一种阻断膝关节炎关节软骨损伤患者炎症因子的药物的制作方法

本发明属于医药生物
技术领域：
，涉及一种运用脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药阻断膝关节炎关节软骨损伤患者炎症因子的新型药物。
背景技术：
：膝关节炎关节软骨损伤好发于中老年人和从事大负荷运动的人群，临床表现主要是两个方面：关节疼痛和运动功能障碍。目前，临床治疗效果不佳，主要是缓解患者的疼痛，改善膝关节功能，究其原因就是因为不清楚膝关节炎软骨损伤的发病机制。药物治疗主要是对症治疗，暂时缓解病人的痛苦，但长期效果不佳，症状容易反复发作。药物达到一定治疗效果的同时还伴随一些副作用。对于老年、晚期症状较重，保守治疗效果不佳的患者则需要进行人工膝关节置换术，不仅手术费用高，会给患者本人，家庭及社会造成严重负担，而且还需要进行二次手术。因此，脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药用于治疗膝关节炎关节软骨损伤给膝关节患者带来新的希望。脐带间充质干细胞具有更强的增殖分化能力，免疫原性低，取材方便，无道德伦理问题的限制，易于工业化制备。脐带间充质干细胞能够发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞，一旦注射入膝关节软骨损伤患者的膝关节可以定向分化为软骨细胞，促进机体损伤软骨的恢复。脐带间充质干细胞在膝关节软骨损伤修复方面具有长远的发展前景，可以治愈更多饱受病痛折磨的膝关节炎患者。超氧化物歧化酶能够清除机体组织代谢过程中所产生的有害物质------过氧化物和氢氧根，这些代谢产物的堆积会造成机体组织出现损伤，软骨发生破坏以及组织不断纤维化。软骨损伤会引起机体的炎症反应，超氧化物歧化酶可将炎症过程中多形核吞噬细胞产生的花生四烯酸分解产物一过氧化物游离基转化为过氧化氢和氧，并加以清除，从而达到有效缓解乃至清除骨关节炎疼痛的目的。维生素D是一种脂溶性维生素，也被看作是一种作用于钙、磷代谢的激素前体，能够保护关节结构性病变的展延和降低其临床症状。机体内缺乏维生素D会导致骨质疏松症进展、跌倒和骨折。技术实现要素：本发明的目的是弥补现有药物治疗手段的不足之处，脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药具有阻断膝关节炎关节软骨损伤患者炎症因子的活性，具有广泛的应用前景，可能成为临床上治疗膝关节炎的潜在治疗药物。本发明的技术方案是：一种阻断膝关节炎关节软骨损伤患者炎症因子的药物，其特征在于：由以下组分组成，1X106细胞/ml脐血源神经干细胞和20-60ng/ml环孢素A以及2-10ng/ml维生素B12。1X107细胞/ml脐带间充质干细胞和10-25ng/ml超氧化物歧化酶以及5-15ng/ml维生素D本发明由以下组分组成，1X107细胞/ml脐带间充质干细胞和15ng/ml超氧化物歧化酶以及8ng/ml维生素D。本发明由以下步骤组成，软骨细胞接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中悬浮培养。待软骨细胞生长到70-80%，用复合药培养24h即可。DMEM培养基是dulbecco'smodifiedeaglemedium的缩写；DMEM的特性：(1)氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等;(2)维生素含量为依格尔培养基的4倍;(3)含有糖酵解途径中的重要物质------丙酮酸;(4)含有微量的铁离子。膝关节炎关节软骨损伤患者在关节腔注射脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药后，使用Lysholm膝关节功能评分进行评估药效，研究结果显示注射脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药后可以明显改善膝关节炎关节软骨损伤患者的症状（表1）。治疗前治疗后58.62±5.67581.85±4.871使用VAS评估膝关节炎关节软骨损伤患者的疼痛程度，研究结果显示注射脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药后可以明显改善膝关节炎关节软骨损伤患者的疼痛程度（表2）。治疗前治疗后7.47±1.2722.79±1.099源于膝关节炎关节软骨损伤患者的软骨细胞是一种比较容易获得的细胞类型，采用酶消化法提取膝关节软骨细胞进行体外培养。脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药对膝关节炎关节软骨损伤患者的软骨细胞的促增殖研究，研究结果表明脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药明显增加膝关节炎关节软骨损伤患者的软骨细胞增殖效果（图1）。实时定量PCR法检测膝关节炎关节软骨损伤患者软骨细胞的炎症因子MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13的基因表达情况（图2）。