一种用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物和三维生物打印人体骨组织的方法与流程

本发明属于脂肪干细胞培养及其分化再生技术领域，具体涉及一种用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物和三维生物打印人体骨组织的方法。

背景技术：

由于龋病、牙周病、外伤、肿瘤等因素造成的颌面部的骨组织缺损，是口腔科医师经常要面对的难题，骨组织工程技术的出现为骨缺损的修复提供了前景广阔的新选择。人脂肪间充质干细胞（adscs）取材于脂肪组织，人体丰富的脂肪组织可为adscs的提取提供充足的来源。adscs与骨髓间充质干细胞（bmscs）一样具有多向分化潜能，能逃避免疫识别，具有免疫特赦作用；与bmscs相比，除了来源更加丰富外，其取材较bmscs方便、对供体损伤小，且干细胞含量高及体外扩增能力强，具有易于临床推广等优点，已成为骨组织工程学研究中的热点。目前的研究表明adscs还能自分泌功能性细胞因子，包括诱导软骨形成的分子，adscs将可能替代bmscs成为理想的种子细胞。传统的骨组织工程技术，其基本原理是讲体外培养扩增的种子细胞复合到支架材料商，构成细胞-支架复合体，在进行体外培养或植入体内相应的病损部位。传统技术下，对支架材料内部的细胞分布和密度难以精确控制。

三维打印(three-dimensionalprinting)技术，即快速成型技术，是一种以数字模型文件为基础，应用粉末状金属或塑料等可粘合材料，通过逐层打印的方式来构造物体的技术。随着材料的增多及打印机及原材料价格的降低，其打印速度快、高易用性等优势使其应用于多个领域，其中包括三维生物打印。三维生物打印是在快速成形技术发展的基础上，结合细胞生物学、计算机辅助设计(computeraideddesign，cad)和生物材料学等多个领域的研究成果，发展而来的一种新型的组织工程技术，其最终目标是实现器官打印。三维生物打印技术克服了传统组织工程技术的局限性，不但可构建形态、结构复杂的组织工程支架，而且可实现不同密度的种子细胞在不同支架材料中的三维精确定位，还可将细胞和打印基质混合，在计算机辅助下，按照预先设计的特定的三维结构，对活细胞、生物活性组织及相关生物材料等构成的共混合物直接进行逐层堆积。从而更精确的实现细胞的合理分布，做出更接近自然生长骨组织的人工骨组织。目前，国内外的研究中已经证明，将骨髓干细胞进行三维生物打印后，体外培养观察发现仍具有较高的活性以及分化能力。而用人脂肪间充质干细胞打印人体骨组织的方法所得到的骨组织在强度结构和网络结构还存在不合理性，打印体内部细胞难以形成营养供给的通道。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物，采用人脂肪间充质干细胞与海藻酸钠-明胶混合物作为微打印基质；材料具有可塑性并可通过温度和交联剂控制其交联过程，符合细胞共混物三维生物打印的低温打印过程的工艺要求和生物学要求。

本发明的另一个目的在于提供一种利用本发明所述的用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物三维生物打印人体骨组织的方法，按照预先设计的特定的三维结构，通过结合传统组织工程学支架结构，使打印物具有合理的强度结构和网络结构，使打印物内部细胞形成营养供给的通道。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物，其包含人脂肪间充质干细胞、海藻酸钠、明胶干粉以及作为溶剂的生理盐水的混合物。

作为进一步的方案，本发明所述的混合物中，海藻酸钠的浓度为15-25g/l，明胶的浓度为75-85g/l,人脂肪间充质干细胞密度为0.5×10⁶-2×10⁶个/ml。

作为进一步的方案，本发明所述的混合物中海藻酸钠的浓度为20g/l，明胶的浓度为80g/l,人脂肪间充质干细胞密度为1×10⁶个/ml。

作为进一步的方案，本发明所述的人脂肪间充质干细胞是将购买的人脂肪间充质干细胞中加入增值培养基进行传代培养后收集的第四代种子细胞。

作为进一步的方案，本发明所述的增殖培养基为dmem+10%胎牛血清+1%青、链霉素。

一种利用本发明所述的用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物三维生物打印人体骨组织的方法，该方法包括：

