓度为500nM，每天给药1次；联用组为辐照与顺铂联合使用，辐照加载方式与顺铂给药方式与单用组相同；对照组将细胞置于没有加载电磁场的线圈之间的置物台，每天2小时，并且加入与顺铂组同等体积的生理盐水；每天收集前一天处理的细胞，用活细胞计数仪计数，根据读数计算细胞数目，做出细胞增殖曲线和电磁场对细胞的抑制曲线。

统计分析：每种辐照条件重复3次，每次3个复孔，结果以平均值±标准误表示，结果做T检验，以P<0.05作为具有显著性差异指标。

如图6所示，左侧图为CHLA255细胞增殖曲线，其中X轴为细胞处理天数，Y轴为细胞数，曲线一为对照组细胞增殖曲线，曲线二为辐照组细胞增殖曲线，曲线三为顺铂组细胞增殖曲线，曲线四为联用组细胞增殖曲线；右侧图为细胞抑制曲线，其中X轴为细胞处理天数，Y轴为细胞抑制率(％)，曲线一为辐照组细胞抑制率曲线，曲线二为顺铂组细胞抑制率曲线，曲线三为联用组细胞抑制率曲线；图中结果显示辐照组、顺铂组、联用组细胞增殖均减慢，细胞抑制率增加，其中联用组细胞增殖率最慢，抑制率最高。

实施例4，在裸鼠体内建立G401肾母细胞瘤模型，将动物随机分为4组，每组8只，对照组、辐照组、顺铂组、联用组分别处理，周期为15天，处理结束后3天处死动物，称量瘤重，并取动物血分析相关生化指标，判断药物与辐照的肝肾毒性；

肿瘤模型建立方法：雄性裸鼠3-4周龄，腋下接种肾母细胞瘤细胞G401，数量为5×10∧6/只，体积为200微升，接种一周后可触及肿瘤，将动物随机分组，对照组、辐照组、顺铂组、联用组分别处理。

主要设备：低频电磁场发生装置，动物辐照平台，全自动生化免疫分析仪(美国Beckman Coulter Au5800)。

体内生长肿瘤抑制实验：将裸鼠随机分为4组，对照组，辐照组，顺铂组，联合组，每组8只，辐照组按照图4所示方案，每次改变电压作用10分钟，每轮作用时间共约90分钟，每天处理1轮，共处理14天；顺铂组给予顺铂(江苏豪森药业股份有限公司)20mg/kg，腹腔注射，每周3次，共给药6次；联合组给予顺铂与辐照同时处理；对照组将动物置于没有加载电磁场的线圈之间的动物辐照部件，每天90分钟，并且腹腔注射与顺铂组同等体积的生理盐水；所有动物处理3天之后脱颈处死，挖眼球取全血，EDTA抗凝，离心后取血浆做生化指标测定，取出腋下生长肿瘤，称量瘤重，组织冷冻保存。

统计分析：每组8只动物，结果以平均值±标准差表示，结果做T检验，以P<0.05作为具有显著性差异指标。

如图7所示，*表示P<0.05，与对照组相比具有显著性差异，瘤重显著性差异出现在联合组与对照组之间，而辐照组、顺铂组瘤重与对照组未出现显著性差异，说明辐照与顺铂联用对体内生长肿瘤的抑制效果优于辐照或顺铂单用。

如图8所示，*表示P<0.05，与对照组相比具有显著性差异，在反映肝功能的血浆白蛋白、球蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶，以及反映肾功能的血肌酐、尿素氮这些指标中，仅仅在血浆球蛋白一项，顺铂组与联用组比对照组明显降低，此改变主要与顺铂的肝毒性有关，而在本实验所使用的电磁场辐照条件下，未发现动物产生肝肾损伤，可初步证明辐照的全身毒性较低。