ELIAS检测膝关节炎关节软骨损伤患者软骨细胞的炎症因子MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13的蛋白表达情况（图3）。由于MMP-2和MMP-9是基质金属蛋白酶家族中的明胶酶，可以降解Ⅳ型胶原，例如：明胶，使用明胶酶谱法检测膝关节炎关节软骨损伤患者软骨细胞的MMP-2和MMP-9分解明胶的能力（图4）。本发明的有益效果是寻找临床上治疗膝关节炎关节软骨损伤的新方法。到目前为止，对于膝关节炎关节软骨损伤的治疗只是对症治疗，不能根除病因，要想在临床上寻找到治疗膝关节炎关节软骨损伤的办法，就必须确定该疾病的发病机理，从而找到合适的分子作用靶点。脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药可以作为治疗膝关节炎关节软骨损伤的新形式。附图说明图1是脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药对于膝关节炎关节软骨损伤患者软骨细胞的细胞增殖的影响。数据代表±SEM。n=3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图2是实时定量PCR检测脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药对于膝关节炎关节软骨损伤患者软骨细胞的炎症因子MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13基因表达情况。数据代表±SEM。n=3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图3是ELISA检测脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药对于膝关节炎关节软骨损伤患者软骨细胞的炎症因子MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13蛋白表达情况。数据代表±SEM。n=3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图4是明胶酶谱法分析脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药对于膝关节炎关节软骨损伤患者软骨细胞的MMP-2和MMP-9分泌量情况。数据代表±SEM。n=3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。具体实施方式本发明1X107细胞/ml脐带间充质干细胞和15ng/ml超氧化物歧化酶以及8ng/ml维生素D复合药（简写：复合药）对膝关节炎关节软骨损伤患者软骨细胞的修复研究。1.实验材料1.1细胞系根据相关的发布标准，由某医院康复科室诊断30名患者为膝关节炎关节软骨损伤，其中：5男，25女。选择30名年龄相仿的健康人作为对照组，其中：4男，26女。采用酶消化法分别从膝关节炎关节软骨损伤患者和健康人中提取膝关节软骨细胞。1.2仪器和试剂超净工作台（北京医疗设备厂，中国），C02培养箱（CB150，Binder，德国），台式低温高速离心机（5804R，Eppendorf，德国），纯净水机（MILLI-Q，Millipore，美国），DMEM/F12培养基，青霉素、链霉素（华北制药股份有限公司），胎牛血清（北京索莱宝科技有限公司），CCK-8（同仁化学研究所），BCA蛋白浓度测定试剂盒（Pierce，美国），1X107细胞/ml脐带间充质干细胞（实验室自制），超氧化物歧化酶和维生素D（Sigma公司，美国）。2实验方法2.1Lysholm膝关节功能评分对于膝关节炎关节软骨损伤患者给予注射7ml复合药至关节腔，三个月后观察治疗效果。2.2视觉模拟评分法(VAS)对于膝关节炎关节软骨损伤患者给予注射7ml复合药至关节腔，三个月后观察治疗效果。使用一条长约10cm的游动标尺，一面标有10个刻度，两端分别为"0"分端和"10"分端，0分表示无痛，10分代表难以忍受的最剧烈的疼痛。2.3细胞培养软骨细胞接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中悬浮培养。待软骨细胞生长到70-80%，用复合药培养24h。对照组不用复合药处理。2.4增殖能力检测用CCK-8法检测细胞增殖情况。在96孔板中接种细胞悬液（100μl/孔），将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37℃，5%CO2）。向每孔加入10μlCCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。将培养板在培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。2.5RNA的提取和实时定量PCR检测提取细胞的总RNA，取1μg总RNA反转录为cDNA作为实时定量PCR的模板。所使用的引物序列如表1所示。