传代培养：将人脂肪间充质干细胞置于增值培养基中进行传代培养；

制备人脂肪间充质干细胞共混物：将海藻酸钠与明胶干粉分别用生理盐水溶解，混合后制成混合溶胶，上述传代培养后的第四代人脂肪间充质干细胞加入到混合溶胶中，搅拌均匀后得到人脂肪间充质干细胞共混物；

设计打印物形状：参照传统组织工程学支架结构将打印体设计为多孔网络结构；

三维打印成型：将上述人脂肪间充质干细胞共混物置于三维生物打印机的料盒中，打印成预先设计好的结构，得到打印成型的组织结构；

交联处理：将上述打印成型的组织结构用cacl2和kcl2的混合溶液对其进行交联，得到打印人体骨组织。

作为进一步的方案，本发明所述的方法还包括对传代培养后的第四代人脂肪间充质干细胞成骨分化能力的鉴定：待第四代人脂肪间充质干细胞生长至70%-80%汇合后接种至六孔板，加入成骨培养基，成骨诱导7天后，进行碱性磷酸酶染色，以细胞胞质呈现蓝紫色判断为阳性；成骨诱导14天后，进行茜素红矿化结节染色，pbs冲洗细胞三次，体积分数为95%冰乙醇固定30分钟；蒸馏水冲洗3次，每孔加1ml茜素红染液，常温放置，染色20-30分钟；染色结束后洗去染液，蒸馏水冲洗，以细胞间质出现红染结节判断为阳性。

作为进一步的方案，本发明所述的成骨培养基为dmem+10%胎牛血清+1青、链霉素+10mmol/lβ-磷酸甘油+200mmol/l抗坏血酸+100nmol地塞米松。

作为进一步的方案，本发明所述的制备人脂肪间充质干细胞共混物具体步骤为：将购买的人脂肪间充质干细胞加入增值培养基中，置于体积分数5%的co2、37℃细胞培养箱培养至6-8天，细胞生长至70%-80%汇合状态后，进行细胞传代，每个培养皿中的细胞依次经过胰酶消化、中和、离心和重悬后，接种至3个培养皿中，6-7天汇合度达到80%-90%后，再次进行传代；传代两次后的标记为p4，作为种子细胞待用。

作为进一步的方案，本发明所述的三维打印成型过程中，具体参数如下：打印温度15℃，打印喷头直径250μm，打印微丝直径200μm，微丝中心间距400μm；打印时打印喷头运动，将喷出的共混合物拉成丝状，沉积到载有无菌细胞培养皿的平台上，逐层完成打印。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

1.本发明所述的用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物，采用人脂肪间充质干细胞与海藻酸钠-明胶混合物作为微打印基质；材料具有可塑性并可通过温度和交联剂控制其交联过程，符合细胞共混物三维生物打印的低温打印过程的工艺要求和生物学要求；

2.本发明所述的利用本发明所述的用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物三维生物打印人体骨组织的方法参照传统组织工程学支架结构，将人脂肪间充质干细胞共混物打印体设计为多孔网格结构，既可以保证打印物有一定的结构强度，网格结构本身的空隙大小，又可保证打印体内部细胞有营养供给的通道。

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1是本发明所述的人脂肪间充质干细胞共混物打印体的显微镜图；其中箭头所指为细胞；

图2是本发明所述的人脂肪间充质干细胞共混物成骨诱导7天后碱性磷酸酶染色结果图；

图3是本发明所述的人脂肪间充质干细胞共混物成骨诱导14天后茜素红染色结果图；

图4是人脂肪间充质干细胞共混物打印体细胞活性双荧光染色结果；

图5是实施例4的人脂肪间充质干细胞共混物打印体和对比实施例1的打印体植入6周后取出大体观察图；其中a为对比实施例1的打印体，b为实施例4的人脂肪间充质干细胞共混物打印体；

图6是实施例4的人脂肪间充质干细胞共混物打印体的microct检测结果图；

图7是实施例4的人脂肪间充质干细胞共混物打印体的he染色结果，a是放大20倍的结果图，b是放大40倍的结果图；

图8是实施例4的人脂肪间充质干细胞共混物打印体的马松三色法染色结果图，a是放大20倍的结果图，b是放大40倍的结果图；

图9是实施例4的人脂肪间充质干细胞共混物打印体的骨钙蛋白免疫组织化学染色结果图；a是放大20倍的结果图，b是放大40倍的结果图。

具体实施方式

本发明所述的用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物，其包含人脂肪间充质干细胞、海藻酸钠、明胶干粉以及作为溶剂的生理盐水的混合物。

本发明中采用海藻酸钠-明胶混合物微打印基质，此类凝胶类材料具有可塑性，可通过挤压方式成型，并可通过温度和交联剂控制其交联过程，符合细胞共混物三维生物打印的低温打印过程的工艺要求和生物学要求。

作为进一步的方案，本发明所述的混合物中，海藻酸钠的浓度为15-25g/l，明胶的浓度为75-85g/l,人脂肪间充质干细胞密度为0.5×10⁶-2×10⁶个/ml。

作为进一步的方案，本发明所述的混合物中海藻酸钠的浓度为20g/l，明胶的浓度为80g/l,人脂肪间充质干细胞密度为1×10⁶个/ml。

作为进一步的方案，本发明所述的人脂肪间充质干细胞是将购买的人脂肪间充质干细胞中加入增值培养基进行传代培养后收集的第四代种子细胞。

作为进一步的方案，本发明所述的增殖培养基为dmem+10%胎牛血清+1%青、链霉素。

一种利用本发明所述的用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物三维生物打印人体骨组织的方法，该方法包括：

传代培养：将人脂肪间充质干细胞置于增值培养基中进行传代培养；

制备人脂肪间充质干细胞共混物：将海藻酸钠与明胶干粉分别用生理盐水溶解，混合后制成混合溶胶，上述传代培养后的第四代人脂肪间充质干细胞加入到混合溶胶中，搅拌均匀后得到人脂肪间充质干细胞共混物；

设计打印物形状：参照传统组织工程学支架结构将打印体设计为多孔网络结构；可以保证打印物有一定的结构强度，网格结构本身的空隙大小，又可保证打印体内部细胞有营养供给的通道；

三维打印成型：将上述人脂肪间充质干细胞共混物置于三维生物打印机的料盒中，打印成预先设计好的结构，得到打印成型的组织结构；

交联处理：将上述打印成型的组织结构用cacl2和kcl2的混合溶液对其进行交联，得到打印人体骨组织。

作为进一步的方案，本发明所述的方法还包括对传代培养后的第四代人脂肪间充质干细胞成骨分化能力的鉴定：待第四代人脂肪间充质干细胞生长至70%-80%汇合后接种至六孔板，加入成骨培养基，成骨诱导7天后，进行碱性磷酸酶染色，以细胞胞质呈现蓝紫色判断为阳性；成骨诱导14天后，进行茜素红矿化结节染色，pbs冲洗细胞三次，体积分数为95%冰乙醇固定30分钟；蒸馏水冲洗3次，每孔加1ml茜素红染液，常温放置，染色20-30分钟；染色结束后洗去染液，蒸馏水冲洗，以细胞间质出现红染结节判断为阳性。

作为进一步的方案，本发明所述的成骨培养基为dmem+10%胎牛血清+1青、链霉素+10mmol/lβ-磷酸甘油+200mmol/l抗坏血酸+100nmol地塞米松。

作为进一步的方案，本发明所述的制备人脂肪间充质干细胞共混物具体步骤为：将购买的人脂肪间充质干细胞加入增值培养基中，置于体积分数5%的co2、37℃细胞培养箱培养至6-8天，细胞生长至70%-80%汇合状态后，进行细胞传代，每个培养皿中的细胞依次经过胰酶消化、中和、离心和重悬后，接种至3个培养皿中，6-7天汇合度达到80%-90%后，再次进行传代；传代两次后的标记为p4，作为种子细胞待用。