2.6ELISA检测使用ELISA试剂盒检测MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13的蛋白含量。2.7明胶酶谱法（1）样品制备收集细胞上清液，移入离心管中，2000rpm，离心10min，为了使上样蛋白含量一致，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。（2）SDS-PAGE电泳配制电泳所需的分离胶和浓缩胶，4℃电泳，100V至溴酚蓝指示剂到达分离胶的最底部，大约4h，停止电泳。（3）洗脱将凝胶置于洗脱液中，室温，振荡，洗脱4次，每次15min。（4）漂洗将凝胶置于漂洗液中，室温，振荡，漂洗2次，每次20min。（5）孵育将凝胶置于孵育液中，37℃，孵育24h。（6）染色及脱色将凝胶置于染色液，染色3h；再将凝胶置于脱色液A、B、C（脱色液A、B、C中甲醇浓度依次为30%、20%和10%，乙酸浓度依次为10%、10%和5%，混匀，室温保存），分别脱色0.5，1和2h；位于蓝色背景上的透亮带就是MMP-2（72KDa）和MMP-9（92KDa）；用ImageJ进行灰度值分析。2.8统计方法所有结果用mean±SEM表示。使用ANOVA方法进行数据分析，它属于Tukey的一种多重比较法。当P<0.05时，结果有显著性差异。3实验结果3.1Lysholm膝关节功能评分结果利用Lysholm膝关节功能评分检测膝关节炎软骨损伤患者的膝关节功能，结果显示，膝关节炎软骨损伤患者治疗前膝关节功能评分为58.62±5.675，注射脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药治疗后，膝关节功能评分明显提高，达到81.85±4.871。3.2VAS评估疼痛结果利用VAS评估膝关节炎软骨损伤患者的疼痛程度，结果显示，膝关节炎软骨损伤患者治疗前VAS评估值为7.47±1.272，注射脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药治疗后，VAS评估值明显降低，达到2.79±1.099。3.3细胞增殖能力结果利用CCK-8检测膝关节炎软骨损伤患者软骨细胞的细胞增殖能力，结果显示，膝关节炎软骨损伤患者软骨细胞增殖率明显降低，脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药增加膝关节炎软骨损伤患者软骨细胞的增殖能力，结果提示脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药能够显著增强膝关节炎软骨损伤患者软骨细胞的增殖（图1）。3.4实时定量PCR结果基质金属蛋白酶（MMPs）广泛存在于机体的各种结缔组织中，在胞外基质的降解过程中发挥重要作用，例如：它可以降解膝关节炎关节软骨的基质，从而造成软骨损伤进而出现糜烂和溃疡等病理改变。关节软骨中MMPs的表达一直是骨关节炎发生的主要机制，同时也是进行药物治疗作为的靶点，其中膝关节炎软骨损伤过程中比较明显的是MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13。实验结果说明脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药能够明显降低膝关节炎软骨损伤患者软骨细胞所升高的MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13基因表达水平（图2）。3.5ELISA结果用ELISA进一步检验MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13的蛋白表达。实验结果与实时定量PCR结果一致，脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药能够明显降低膝关节炎软骨损伤患者软骨细胞所升高的MMP-1，MMP-2，MMP-9和MMP-13蛋白表达水平（图3）。3.6明胶酶谱结果用明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9的分泌量，进一步确定脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药阻滞膝关节炎关节软骨损伤的炎症机制。MMP-2是一个72kDa的蛋白，MMP-9是一个92kDa的蛋白，它们可以调节细胞的许多生理活动，例如：细胞迁移，这一运动可以促使其损伤区域的软骨组织进行功能修复。膝关节炎关节软骨损伤患者软骨细胞组，MMP-2和MMP-9的分泌量明显升高；脐带间充质干细胞和超氧化物歧化酶以及维生素D复合药显著降低膝关节炎软骨损伤患者软骨细胞所升高的MMP-2和MMP-9的分泌量（图4）。明胶酶谱法与实时定量PCR和ELISA结果一致具体实施方式实施例11X107细胞/ml脐带间充质干细胞和10ng/ml超氧化物歧化酶以及5ng/ml维生素D。实施例21X107细胞/ml脐带间充质干细胞和15ng/ml超氧化物歧化酶以及8ng/ml维生素D。实施例31X107细胞/ml脐带间充质干细胞和25ng/ml超氧化物歧化酶以及15ng/ml维生素D。当前第1页1 2 3