作为进一步的方案，本发明所述的三维打印成型过程中，具体参数如下：打印温度15℃，打印喷头直径250μm，打印微丝直径200μm，微丝中心间距400μm；打印时打印喷头运动，将喷出的共混合物拉成丝状，沉积到载有无菌细胞培养皿的平台上，逐层完成打印。

以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所用到的仪器和试剂如下；

主要仪器：bioplotter三维生物打印机够自得过envision公司，inveon微型ct(microct)及inveonacquisitionworkplace软件钩子得过siemens公司，激光共聚焦显微镜及imageproplus6.0软件够自得过carlzein公司；

主要试剂：dascs细胞株够自美国sciencell公司，海藻酸钠、明胶、无水cacl2、成骨诱导因子贝塔-磷酸甘油、抗坏血酸、地塞米松、茜素红、乙二胺四乙酸均购自美国sigma公司，杜尔伯科改良伊戈尔培养基、10%（体积分数）胎牛血清、1%（体积分数）细胞培养用青、链霉素混合液均购自美国gibco公司，钙黄素-am(calcein-am，cam)、碘化丙啶均购自日本dojindo公司，兔源osteocalcin抗体购自美国santacruzbiotechnology公司，抗兔荧光二抗、抗兔源荧光二抗购自美国cellsignalingtechnology公司，碱性磷酸酶染色试剂盒购自中国康为世纪公司，裸鼠购自中国维通利华公司。

实施例1

一种用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物，其包含人脂肪间充质干细胞、海藻酸钠、明胶干粉以及作为溶剂的生理盐水的混合物；其中海藻酸钠的浓度为15g/l，明胶的浓度为85g/l,人脂肪间充质干细胞密度为0.5×10⁶个/ml。

实施例2

一种用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物，其包含人脂肪间充质干细胞、海藻酸钠、明胶干粉以及作为溶剂的生理盐水的混合物；其中海藻酸钠的浓度为20g/l，明胶的浓度为80g/l,人脂肪间充质干细胞密度为1×10⁶个/ml。

实施例3

一种用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物，其包含人脂肪间充质干细胞、海藻酸钠、明胶干粉以及作为溶剂的生理盐水的混合物；其中海藻酸钠的浓度为25g/l，明胶的浓度为75g/l,人脂肪间充质干细胞密度为2×10⁶个/ml。

实施例4

利用本发明所述的用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物三维生物打印人体骨组织的方法，该方法包括

传代培养：将p2代dascs加入增值培养基，成分为dmem+10%胎牛血清+1%青、链霉素，置于5%（体积分数）co2，37℃细胞培养箱培养至7天左右，细胞生长至70%-80%汇合状态后，进行细胞传代，每个培养皿中的细胞经过胰酶消化、中和、离心和重悬后，接种至3个培养皿中，6-7天汇合度达到80%-90%后，再次进行传代；传代两次后的dascs标记为p4，作为实验所需种子细胞；

制备人脂肪间充质干细胞共混物：按照实施例2的配比用生理盐水分别溶解海藻酸钠、明胶干粉，配置20g/l海藻酸钠和80g/l明胶混合溶胶，收集前面培养的p4代dascs细胞离心，用培养基重悬，计数，确认细胞存货率大于90%后，浆细胞悬液与海藻酸钠-明胶水溶胶混合，轻柔搅拌，制备dascs细胞密度为1×10⁶个/ml的共混合物；

设计打印物形状：参照传统组织工程学支架结构将打印体设计为多孔网络结构；可以保证打印物有一定的结构强度，网格结构本身的空隙大小，又可保证打印体内部细胞有营养供给的通道；

三维打印成型：将上述共混物置于bioplotter三维生物打印机的料盒中，与打印喷头相连，设定主要打印参数如下：打印温度15℃，打印喷头直径250μm，打印微丝直径200μm，微丝中心间距400μm；打印设备配套软件系统根据上述设定参数自动生成打印结构，驱动打印喷头运动，将喷出的共混合物拉成丝状，沉积到载有无菌细胞培养皿的平台上，逐层完成打印；得到打印成型的组织结构；

交联处理：上述打印成型的组织结构用使用100mmkl/lcacl2和50mmol/lkcl2的混合溶液进行5分钟交联处理；得到人脂肪间充质干细胞共混物打印体，打印体在显微镜下的结构图参见图1。

对比实施例1

按照实施例4的方法和参数，仅采用海藻酸钠-明胶的作为打印基质作为与实施例4的对比实施例1。

效果检验

1.人脂肪间充质干细胞成骨分化能力鉴定

将p4代dascs生长至70%-80%汇合后接种至六孔板，加入成骨培养基，成分为dmem+10%胎牛血清+1青、链霉素+10mmol/l贝塔=磷酸甘油+200mmol/l抗坏血酸+100nmol地塞米松;成骨诱导7天后，进行碱性磷酸酶染色，染色后采用成品试剂盒，步骤按照商品说明书完成，以细胞胞质呈现蓝紫色判断为阳性（参见图2）；成骨诱导14天后，进行茜素红矿化结节染色，pbs冲洗细胞三次，95%（体积分数）冰乙醇固定30分钟；蒸馏水冲洗3次，每孔加1ml茜素红染液，常温放置，染色20到30分钟；染色结束后洗去染液，蒸馏水冲洗，以细胞间质出现红染结节判断为阳性（参见图3）。

2.共混合物三维生物打印得到的人脂肪间充质干细胞共混物打印体活性检测

将实施例4所得到的人脂肪间充质干细胞共混物打印体置于增殖培养基中，体外培养24小时，生理盐水漂洗3次，使用含5微摩尔每升cam和3微摩尔每升pi的生理盐水在细胞培养箱中孵育45分钟，生理盐水漂洗3次，使用激光共聚焦显微镜分别在488nm（cam激发波长）和543nm（pi激发波长）的激发光下观察打印体内细胞的活性，沿z轴每隔20微米对打印体进行拍照。每个打印体任意选取5个激光共聚焦扫描层面图像，用imageproplus6.0软件对图像中绿色、红色点的个数进行计数（红色光点代表死细胞，绿色光点代表活细胞），计算细胞成活率，细胞成活率=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。结果参见图4。

图4的结果表明：打印24小时后，激光共聚焦显微镜观察可见，dascs共混物打印体内细胞均匀分布，大部分细胞呈绿的荧光染色，少量死细胞染成红色；用imageproplus6。0软件对活细胞、死细胞进行计数后，计算出细胞存活率为89%±2%。

应用实施例1

分别将实施例4和对比实施例1的打印体植入裸鼠皮下，体植入六周后，可见裸鼠皮下植入区域呈现包状隆起；处死裸鼠后取材，可见实施例4的打印体基本保持原有大小，强度变大，韧性增强，除去表面软组织可见打印体中有血管长入；而对比实施例1的打印体呈白色团块不定形样，打印体部分降解，强度仍保持凝胶态，不能成形（参见图5）；microct观察可见，实验组打印体密度较高（附图6），新生骨体积为18%，而对照组打印体结构松散不定形，并且固定后发生吸水情况，进行microct检测时因其密度较低而无法正常显影。

应用实施例2

分别将实施例4和对比实施例1的打印体用he染色后植入裸鼠皮下，体植入六周后，取出，组织切片he（伊红染色法））染色，可见实施例4的打印体孔隙中出现粉染的新生骨基质，深染的基质材料则出现了部分的吸收（参见图7），对比实施例1的打印体中基质材料的染色与实验组类似，但无骨基质形成。

应用实施例3

分别将实施例4和对比实施例1的打印体马松三色法染色后植入裸鼠皮下，体植入六周后，组织切片马松三色法染色可见，实施例4的打印体孔隙中可见绿染的新生骨基质，深染微水凝胶材料（参见图8），对比实施例1的打印体中仅可见深染的水凝胶材料。

应用实施例4

分别将实施例4和对比实施例1的打印体采用免疫组织化学染色后植入裸鼠皮下，体植入六周后，取出，组织切片免疫组织化学染色可见，实施例4的打印体孔隙中的新生骨骨组织周围有深棕色染色的骨钙蛋白分布，显示有新生骨形成（参见图9）。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。